黎藥彎柄靈芝質量標準初步研究

王升勇　潘章超　邢英華　王勇

【摘 要】 目的：初步建立黎藥彎柄靈芝的質量標準。方法：對彎柄靈芝藥材的性狀進行鑒定，對其顯微特征進行鑒別；參照《中國藥典》2020年版方法，采用薄層色譜法（TLC）對藥材進行定性鑒別，采用分光光度法測定藥材中的多糖和三萜及甾醇含量。結果：明確了彎柄靈芝的性狀及顯微特征，建立了專屬的TLC定性鑒別法；初步規定了彎柄靈芝多糖含量不得低于0.80%，三萜及甾醇含量不得低于0.90%。結論：本研究建立的彎柄靈芝藥材質量標準可為其質量控制及資源可持續利用提供依據。

【關鍵詞】 黎藥；彎柄靈芝；質量標準；顯微鑒別；薄層色譜

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）10-0050-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.10.zgmzmjyyzz202410011

A Preliminary Study on the Quality Control of Ganoderma flexipes

WANG Shengyong1 PAN Zhangchao2 XING Yinghua1 WANG Yong2*

1. Hainan Health Vocational College， Haikou 570311， China;

2. School of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou 571199，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Ganoderma flexipes.Methods The macroscopic and microscopic characteristics of Ganoderma flexipeswere identified.The qualitative identification of the medicinal materials was performed by thin layer chromatography （TLC）. The contents of polysaccharides， triterpenoids and sterols in the samples were determined according to the method of Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）.Results This study clarified the characteristics and microscopic characteristics of Ganoderma flexipes， and established an exclusive TLC qualitative identification method.The content of polysaccharide in the samples should not be less than 0.80%， and the content of triterpene and sterol should not be less than 0.90%.Conclusion These results provide a reference for establishing a standard quality system， resource development and utilization for Ganoderma flexipes.

Key words：Li Medicine; Ganoderma flexipes;Quality Standard; Microscopical Identification; Thin Layer Chromatography （TLC）

靈芝屬真菌Ganoderma P.Karst.隸屬擔子菌門Basidiomycota、蘑菇綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、靈芝科Ganodermataceae，是一類大型可食用真菌［1］。靈芝被認為是一種藥用菌已有2000多年的歷史，始載于東漢時期的《神農本草經》，被認為是滋補強壯、扶正固本的珍貴中藥，列為上品［2］。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）規定，靈芝為多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum （Leyss．exFr．）Karst.或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥子實體［3］。靈芝含有約400種不同的生物活性化合物，主要包括三萜、多糖、核苷酸、甾醇、類固醇、脂肪酸和蛋白質等［4-5］。現代藥理研究［6-14］表明，靈芝具有抗腫瘤、抗氧化劑、抗菌、抗癌、免疫調節、抗炎、降血糖等作用，因此在醫藥、保健等領域具有廣泛的應用前景。

彎柄靈芝（Ganoderma flexipes）為靈芝屬真菌，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南、云南西雙版納、福建等地，是熱帶雨林區域的主要靈芝品種之一，是海南稀有的、特色的、優質的、廣泛使用的藥用真菌資源［15］。在黎族地區應用較多，但目前對彎柄靈芝的研究較少。已有的研究主要是針對彎柄靈芝的多糖、三萜等化學成分以及資源分布等情況。研究［15］發現，彎柄靈芝中含有大量的有效成分，且相對含量優于常規赤芝。對彎柄靈芝的三萜成分研究發現靈芝酮A （ganoderone A）和靈芝醇B （ganoderol B）的含量占三萜分離量的80%以上。陳德力等［15］采用加速溶劑提取工藝提取了彎柄靈芝中的總三萜，所得總三萜對DPPH自由基的IC50值為273.4 μg/mL，結果表明有較強自由基清除作用。另有研究［16］對一株野生的彎柄靈芝進行了鑒定，分別采用水提醇沉法和乙醇提取法獲得了多糖和三萜，兩者含量分別為23.70 mg/g和9.67 mg/g。多糖和三萜被認為是靈芝中起主要藥理作用的兩類化合物。目前，尚未發現關于彎柄靈芝藥材及這兩類化合物質量標準方面的研究報道，且現行《中國藥典》也未收載彎柄靈芝。

為控制彎柄靈芝藥材的質量，本研究通過藥材性狀、顯微特征、薄層色譜鑒別、多糖含量、三萜與甾醇含量等質量指標進行了研究，為其質量控制及資源開發利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 3批彎柄靈芝先后采自海南省五指山市，經海南醫學院藥學院曾念開教授鑒定為靈芝科靈芝屬真菌Ganoderma flexipes 的干燥子實體；石油醚（60～90℃，西隴科學股份有限公司，批號：B2212191）；乙酸乙酯（廣西光華科技股份有限公司，批號：20200327）；甲酸（洛陽市化學試劑廠，批號：15896-1995）；齊墩果酸（中國藥品生物制品鑒定所，批號：110709-200304）；香草醛（廣州化學試劑廠，批號：020901-3）；彎柄靈芝對照藥材（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：ycwkq23041407）；氫氧化鉀、高氯酸；苯酚、硫酸、高氯酸、甲醇、乙醇（分析純，西隴科學股份有限公司）。

1.2 儀器與設備 HH-4數顯恒溫水浴鍋（金壇市億能實驗儀器廠）；PX224ZH/E電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；ZF-20D暗箱式紫外分析儀（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）；JASCO V-650紫外分光光度計［佳司科（上海）貿易有限公司］；CKK53倒置生物顯微鏡［奧林巴斯工業有限公司（廣州）］；LYSF-200-B超高速多功能粉碎機（長沙市卓成醫療器械有限公司）。

2 方法

2.1 性狀鑒別 參照2020版《中國藥典》 （四部）通則0212項下的檢定方法對彎柄靈芝的形狀、大小、表面色澤和特征、質地、斷面及氣味進行觀察和描述。

2.2 顯微鑒別 取彎柄靈芝粉末少許置于載玻片上，滴加5%氫氧化鉀透化，加蓋玻片，置于生物顯微鏡下觀察彎柄靈芝菌絲結構并拍照記錄。取彎柄靈芝菌蓋粉末，同法操作，觀察孢子結構并拍照記錄。

2.3 薄層色譜鑒別 參照2020版《中國藥典》（一部）［3］靈芝項下的“鑒別”，并對方法進行調整。分別稱取3批彎柄靈芝粉末2 g，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。取彎柄靈芝對照藥材0.5 g，等比例加如適當溶劑，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）展開，取岀，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。

2.4 多糖含量測定 參照2020版《中國藥典》（一部）［3］靈芝含量測定項下“多糖”方法制備對照品溶液：精密稱定葡萄糖對照品0.012 g，加水定容至10 mL，制成每1 mL含0.12 mg 的溶液，即得多糖對照品溶液。

標準曲線的建立：采用李靖［18］的方法并稍作修改。精密量取對照品溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分別置 10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，加5%苯酚試液1 mL，迅速加入5 mL濃硫酸，振蕩混勻靜置10 min，再于100℃水浴加熱15 min，在冰水浴中迅速冷卻至室溫，取出，以相應的試劑為空白，在 490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量為橫坐標，繪制標準曲線。供試品溶液的制備，參照2020版《中國藥典》（一部）［3］。

多糖含量測定：精密移取供試品溶液2 mL，自“加苯酚試液1 mL”，同法操作，在 490 nm 波長處測定吸光度，平行實驗3次以減小誤差。將測得的吸光度值代入標準曲線即可求得。

2.5 三萜及甾醇測定方法 參考參照《中國藥典》2020 版（一部）靈芝含量測定測定項下“三萜與甾醇”，采用香草醛－冰醋酸法測定三萜含量［3］。

3 結果與分析

3.1 性狀鑒別 菌蓋近圓形、半圓形或腎形，1.2～3.7cm×1.0～2.1 cm，厚0.2～1.1 cm，表面有光澤，呈紅褐色，條紋明顯，呈放射狀，有顯著的同心環溝，不平整；菌柄彎曲不規則，長7.5～20.9 cm，直徑0.2～0.9 cm，呈紅褐色至紫黑色，上部無褶皺表面光滑，底部粗糙；質地堅硬，不易折斷；菌肉呈深木材色到淡褐色，無明顯分層，厚0.2～0.5 cm；有明顯的類似靈芝樣的木質清香味。如圖1所示。

3.2 顯微鑒別 彎柄靈芝粉末呈淺棕色、棕褐色；菌絲散在或粘結呈團狀，無色至淺白色，細長，不規則彎曲，分支較少；可見少量孢子，呈橢圓形，分散不均，6.3～9.1 μm×6.3～8.1 μm。如圖2所示。

3.3 薄層色譜鑒別 如圖3所示，在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置，在365 nm紫外燈下顯示相同顏色的熒光斑點。

3.4 多糖含量測定 以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，擬合曲線為Y=8.1226X + 0.0195，R2=0.9997。3批彎柄靈芝多糖含量測定結果見表1。3批彎柄靈芝多糖平均含量為1.02%，第三批的含量最高，其次是第一批，含量最低的是第二批，但三批彎柄靈芝多糖含量相差不大，質量分數范圍為0.97%～1.08%。

3.5 三萜及甾醇含量測定 采用香草醛—冰醋酸法繪制的標準曲線為Y=73.525X－0.0781，R2=0.9994。3批彎柄靈芝三萜及甾醇含量測定結果見表1。質量分數范圍為1.25%～1.31%，其中，第二批含量最高（1.31%），三批樣品中三萜及甾醇平均含量為1.23%。

4 討論

4.1 TLC法的建立 2020版《中國藥典》收載了靈芝的薄層色譜法，但在實驗過程中發現采用該方法中的色譜條件，彎柄靈芝斑點分離效果較差且存在拖尾現象。因此調整了展開劑及其比例。在實驗中，使用乙酸乙酯代替甲酸乙酯后，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果斑點分離效果更好。為了獲得更好的分離效果，通過調整展開劑比例后，發現熒光斑點顯綠色、斑點清晰易見、分離效果及重現性均較好。因此，最終確定展開劑為石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）。

4.2 多糖和三萜及甾醇限度確定 考察了三批彎柄靈芝中多糖和三萜及甾醇含量。多糖和三萜均為靈芝的主要活性成分，因此確定兩者的限度對彎柄靈芝藥材的質量控制至關重要。

參照2020版《中國藥典》“靈芝”項下的多糖，采用苯酚—硫酸顯色法測定其含量。3批彎柄靈芝多糖含量范圍為0.97%～1.08%，與鄭雷舒等［19］在無柄靈芝質量標準研究中的20批無柄靈芝多糖含量相當。將3批彎柄靈芝多糖含量測定平均值按80%計算得到含量標準為0.82%，擬規定彎柄靈芝多糖含量為：本品按干燥品計算，含多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計，不得少于0.80%。

參照2020版《中國藥典》“靈芝”項下的三萜及甾醇測定法測定其含量。3批彎柄靈芝三萜及甾醇含量范圍在1.25%～1.31%。鄭雷舒等［19］在無柄靈芝質量標準研究中的20批無柄靈芝三萜及甾醇平均含量分為0.59%～0.75%和0.59%～0.75%。本研究彎柄靈芝的三萜及甾醇含量顯著高于無柄靈芝。另外，與趙麗麗［16］等人研究的一株野生彎柄靈芝中三萜及甾醇含量相比較，本研究中的含量略高。將3 批彎柄靈芝三萜及甾醇含量測定平均值乘以80%，得到含量標準為0.94%，擬規定彎柄靈芝三萜及甾醇含量為：本品按干燥品計算，含三萜及甾醇以齊墩果酸（C30H48O3）計，不得少于0.90%。

4.3 本研究的局限性 由于彎柄靈芝為野生品種，資源較少，生長環境為五指山高山叢林，存在采樣難度大的問題。本次采集的樣品數量有限，未對其水分，灰分，酸不溶性灰分等做進一步考察，多糖和三萜及甾醇限度的最終確定還需更多樣品測定數據積累確定。對于薄層色譜和含量測定，今后可考慮分離制備代表性成分靈芝酮A 和靈芝醇B后進一步完善其薄層色譜鑒別及高效液相色譜法測定主要三萜類成分含量。后續本課題組也將繼續采集其他不同產地、不同年限的樣品進行研究，以建立更加完善的藥材質量標準。

5 結論

5.1 完善了彎柄靈芝的性狀及顯微鑒別特征 菌蓋近圓形、半圓形或腎形，1.2～3.7cm×1.0～2.1 cm，厚0.2～1.1 cm；菌柄彎曲不規則，長7.5～20.9 cm，直徑0.2～0.9 cm；有明顯的類似靈芝樣的木質清香味；顯微鑒別觀察到菌絲散在或粘結呈團狀并可見少量孢子，呈橢圓形，分散不均，6.3～9.1 μm×6.3～8.1 μm。

5.2 建立了彎柄靈芝的專屬性薄層色譜鑒別法 展開劑為石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1，V/V/V）。

5.3 初步確定了彎柄靈芝多糖和三萜及甾醇限度 彎柄靈芝含多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計，不得少于0.80%；含三萜及甾醇以齊墩果酸（C30H48O3）計，不得少于0.90%。

參考文獻

［1］胡佳，戴丹，彭新紅，等.靈芝屬9個野生菌株的分子鑒定與系統發育關系分析［J］.食用菌，2023，45（1）：29-34.

［2］羅虹建，林冬梅，王聯福，等.靈芝活性成分分析與質量評價研究進展［J］.藥物分析雜志，2023，43（1）：51-60.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020年版（一部）［S］. 北京： 中國醫藥科技出版社，2020：195.

［4］AHMAD M F. Ganoderma lucidum： Persuasive biologically active constituents and their health endorsement［J］. Biomed Pharmacother， 2018（107）：507-519.

［5］SEWERYN E， ZIALA A， GAMIAN A. Health-promoting of polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum［J］. Nutrients， 2021，13（8）：2725.

［6］CR D， KNEZ ， KNEZ HRNCˇICˇ M. Antitumour， antimicrobial， antioxidant and antiacetylcholinesterase effect of Ganoderma lucidumterpenoids and polysaccharides： A review ［J］. Molecules， 2018， 23（3）：649.

［7］UNLU A， NAYIR E， KIRCA O， et al. Ganoderma lucidum （Reishi Mushroom） and cancer ［J］. J Buon， 2016， 21（4）：792-798.

［8］WANG X， LIN Z. Immunomodulating effect of Ganoderma （Lingzhi） and possible mechanism［J］. Adv Exp Med Biol， 2019（1182）：1-37.

［9］高應娟，羅舒，宋怡，等.靈芝抗炎機制研究進展［J］.中國食用菌， 2021，40（9）：1-4，10.

［10］ZDEN H，瘙塁AHIN Y， KILITi A， et al. Comparison of the healing effects of mesazaline and Ganoderma lucidum in acetic acid-induced colitis in rats［J］. Ann Surg Treat Res，2022，102（1）：29-35.

［11］WEN L， SHENG Z， WANG J， et al. Structure of water-soluble polysaccharides in spore of Ganoderma lucidum and their anti-inflammatory activity ［J］. Food Chem， 2022，373（Pt A）：131374.

［12］LIU Q， TIE L. Preventive and therapeutic effect of Ganoderma （Lingzhi） on diabetes［J］. Adv Exp Med Biol， 2019（1182）：201-215.

［13］HUANG CH， LIN WK， CHANG SH， et al. Evaluation of the hypoglycaemic and antioxidant effects of submerged Ganoderma lucidum cultures in type 2 diabetic rats［J］. Mycology， 2020，12（2）：82-93.

［14］CHEN M， XIAO D， LIU W， et al. Intake of Ganoderma lucidum polysaccharides reverses the disturbed gut microbiota and metabolism in type 2 diabetic rats ［J］. Int J Biol Macromol， 2020（155）：890-902.

［15］陳德力，王小兵，呂偉，等.彎柄靈芝總三萜加速溶劑提取工藝及其清除DPPH自由基活性研究［J］.天然產物研究與開發，2016，28（10）：1597-1601， 1617.

［16］趙麗麗，葉麗云，解凡，等.一株野生彎柄靈芝的鑒定與多糖、三萜含量的研究［J］.食品工業科技，2017，38（21）：137-141.

［17］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020版（四部）［S］. 北京：中國醫藥科技出版社，2020： 30.

［18］李靖. 響應面優化靈芝多糖提取工藝研究［J］. 食品工業，2013，34（7）： 22-24.

［19］鄭雷舒，黃夢利，鞏圣堅，等.海南習用藥材無柄靈芝質量標準研究［J］.生物資源，2019，41（4）：342-347.

（收稿日期：2023-08-05 編輯：陶希睿）

基金項目：海南衛生健康職業學院校級基金［HWJ（XJJ）-20210104］。

作者簡介：王升勇（1981—），男，黎族，本科，高級講師， 研究方向為中藥化學成分及顯微鑒定。E-mail： 18667999@qq.com

作者簡介：王勇（1982—），男，漢族，碩士，研究員，研究方向為菌物資源開發與利用。E-mail： wangyong 1982_2004@163.com