黃芪（藥材及飲片）微生物污染菌的初步研究

白雯靜　王海峰

【摘 要】 目的：對黃芪原藥材以及加工后的微生物污染情況進行分析和研究，探討藥材（飲片）微生物污染的主要來源。 方法： 參照2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106的方法，并結合傳統生化和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）對純化的菌落進行鑒定。最后，運用SPSS 18.0軟件對數據進行進一步地統計和分析。 結果： 黃芪原藥材（飲片）在經過100℃、30min熱處理后，需氧菌總數呈現均勻性地下降，簡單芽孢桿菌、成團泛菌、屎腸球菌、陰溝腸桿菌為黃芪原藥材及飲片污染概率較高的菌。 結論： 黃芪藥材（飲片）污染菌中腸桿菌科占44%，芽孢菌科占41%。耐熱菌鑒定結果顯示均為芽孢桿菌。在確保安全和療效的前提下，對芽孢桿菌的殺滅十分有必要。

【關鍵詞】 黃芪; 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）; 微生物污染

【中圖分類號】R28 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）10-0067-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.10.zgmzmjyyzz202410014

Research on the Microbial Contamination of Astragali Radix （Herbal Medicine and Processecl Herbs）

BAI Wenjing1* WANG Yanwei2

Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730050， China

Abstract：Objective To explore the main sources of microbial contamination of medicinal materials on the basis of analysis and study of the microbial contamination of medicinal materials before and after processing.? Methods According to the method of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）， the purified colony was identified by combining traditional biochemistry method and matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. Finally， SPSS 18.0 software was used for further statistics and analysis of the data. Results After the heat treatment （100℃， 30min）， the value of lgTAMC was uniformly reduced， and Pantoea agglomerans， Klebsiella oxytoca， Pseudomonas monteilii， Enterobacter faecium， Bacillus subtilis and Enterococcus casseliflavus were the bacteria， which with high contamination probability of the medicinal materials.Conclusion The ratio of gram staining results of contaminated bacteria was close to 1∶[KG-*3/5]1. The contamination of Enterobacter xiangfangensis and? Cellulosimicrobium cellulans maybe happened during the processing. Most of the contaminating bacteria are Enterobacteria and Bacillus.Therefore， processing enterprises can establish corresponding measures according to the types of contaminated bacteria.

Key words：Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; MALDI-TOF-MS; Microbiological Contamination

1 引言

黃芪屬于根類飲片中較為常見的一種［1］，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.var.mongholius（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.的干燥根，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養血等功效。黃連上清丸、黃芪健脾膏、通竅鼻炎顆粒、培坤丸等中成藥均以黃芪入藥。另外，由于黃芪具有補氣升陽的功效，常作為藥膳食材中不可或缺的一部分。因而，鑒于黃芪藥材廣泛的應用范圍，其質量安全會嚴重影響到關聯中成藥品種的安全，而微生物污染又是其質量安全中十分重要的一部分。

通過文獻檢索的結果來看，我國中藥飲片整體微生物污染情況較為嚴重，不容樂觀［2～10］。根類飲片在《中國藥典》［1］（2020年版）一部所收集的所有中藥材中占有較高的比例，然而由于此類飲片主要來源為植物根莖，因而更容易受到土壤中微生物以及化學物質殘留的影響［2］，微生物污染情況與其他中藥材相比更為嚴重。對于中藥材微生物污染菌的研究目前主要分為兩個部分：一部分為中藥材內生菌的研究［11～12］；另一部分，主要以市場流通的中藥材飲片為研究對象，研究不同地區市售中藥材微生物污染情況［5～10］。但是，對于基于中藥材飲片加工前后微生物污染情況對比的研究或文獻比較少見。另外，根據江珍玉等［2］的研究發現：5種根類飲片中，黃芪的污染水平最高，并有2批次黃芪飲片檢出大腸埃希氏菌。因此，考慮到黃芪微生物污染這一安全隱患，只有通過從土壤到飲片這一全過程進行跟蹤性的研究，才能真正意義上發掘中藥材飲片微生物污染的緣由，并由此制定出切實有效的微生物污染的防治措施，從而確保飲片應有的療效和質量安全。

2 材料

2.1 樣品 所有樣品均由項目組于產地農貿市場或當地種植者處收購，并經過蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院朱仁愿高級工程師進行鑒別，3批次樣品均為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.var.mongholius（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.的干燥根。樣品編號詳見表1。

所有收到的黃芪樣品平均分為5份，1份實驗室備用作為基礎數據研究，其余4份在保證無菌包裝的前提下，分別委托4家中藥飲片加工企業進行加工，企業及加工工藝詳見表2。

2.2 試驗材料 ①儀器信息：生物安全柜（廠家：新加坡藝思高科技有限公司；型號：AC2-6S1）；高壓滅菌器［廠家：致微（廈門）儀器有限公司；型號：GR-85］；恒溫培養箱；基質輔助激光解析飛行時間質譜儀（廠家：布魯克公司）。②培養基：胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、RV沙門菌增菌液體培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、沙氏葡萄糖瓊脂培養基：培養基生產廠家均為北京陸橋股份有限公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 供試品溶液的制備 以無菌操作的方式將樣品打粉，取樣品粉末25 g，按照1∶[KG-*3/5]10的比例進行稀釋（稀釋液：pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液），樣液均質完全后吸取上清液，作為供試液（1∶[KG-*3/5]10）。

2.3.2 需氧菌總數（TAMC）、霉菌和酵母菌總數（TYMC）的檢查 取“2.3.1”項下制備的供試液，分別稀釋至1∶[KG-*3/5]100、1∶[KG-*3/5]1000、1∶[KG-*3/5]10000、1∶[KG-*3/5]100000（V/V；稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）。按照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1105進行需氧菌總數（TAMC）、霉菌和酵母菌總數（TYMC）的測定，為了便于統計，所得TAMC及TYMC數值取lg值后進行比較和分析。

2.3.3 耐熱菌數（NAIRE）的檢查 江珍玉等［2］在對5種常見根類中藥飲片微生物污染相關因素分析研究時，對耐熱菌項目檢查采用“100℃、30min熱處理”的方式。參照該方法將樣品打粉后，取樣品粉末25 g，按照1∶[KG-*3/5]10的比例進行稀釋（稀釋液：pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液），樣液制備后，于沸水浴（100℃）中進行熱處理（時間：30min），均質完全后吸取上清液，作為供試液（1∶[KG-*3/5]10），按照2.3.2中需氧菌總數的檢查方法進行耐熱菌數的測定。

2.3.4 控制菌的檢查

2.3.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（定性試驗） 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“耐膽鹽革蘭陰性菌”定性試驗方法進行相關檢驗。

2.3.4.2 大腸埃希菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“大腸埃希菌”相關方法進行檢驗。

2.3.4.3 沙門菌 參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“沙門菌”試驗方法進行相關檢驗。

2.3.4.4 銅綠假單胞菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“銅綠假單胞菌”試驗方法進行相關檢驗。

2.3.4.5 金黃色葡萄球菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“金黃色葡萄球菌”的試驗方法進行相關檢驗。

2.3.5 分離和鑒定 對2.3.2項、2.3.3項、2.3.4項下所有培養基平皿上培養出來的菌落按照形態和大小分別挑取并純化培養至TSA平板上，按照儀器自帶提取方法進行操作，再使用 MALDI-TOF-MS進行初步鑒定。如果鑒定結果未檢出或低于2.000的打分值，將菌落使用血平板經多次純化后再上機鑒定。

2.3.6 統計和分析 采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計和分析，并采用Krona軟件對鑒定結果進行描述和分析。涉及到的計數資料均采用描述性分析方法。

3 結果與分析

3.1 黃芪樣品的lgTAMC、TYMC、lgTYMC、lgNAIRE檢查結果 3批黃芪樣品的lgTAMC、lgNAIRE結果如表3所示，TYMC、lgTYMC的結果如表4所示：由表3可知，3批黃芪樣品lgTAMC、lgNAIRE值均高，提示微生物污染數值較高。由表4可知，與HQ-1（Y）、HQ-2（Y）、HQ-3（Y）相比較，加工企業A和C在加工后，TYMC數值均有不同程度的增加，提示可能與加工工藝中缺少干燥或者干燥環節時長不夠而引起霉菌污染有關。

3.2 黃芪樣品經100℃、30min熱處理［2.3.3耐熱菌數（NAIRE）的檢查］后lgNAIRE數值與熱處理前lgTAMC數值相比下降百分比結果 由表5、表6可知：黃芪原藥材以及加工后的飲片經100℃、30min熱處理后，數值呈現均勻性下降（數值集中在50%±10%），提示黃芪藥材及飲片中耐熱菌（NAIRE）的總體數量可能在污染菌總數的50%左右。

3.3 黃芪樣品MALDI-TOF-MS鑒定結果 由表7、表8和圖1可知：Bacillus simplex簡單芽孢桿菌、Pantoea agglomerans成團泛菌、Enterobacter faecium屎腸球菌、Enterobacter cloacea陰溝腸桿菌為黃芪原藥材及飲片污染概率較高的菌株；經100℃、30min熱處理［2.3.3耐熱菌數（NAIRE）的檢查］后所得耐熱菌進一步分離鑒定顯示多為芽孢桿菌。另外，由表7可知（加工后的菌株種類與加工前的菌株種類相比）：Enterobacter faeciums屎腸球菌、Enterobacter xiangfangensis香坊區腸桿菌分別可能是由B加工企業與C加工企業在加工環節中引入。因此，加工工藝及環境條件是黃芪微生物污染整個鏈條中比較重要的一環，加工廠家可能由于環境措施控制不到位而引入其他菌群的污染。

3.4 黃芪樣品中控制菌檢查結果 根據2.3.4的方法，對控制菌進行檢查，15批樣品［HQ（Y）1～3、HQ（A）1～3、HQ（B）1～3、HQ（C）1～3、HQ（D）1～3］均未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌。

4 討論

通過對鑒定結果進行進一步地整理和分析：鑒定菌株共為44株：其中腸桿菌科占44%，芽孢菌科占41%。耐熱菌的鑒定結果顯示為芽孢桿菌。因此，在黃芪原藥材及加工后的藥材中主要的污染菌為腸桿菌與芽孢桿菌。眾所周知，芽孢桿菌較難清除，由于其會產生大量的內生芽孢，這些內生芽孢在一定的條件下會被激活從而會大量地增殖，對黃芪中藥材的質量安全產生重大的隱患。另一方面，腸桿菌科中往往包括一些致病性較強的菌，此類菌會對人體健康產生不利地影響。

另外，經過對加工前后污染菌菌株種類的對比可知，Enterobacter faeciums屎腸球菌、Enterobacter xiangfangensis香坊區腸桿菌懷疑分別由B加工企業和C加工企業在生產加工環節中帶入。對于生產企業而言，內部質量控制十分重要，應該加強其生產加工環境的質量安全控制，在發現有微生物污染時，應該及時排查并制定有效措施加以處理。

綜上所述，黃芪藥材微生物污染主要來源可能包括內生菌、土壤以及生產加工帶入等多個方面。通過對其污染菌的鑒定分型可知污染菌主要為腸桿菌和芽孢桿菌這兩類。因此，后期在滅菌工藝研究中，應主要關注這兩類污染菌。然而，芽孢桿菌由于可產生大量內生芽孢，這類芽孢抗逆性強，耐高溫 、紫外線及電離輻射等，較難清除。因此，應著重考慮該類菌的消殺，進而確保黃芪藥材污染菌的種類和數量控制在安全的范圍內。

參考文獻

［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社， 2020：315.

［2］江珍玉， 陳純純， 龔勇祥， 等. 5種常見根類中藥飲片微生物污染相關因素分析研究［J］.中藥材，2018，41（7）：1593-1597.

［3］劉洪祥， 曹曉云. 中藥飲片中需氧菌、霉菌和酵母菌污染情況的研究及分析［J］. 天津藥學， 2017， 29（1）： 9-14.

［4］鄧彥，王婭珂，韓曉宇， 等. 不同品種根類中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染研究［J］. 中國中藥雜志， 2017， 42（21）： 4135-4141.

［5］鄧海英，龔永祥，李連鳳， 等. 中藥飲片微生物污染現狀及典型菌鑒定研究進展［J］.中草藥， 2019， 50（9）：2242-2256.

［6］張光華，王似錦，江志杰， 等. 北京地區銷售的10種中藥飲片微生物污染程度考察［J］.中國藥房， 2018， 29（14）：1940-1944.

［7］楊曉莉，李輝，繩金房. 12種中藥飲片耐熱菌污染狀況調查及風險評估［J］. 陜西中醫， 2016， 37 （6）： 740-743.

［8］繩金房，楊曉莉，李輝. 陜西省12種中藥飲片微生物污染調查及風險評估［J］. 陜西中醫， 2016， 31 （6）： 608-612.

［9］甘永琦，農浚，零文超， 等. 廣西等地區9種中藥飲片微生物污染狀況分析［J］.中國藥師， 2018， 21 （5）： 922-927.

［10］張光華，王似錦，江志杰， 等. 北京地區銷售的10種中藥飲片微生物污染程度考察［J］.中國藥房， 2018， 29 （14）： 1940-1944.

［11］楊志軍，鄧毅，曼瓊， 等. 內生菌在天然藥物研究中的研究進展［J］.中國臨床藥理學雜志， 2018， 34 （5）： 593-596.

［12］高紅， 盛劍，白旭， 等. 渾源黃芪內生細菌的菌群組成及其功能［J］. 微生物學報， 2020， 60 （8）： 1638-1647.

［13］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：四部［S］.北京：中國醫藥科技出版社， 2020：160-175.

［14］TAN WS， YUNOS N Y M， TAN P W， et al. Freshwater-borne bacteria isolated from a malaysian rainforest waterfall exhibiting quorum sensing properties［J］.Sensors， 2014， 14（6）： 10527-10537.

（收稿日期：2023-08-11 編輯：杜玲玉珊）

基金項目：甘肅省隴原青年創新創業人才項目—甘肅省大宗藥材微生物污染菌數據庫的建立與防治技術研究（甘組通字〔2022〕77號）；蘭州市科技發展指導性計劃項目（2022-5-9; 甘肅省藥品產業技術扶持項目（2019KF006）。

作者簡介：白雯靜（1987—），女，漢族，醫學碩士，主管藥師，研究方向為食品、藥品微生物研究。E-mail：yd08joy@163.com