結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿結(jié)核分枝桿菌游離DNA檢測在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值

呂燕燕

【摘要】 目的 分析結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿結(jié)核分枝桿菌游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測肺結(jié)核的效能。方法 選取2019年1月—2022年6月都昌縣第二人民醫(yī)院診治的80例疑似肺結(jié)核患者，對所有患者施以結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)、血漿MTB-cfDNA檢測，以痰結(jié)核分歧桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，統(tǒng)計(jì)對比不同檢查方法在肺結(jié)核中的診斷效能。結(jié)果 80例疑似肺結(jié)核患者經(jīng)痰MTB培養(yǎng)檢查，共檢出73例肺結(jié)核，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測，共檢出70例，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測肺結(jié)核的檢出靈敏度、準(zhǔn)確度分別為94.52%、93.75%，高于結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)的82.19%、81.25%，高于血漿MTB-cfDNA檢測的69.86%、71.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Kappa檢驗(yàn)顯示，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測結(jié)果的一致性較為理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。結(jié)論 結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結(jié)核的診斷中效果顯著，具有較高的疾病檢出精準(zhǔn)度，可為臨床提供可靠的參考信息，臨床應(yīng)用價(jià)值較高，值得大力推行。

【關(guān)鍵詞】 肺結(jié)核；結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)；診斷效能；靈敏度；準(zhǔn)確度

文章編號：1672-1721（2024）16-0067-03? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R446

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分歧桿菌（MTB）感染而誘發(fā)的呼吸系統(tǒng)傳染病，臨床發(fā)生率處于較高水平。肺結(jié)核病灶主要在肺組織、器官、支氣管與胸膜處。在我國傳染類疾病中，肺結(jié)核發(fā)病與死亡數(shù)均高居第2位，對群眾身心健康造成威脅[1-2]。近些年，由于人們生活方式轉(zhuǎn)變，該病患病率呈逐年上升趨勢[3-4]。早期及時(shí)診斷肺結(jié)核，并指導(dǎo)臨床施行針對性的治療措施，對于保障患者身心健康和改善其預(yù)后至關(guān)重要。既往臨床多采用痰MTB培養(yǎng)對肺結(jié)核行診斷，但該方法檢測耗費(fèi)時(shí)間較長，不適合大范圍開展早期篩查[5-6]。探索一種更為快速、有效的診斷措施成為臨床研究的重點(diǎn)。近些年，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)、血漿結(jié)核分枝桿菌游離DNA（cfDNA）等檢測手段在肺結(jié)核的檢查中廣泛使用，取得了一定效果，但臨床關(guān)于兩者聯(lián)合診斷肺結(jié)核的報(bào)道較為缺乏?；诖?，本研究以80例疑似肺結(jié)核患者為研究對象，分析結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結(jié)核中的鑒別效果，為臨床早診斷、早治療提供可靠的參考依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2022年6月都昌縣第二人民醫(yī)院診治的80例疑似肺結(jié)核患者為研究對象?；颊咧心行?3例，女性37例；年齡35～78歲，平均年齡（60.53±2.48）歲；基礎(chǔ)疾病，23例冠心病，26例糖尿病，18例高血壓；體質(zhì)量指數(shù)18.3～27.1 kg/m2，平均體質(zhì)量指數(shù)（25.26±0.49）kg/m2。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：伴有咳嗽、咳痰持續(xù)2周以上；患者具有較高的依從性；患者對本試驗(yàn)知悉，且自愿簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在惡性腫瘤者；意識障礙，難以正常交流者；合并精神疾病者；存有全身性感染者；合并免疫系統(tǒng)、凝血功能異常者；存在嚴(yán)重的腦器質(zhì)性疾病者；存有嚴(yán)重的臟器損傷者；合并酒精、藥物依賴史者；存在血液系統(tǒng)疾病者；伴有嚴(yán)重心力衰竭者。

1.2 方法

標(biāo)本采集。患者入院后，于次日清晨采集全部患者的晨起空腹10 mL靜脈血，置于無菌試管內(nèi)，留存待檢，分別用于血漿MTB-cfDNA檢測與結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)。在標(biāo)本采集時(shí)，需嚴(yán)格遵照無菌操作原則。

血漿MTB-cfDNA檢測。5 mL血液標(biāo)本經(jīng)3 000 r/min離心處理10 min獲取上層清液，采集2 mL上層清液轉(zhuǎn)換至新離心管后；用12 000 r/min離心處理10 min，采集2 mL上清液到新試管中；行MTB的cfDNA提取，提取后再留存待檢；以熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）開展測定，反應(yīng)序列為95 ℃ 2 min預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s擴(kuò)增反應(yīng)，60 ℃下進(jìn)行熒光信號收集，共反復(fù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，50 ℃ 30s冷卻；獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后經(jīng)由3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進(jìn)行核酸序列測定。

結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)。將采集的血樣經(jīng)肝素抗凝后取5 mL放入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)過離心處理之后對外周血單個(gè)單核細(xì)胞予以分離，以細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，培養(yǎng)板每組條孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基（50 μL）作為空白對照，植物血凝素（50 μL）作為陽性對照，刺激源為MTB特異性ESAT-6（50 μL）、LCEF-10抗原（50 μL）；之后于每孔分別加入LPBMC懸液（100 μL）；以上操作完畢后把培養(yǎng)板放在37 ℃條件下培養(yǎng)16～20 h，培養(yǎng)完畢后經(jīng)蒸餾水對培養(yǎng)板進(jìn)行洗滌，加入二抗體并在2～80 ℃環(huán)境下孵育1 h；孵育完畢后對培養(yǎng)板再次洗滌并加入50 μL顯色液，在室溫下放置7 min后洗滌，待干燥后計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。

血漿MTB-cfDNA檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)。紫外燈下檢查，在254 bp有清晰的擴(kuò)增條帶，則判定為結(jié)核桿菌DNA陽性。

結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)。陰性對照斑點(diǎn)數(shù)>5，抗原A、B斑點(diǎn)與陰性對照組斑點(diǎn)數(shù)相比處于更高水平，超出陰性對照組斑點(diǎn)數(shù)的2倍。

所有的檢測操作均由醫(yī)院2名高年資的檢驗(yàn)師醫(yī)師共同檢測，討論得出最終檢出結(jié)果，以保障檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較不同檢查方法檢查肺結(jié)核的診斷效能。以痰MTB培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，統(tǒng)計(jì)對比結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)、血漿MTB-cfDNA檢測、結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測肺結(jié)核的檢出情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；一致性采用Kappa檢驗(yàn)（Kappa值>0.75提示一致性極好，Kappa值為0.40～0.75提示一致性較為理想，Kappa值<0.40提示一致性差）；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

80例疑似肺結(jié)核患者，經(jīng)痰MTB培養(yǎng)檢查共檢出73例肺結(jié)核，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測共檢出70例，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例，見表1。

結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測肺結(jié)核的檢出靈敏度、準(zhǔn)確度高于結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)、血漿MTB-cfDNA檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3種檢查方法的特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

Kappa檢驗(yàn)顯示，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-

cfDNA檢測結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測結(jié)果的一致性較為理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。

3 討論

肺結(jié)核具有較高的患病率，是威脅人類健康的傳染性疾病。糖尿病患者、塵肺患者、免疫抑制劑使用者等均為肺結(jié)核的易感人群。肺結(jié)核主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫傳播。當(dāng)肺結(jié)核患者咳嗽、打噴嚏、大笑與唱歌時(shí)，可將含有MTB的微滴從呼吸道播散到空氣中并停留數(shù)小時(shí)，若被他人吸收將會(huì)引起感染。肺結(jié)核活動(dòng)性感染者在1年內(nèi)可引起超過20例新發(fā)感染，傳染性極強(qiáng)，而20%的感染患者患病早期癥狀缺乏特異性[7-8]?；颊咴诨疾〕跗跓o明顯特征，診斷比較困難，誤診率較高，易錯(cuò)過最優(yōu)良的治療時(shí)機(jī)，加重傳染現(xiàn)象，增加社會(huì)壓力[9]。因此，對肺結(jié)核做到早診斷、早治療至關(guān)重要。

痰MTB培養(yǎng)為目前臨床診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，

但藥敏試驗(yàn)耗時(shí)較長，得到準(zhǔn)確結(jié)果至少需4周，且操作較為復(fù)雜，重復(fù)性差，在實(shí)際應(yīng)用中受限[10]，需尋求更為快速有效的診斷措施。cfDNA屬于一類廣泛存在于生物體液中無細(xì)胞形態(tài)的胞外DNA片段，此游離DNA片段的測定目前已在產(chǎn)婦的產(chǎn)前診斷與腫瘤等病癥的鑒別診斷內(nèi)取得顯著成效。因PCR技術(shù)問世，血漿MTB-cfDNA被大范圍使用，尤其是熒光定量PCR在臨床推行，能夠以體外擴(kuò)增法測定血漿MTB內(nèi)存有的cfDNA，從而迅速、精準(zhǔn)測定MTB，早期診斷出肺結(jié)核。如果實(shí)驗(yàn)室中血液收集、保存和運(yùn)送等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定的cfDNA出現(xiàn)降解，而被降解的DNA分泌同樣會(huì)對檢測結(jié)果構(gòu)成較多干擾，導(dǎo)致血漿MTB-cfDNA檢測存在一定的漏診、誤診風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)原理，由單細(xì)胞水平對細(xì)胞因子開展測定，為細(xì)胞免疫學(xué)措施之一?；颊吒腥窘Y(jié)核后，機(jī)體中會(huì)長時(shí)間存在抗原特異性的記憶性T細(xì)胞。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)依照此類淋巴細(xì)胞遭受刺激釋放的干擾素對感染進(jìn)行判斷，故具有較高的靈敏度。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)具有檢測標(biāo)本易于獲取的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中較為便捷。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)不受病例排菌類別、排菌量與是否排菌等因素的干擾，能夠明顯減少肺結(jié)核漏診的情況[11-12]。需注意的是，細(xì)胞環(huán)境、機(jī)體內(nèi)環(huán)境等因素均可能對該方法檢測結(jié)果造成一定的影響，故臨床多考慮行聯(lián)合檢測。本研究結(jié)果顯示，80例疑似肺結(jié)核患者中，經(jīng)痰MTB培養(yǎng)檢查共檢出73例，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測共檢出70例，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測肺結(jié)核的檢出靈敏度、準(zhǔn)確度分別為94.52%、93.75%，高于結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)的82.19%、81.25%，高于血漿MTB-cfDNA檢測的69.86%、71.25%。Kappa檢驗(yàn)顯示，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測結(jié)果的一致性較為理想。上述研究結(jié)果表明，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測肺結(jié)核具有較高的診斷效能，可提高疾病的早期檢出精準(zhǔn)率。聯(lián)合檢測可起到優(yōu)勢互補(bǔ)功效，從不同層面對疑似肺結(jié)核患者機(jī)體內(nèi)MTB檢測，可最大程度減少漏診、誤診情況發(fā)生。

綜上所述，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結(jié)核診斷中效能顯著，具有較高的檢出準(zhǔn)確度，臨床應(yīng)用價(jià)值較高，值得大力推行。各醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)室可在自身?xiàng)l件允許的情況下，積極行結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)與血漿MTB-cfDNA聯(lián)合檢測，提高疾病檢出精準(zhǔn)性，為臨床提供更多的參考，進(jìn)而施行更規(guī)范且個(gè)體化的治療措施，保障患者獲得優(yōu)良的預(yù)后。

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