血清TMAO水平對心房顫動病人心房肌纖維化的影響

朱浩然 耿金 孟思雨 葛培兵 倪天祎 張清 王丙劍

摘要 目的： 觀察血清氧化三甲胺（TMAO）水平對心房顫動病人心房肌纖維化的影響。 方法： 入組31例瓣膜病病人，其中心房顫動組（AF組）16例和竇性心律組（SR組）15例；收集入組病人的人口學資料、相關實驗室檢查及心臟超聲等資料。使用液相色譜法測定血清TMAO水平并比較兩組間差異；馬松染色分析兩組心房肌組織纖維化差異；蛋白免疫印跡法（Western Blot）測定病人心房肌組織抗平滑肌抗體（aSMA）蛋白含量。對TMAO水平與aSMA含量及左房內徑（LAD）進行線性相關分析。 結果： 與SR組比較，AF組LAD、血清TMAO水平及aSMA增高，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。血清TMAO水平與LAD、aSMA含量均呈正相關（ r 值分別為0.409，0.633， P ＜0.05）。 結論： 心房顫動病人血清TMAO水平明顯升高，伴隨著心房膠原纖維沉積和LAD擴大，提示TMAO可能在促進心房顫動發展過程中對心房肌纖維化產生作用。

關鍵詞 ?心房顫動；氧化三甲胺；心房肌纖維化；左房內徑

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.028

近年來，隨著老齡化問題的加重及心血管疾病的增多，心房顫動發病率日益升高，心房顫動可能增加腦卒中、血栓栓塞、心力衰竭及心肌梗死等疾病風險，嚴重影響病人的生活質量，甚至危及生命 ?［1.2］ 。因此，及時發現并治療心房顫動顯得尤為重要。目前認為在心房顫動發生發展過程中，伴隨心房原有電活動及結構特征性改變，早期主要表現為電重構，心肌纖維化導致的結構重構是心房顫動晚期主要的病理改變 ?［3.4］ 。急性心肌損傷及伴隨的肥胖、糖尿病等代謝紊亂均可加快心肌纖維化的進程，且多種炎性因子參與的炎癥反應也是心肌纖維化的重要誘發因素，加速心臟重構，促進心房顫動的維持與進展 ?［3，5］ 。氧化三甲胺（trimethylamine N.oxide，TMAO）是含磷脂酰膽堿、膽堿的化合物，經腸道菌群代謝吸收后在肝臟內氧化的產物，在動脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌梗死等諸多心血管疾病的發生發展中發揮著重要作用。相關研究表明，在心肌肥大及缺血再灌注的小鼠模型中，血清TMAO含量與心肌纖維化相關，下調TMAO可顯著抑制心肌纖維化，緩解疾病進展 ?［6.8］ 。心房顫動涉及心房肌纖維化，TMAO與心房顫動及心房纖維化關系的研究較少。本研究觀察血清TMAO水平對心房顫動病人心房肌纖維化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—7月于淮安市第一人民醫院行瓣膜置換手術的心臟病病人31例。根據是否合并心房顫動及發病的持續時間分為持續性心房顫動組（AF組，16例）和竇性心律組（SR組，15例）。AF組入選心房顫動持續發作＞7 d，通過藥物或電復律中止發作的病人；SR組入選無心房顫動史，心電圖檢查為竇性心律的病人。納入標準：心臟彩超明確診斷為瓣膜性心臟病；紐約心臟病協會（NYHA）心功能分級Ⅱ級或Ⅲ級；年齡18～80歲。排除標準：急性左心衰竭、心功能Ⅳ級；重癥感染和活動性風濕熱；甲狀腺功能紊亂；嚴重腎功能不全；病態竇房結綜合征或其他需要起搏器治療的疾病；陣發性心房顫動等。本研究符合淮安市第一人民醫院倫理委員會制訂的倫理學標準并被批準（批準文號：KY.2022.125.01），且所有病人均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

所有病人均在心臟外科行瓣膜置換或修復手術，入院當天抽取全血檢測TMAO。手術過程中，探查左心耳心肌組織，在左心耳適當部位留取少許左心房標本。將馬松染色的心房組織固定于4%多聚甲醛中，其余組織保存在液氮中，－80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡法（Western Blot）。

1.3 研究方法

收集病人的人口學資料、臨床資料及住院期間用藥情況；記錄病人當天血肌酐（Cr）和總膽固醇（TC）水平；所有病人在入院3 d內完成超聲心動圖檢查，記錄左室舒張末期內徑（LVEDD）、左房內徑（LAD）和左室射血分數（LVEF）。

1.4 液相色譜法

所有病人均在清晨、 空腹、清醒時抽取肘靜脈血3～ ?5 mL置于干燥管中，全血在4 ℃條件下，以2 500 r/min 離心10 min，所得血清約500 μL，采用高效液相色譜串聯質譜法測定TMAO水平 ?［9］ 。先將TMAO.d9添加到血清樣品中，在m/z 85.68范圍內對其進行液相色譜.質譜（LC/MS）分析，之后在m/z 76.58范圍內對TMAO進行LC/MS分析，最后將TMAO和TMAO.d9加入對照樣品中，繪制TMAO定量分析的校準曲線。

1.5 馬松染色

馬松染色按照試劑盒（KGMST.8004，KeyGEN BioTech，China）說明書進行，石蠟切片脫水后以蒸餾水清洗，蘇木精染色5 min，充分水洗后以麗春紅染色液染色5 min，冰醋酸溶液和磷鉬酸溶液清洗后，以苯胺藍染色液染色5 min，脫水后封片。采用Image Pro Plus軟件分析膠原含量，評估其纖維化程度。

1.6 Western Blot試驗

使用RIPA（購自Beyotime公司）和苯甲基磺酰氟（PMSF，購自Beyotime公司）提取心肌組織中的蛋白，之后使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（購自Beyotime公司）定量分析蛋白濃度。在配好的膠中加入蛋白樣品后電泳，轉膜至聚偏乙烯膜（PVDF）上，用抗平滑肌抗體（aSMA）一抗（購自Proteintech公司，貨號：14395.1.AP，1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過夜，以二抗（購自Proteintech公司，貨號：SA00001.2，1∶7 500稀釋）孵育1 h后電化學發光（ECL）法顯影。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，購自Proteintech公司，貨號：10494.1.AP，1∶10 000稀釋）進行參照蛋白，采用Image J軟件定量分析蛋白含量。

1.7 統計學處理

所有數據采用SPSS 22.0（IBM SPSS，Armonk，NY）進行統計學分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，采用獨立樣本 ?t 檢驗；定性資料以例數、百分比（%）表示，采用 ?χ ?2檢驗或Fisher確切概率法。使用廣義線性模型確定TMAO、aSMA及LAD的相關性，使用線性回歸模型調整混雜因素。以 ?P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較

與SR組比較，AF組LAD、血清TMAO水平及aSMA增高， 差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.2 血清TMAO水平及心房肌纖維化程度

Western Blot法檢測心房肌組織的蛋白相對表達，可見纖維化標志物aSMA在AF組中高表達，詳見圖1。馬松染色顯示，AF組膠原明顯高于SR組，詳見圖2。線性相關分析結果顯示，TMAO水平與aSMA相對表達（ r ＝0.633， P ＜0.001）、LAD（ r ＝0.409， P ＝0.022）均呈正相關。詳見圖3。

2.3 不同LAD分層的血清TMAO水平、aSMA表達比較

為消除混雜因素的影響，對LAD進行了分層分析。AF組血清TMAO水平、aSMA表達均高于SR組（ P ＜0.05）。詳見表2。提示心房顫動病人TMAO水平上調及纖維化加重與LAD無關。

3 討 論

心房顫動的常見危險因素包括年齡、肥胖、高血壓、糖尿病及腎功能不全等 ?［10.11］ ，雖然對上述因素進行預防與篩查，但心房顫動發病率、致死率仍居高不下 ?［12.13］ 。持續性心房顫動導致心肌纖維化，發展為心房結構重構，從而使心房舒縮功能受損，心臟泵血功能減退甚至喪失，心力衰竭死亡常成為心房顫動病人的最終結局。因此，有效控制纖維化進程在治療心房顫動過程中至關重要。

TMAO是消化過程中腸道菌群產生的代謝產物，膽堿和肉毒堿作為TMAO前體物質在紅肉中含量很多，因此，長期攝入紅肉可使血漿TMAO水平升高 ?［14.15］ 。在腸道中，膽堿、肉毒堿和卵磷脂等代謝前體轉化為三甲胺（TMA），TMA穿過腸壁進入血液循環，在肝臟中由黃素單加氧酶（FMOs）氧化形成TMAO。目前認為，TMAO是心血管疾病中一種新型的危險因素。相關研究表明，相較于正常飲食的小鼠，高TMAO飲食的小鼠動脈粥樣硬化及心臟纖維化進展加劇 ?［6，16］ ；停止攝入TMAO或抑制TMAO生成，可緩解心肌纖維化，改善心臟重構 ?［17.18］ 。心房纖維化是心房顫動重要的病理改變，有研究以快速心房起搏構建犬心房顫動模型，之后將TMAO注入心臟自主神經結中，結果顯示，心房顫動發生率升高，神經節活性增強，心房重構因子（NGF）表達升高，且血清炎性因子上調 ?［19］ 。提示TMAO可能參與心房顫動的發生發展，促進心房肌纖維化進程。

本研究選取心房顫動及竇性心律的瓣膜病病人31例，結果顯示，心房顫動病人血清TMAO水平較竇性心律病人明顯升高，且TMAO水平與LAD呈正相關。左心房擴大與心房顫動互為因果，一方面心房顫動發病后，晚期導致心肌膠原纖維沉積、心房結構重構；另一方面，左房擴大可促進血栓形成、心房顫動復發。因此，LAD可能提示心房顫動的嚴重程度。血清TMAO水平與LAD存在相關性，TMAO可能是預測心房顫動發生與疾病嚴重程度的生物標志物。由于兩組LAD比較差異有統計學意義，因此進行分層分析以校正其對結果的影響，結果顯示，心房顫動導致的TMAO上調及纖維化進展不受LAD的影響。本研究將術中獲取的左心耳組織進行Western Blot試驗和馬松染色，結果顯示，AF組心房肌組織纖維化程度高于SR組，且血清TMAO水平與左房aSMA表達呈正相關。上述研究結果表明TMAO可能與心房肌的纖維化有關，參與了心房顫動的維持與進展。

TMAO促進心房顫動發生發展的機制有以下幾方面：1）TMAO與心房顫動的危險因素有關，如肥胖、糖尿病導致的代謝紊亂及心血管急癥等 ?［20.22］ ；2）TMAO使心房自主神經節活性增高，誘使心房電生理紊亂 ?［19，23］ ；3）TMAO通過激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體、促進氧化應激、激活多種促炎信號通路等途徑，促進機體炎癥反應，從而導致心房結構重構 ?［6，8，24］ 。

綜上所述，心房顫動病人血清TMAO水平升高，并伴隨心房膠原纖維沉積和LAD的擴大，即心房結構重構，表明TMAO可能在促進心房顫動病人心房肌纖維化過程中發揮著關鍵作用。基礎實驗和臨床研究仍缺乏具體證據解釋TMAO促進心房顫動病人心房肌纖維化的潛在機制。需進一步研究證實本研究結果， 以期為調整腸內代謝進而延緩心房顫動進展提供 依據。

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（收稿日期：2023.03.23）

（本文編輯 薛妮）