?一株硝化纖維素降解菌的篩選及其降解機制初探?

劉強　林元山　粟桂蓉　周喜新

摘要：以硝化纖維素為篩選培養基，對采樣分離所得菌株和實驗室保藏菌株進行平板篩選，獲得長勢優良的6株降解菌；經固態發酵復篩，獲得硝化纖維素降解菌TL06；經ITS序列分析及構建進化樹分析，TL06被鑒定為西蒙斯木霉，且命名為西蒙斯木霉TL06。分別探究培養基成分、培養條件對西蒙斯木霉TL06產生纖維素酶和酯酶活力的影響，結果表明：培養基中添加有機氮源會顯著降低纖維素酶和酯酶活力，而添加無機氮源硫酸銨會顯著提高纖維素酶活力；添加碳源會顯著降低纖維素酶活力，但對酯酶活力影響不明顯。為優化發酵條件設置正交試驗，發現在硫酸銨濃度1.5%、硝化纖維素與麩皮的質量比5∶5、發酵時間5 d、料水比10∶12、培養溫度30℃、自然pH值條件下，纖維素酶活力達到1.36 IU/g，比優化前提高了189.36%。初步探明，西蒙斯木霉TL06降解硝化纖維素的機制是分泌纖維素酶和酯酶，水解β-1，4糖苷鍵和硝酸酯鍵，其中糖苷鍵的水解優先啟動。

關鍵詞：硝化纖維素；生物降解；纖維素酶；酯酶；西蒙斯木霉

中圖分類號：TQ560.1文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0001-06

Screening of Nitrocellulose Degrading Strain and Preliminary Study on Its Degradation Mechanism

LIU Qiang，LIN Yuan-shan，SU Gui-rong，ZHOU Xi-xin

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： Nitrocellulose was used as a screening medium， and six degrading strains with excellent growth were obtained by plate screening of the isolated strains after sampling and the strains stored in the laboratory. The nitrocellulose degrading strain TL06 was obtained by solid state fermentation and secondary screening. Through ITS sequence analysis and phylogenetic tree analysis， it was identified as Trichoderma simmonsii and named Trichoderma simmonsii TL06. The effects of medium components and culture conditions on cellulase and esterase activities of Trichoderma simmonsii TL06 were investigated. The results showed that the cellulase and esterase activities were significantly decreased by adding an organic nitrogen source into the medium， while the cellulase activity was significantly increased by adding an inorganic nitrogen source ammonium sulfate. Adding a carbon source significantly reduced cellulase activity but had no significant effect on esterase activity. In order to optimize the fermentation conditions， the orthogonal experiment was set up. It was found that the cellulase activity reached 1.36 IU/g under the conditions of ammonium sulfate concentration of 1.5%， mass ratio of nitrocellulose to bran of 5：5， fermentation time of 5 d， feed-to-water ratio of 10∶12， culture temperature of 30℃， and natural pH value， which was 189.36% higher than that before optimization. It was preliminarily discovered that the mechanism of Trichoderma simmonsii TL06 in degrading nitrocellulose was the secretion of cellulase and esterase and the hydrolysis of β-1，4 glucoside bond and nitrate bond， in which the hydrolysis of glucoside bond was preferentially initiated.

Key words： nitrocellulose; biodegradation; cellulase; esterase; Trichoderma simmonsii

硝化纖維素（Nitrocellulose）又名硝化棉、棉體火棉膠等，屬于硝酸酯類，是纖維素與硝酸酯化反應的產物，遇明火、高熱極易燃燒爆炸，危害極大[1]。硝化纖維素的化學結構式中長鏈以β-1，4糖苷鍵連接，該鍵能量低，不活躍，結構穩定，溫和條件下難以斷裂。此外，硝化纖維素中大量硝酸酯鍵之間的空間位阻較大，酯酶的催化中心難以達到該區域進行水解。

雙基火藥是退役報廢彈藥的主要產物，主要成分為硝化纖維素和硝化甘油，還含有較少的二苯胺、吉納、樟腦、鋁粉、鞣酸鉛等物質[2]。退役報廢彈藥的處理方式經歷了深土掩埋、深海傾倒、粗放焚燒到機械化拆卸、切割及倒空，再到融合智能化、自動化及經濟環保化的發展階段[3]。對于不能回收再利用的報廢雙基火藥，目前采用的處理方式主要是焚燒。然而，焚燒往往會導致二次危害和污染。近年來，利用微生物降解退役報廢雙基火藥成為綠色發展的新方向[4-5]。該研究旨在篩選硝化纖維素的降解菌，探索微生物法斷裂硝化纖維素中的β-1，4糖苷鍵和硝酸酯鍵的環境友好型方案，以實現退役報廢雙基火藥的無害化、資源化、肥料化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑 大顆粒雙基火藥由國內某單位提供，其硝化纖維素含量為94%～96%；乙酸對硝基苯酯CAS 830-03-5購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備 SX500滅菌鍋（日本TOMY公司），ZS-BRM培養箱（浙江華源儀器有限公司），HSX-250智能恒溫恒濕箱（上海福瑪實驗設備公司），U2000分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司），CR21G離心機（日本HITACHI公司），榮事達1000型密閉超細粉碎機（合肥榮事達電子電器集團有限公司），FLIR TG165紅外成像測溫儀（美國菲力爾公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 （1）篩選培養基：硝化纖維素粉4 g，瓊脂2 g，蛋白胨0.1 g，自來水100 mL，121℃滅菌20 min。（2）斜面培養基：20%馬鈴薯汁100 mL，瓊脂2 g，加熱溶解并分裝，每支試管5 mL制作斜面，121℃滅菌20 min。（3）固態發酵培養基：麩皮5 g，硝化纖維素粉5 g，自來水12 mL，于250 mL錐形瓶中攪拌均勻，封口膜封瓶口，121℃滅菌20 min。

1.2.2 硝化纖維素粉的制備 將水中儲存的大顆粒雙基火藥自然陰干，取10 g用自封袋密封，置于-80℃的冰箱完全預凍。之后迅速轉至不銹鋼密閉粉碎機中，高速粉碎1 min，停歇1～3 min，循環6～8次。用紅外成像測溫儀遠距離測定粉碎機殼體溫度，確保粉碎機溫度不超過50℃，控制粉碎機開關操作人員與粉碎機保持10 m以上安全距離，確保粉碎操作安全，雙基火藥粉碎前后的形態見圖1。

1.2.3 菌株的篩選 （1）樣品采取：選取腐爛的水稻秸稈，干燥后研磨至細小粉末備用。（2）菌株初篩：將篩選培養基從滅菌箱取出，趁熱搖勻倒平板，待其冷卻凝固；稱取5 g研磨后的腐爛秸稈粉，投入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，于轉速200 r/min的搖床中振蕩30～60 min，然后稀釋至10-7；在10-4～10-7稀釋液中，分別取0.1 mL涂布平板，每個梯度涂布4～6個平皿，于30℃恒溫培養箱中倒置培養2～4 d，每天觀察菌落形態變化，選取長勢良好的菌落接種至試管斜面，于30℃恒溫培養箱繼續培養至斜面長出菌落，置于4℃冰箱備用。（3）固態發酵復篩：將初篩斜面接種至發酵培養基，于30℃恒溫培養箱中靜置培養2～7 d，觀察麩曲中菌體生長狀態，并在菌體長至穩定期時終止發酵，加入蒸餾水100 mL，攪勻，在室溫條件下于搖床中振蕩浸提30 min，取上清液，用于纖維素酶與酯酶活力及還原糖、亞硝酸根和硝酸根含量的測定，通過形態觀察，感官評價菌株生物量，從而選取最優的硝化纖維素降解菌。

1.2.4 纖維素酶和酯酶的提取 將干重為10 g的固體發酵曲，用100 mL蒸餾水浸提30 min，200目無紡布過濾，發酵液濾液在轉速10 000 r/min下離心6 min，上清液即為粗酶液，用于測定纖維素酶和酯酶活力。

1.2.5 纖維素酶濾紙酶活力的測定 配制不同濃度的葡萄糖溶液，加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸溶液，在沸水浴中加熱反應5 min，取出冷卻至室溫。于540 nm波長下測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線，測定還原糖含量[6]。葡萄糖標準曲線為：y=6.87x+0.0025，其中，x為吸光度，y為葡萄糖含量。在50℃、pH值5.0條件下，定義1 mL粗酶液1 min水解新華濾紙（1 cm×6 cm）生成1 ?mol葡萄糖所需的酶量，為1個活力單位（IU）。空白組處理為粗酶液中加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL滅酶活。酶活力（Y）按公式（1）計算。

式中：y為還原糖含量（?mol），n為發酵曲的浸提液體積（mL），t為酶液與底物的反應時間（min），M為發酵曲培養基干重（g）。

1.2.6 酯酶活力的測定 配制不同濃度的對硝基苯酚溶液，擬合對硝基苯酚標準曲線，測定酯酶活力。以乙酸對硝基苯酯（p-NPA）為底物，在20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）中加入0.1 mL酶溶液和1 mL 濃度為5 mmol/L的p-NPA，在30 ℃下反應5 min，反應液定容至10 mL。在400 nm波長處測定吸光度，繪制對硝基苯酚標準曲線，計算對硝基苯酚的含量，由此進行酯酶活力測定[7]。標準曲線為：y=2.24x+0.0033，其中，x為吸光度，y為硝基苯酚濃度。一定條件下，定義1 min釋放1 ?mol對硝基苯酚所需的酶量為一個活力單位（IU）。酶活性（Y）按公式（2）計算。

式中：y為硝基苯酚含量（?mol），n為發酵曲的浸提液體積（mL），10為粗酶液稀釋倍數；t為酶液與底物反應時間（min），M為發酵曲培養基干重（g）。

1.2.7 亞硝酸根含量的測定 根據標準GB5009.33

—2016測定亞硝酸根的含量。試樣經沉淀蛋白質、除去脂肪后，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標法測得亞硝酸鹽含量。

1.2.8 硝酸根含量的測定 根據標準GB/T35496—2017測定硝酸根的含量。在硫酸介質中，靛藍二磺酸鈉（靛藍胭脂紅）被硝酸鹽氧化成黃色的靛崧，從而使靛藍消失，采用分光光度法在620 nm波長處測定其含量。

1.2.9 菌株鑒定 將產纖維素酶和酯酶性能優勢的菌株寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司成都測序部進行分子鑒定，與基因庫數據比對，構建進化樹，確定菌株種屬。

1.2.10 硝化纖維素降解條件的優化 在發酵培養基初始條件下，以不同硫酸銨濃度、硝化纖維素與麩皮配比、發酵時間對產纖維素酶和酯酶的影響進行正交試驗，優化硝化纖維素降解的條件。重復3次，取平均值，利用SPSS 20軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 硝化纖維素降解菌的篩選

以硝化纖維素為篩選平板的唯一碳源，對多次采樣分離所得的菌株以及實驗室保藏菌株進行平板篩選。結果表明，硝化纖維素培養基上生長的菌株總體較少，大多為絲狀真菌，細菌較少，酵母類真菌難以生長，部分篩選平板如圖2所示。生長情況較好的有：實驗室保藏菌株青霉Lys-4、棘孢曲霉GPG-75、黑曲霉Lys2280，新篩選菌株TL06、Lyz217、Lyz318。篩選平板中，菌絲長勢由優到劣依次是菌株TL06、青霉Lys-4、Lyz217、Lyz318、棘孢曲霉GPG-75和黑曲霉Lys2280。菌絲長勢表征生物量，反映菌株對篩選培養基的利用程度。硝化纖維素的元素組成包含了碳、氫、氧、氮，其連接鍵主要為糖苷鍵和硝酸酯鍵，生物對硝化纖維素的利用從水解糖苷鍵和硝酸酯鍵開始。可見，對糖苷鍵和硝酸酯鍵的水解酶的產生菌進行篩選，可優選出硝化纖維素降解菌株。

2.2 硝化纖維素降解菌的纖維素酶與酯酶活力及降解分析

將從硝化纖維素平板中篩選得到的長勢優良的6株菌株，接種至發酵固體培養基中進行復篩，菌絲鋪滿培養基后測定其纖維素酶和酯酶活力，結果見表1。

從表1可知，不同菌株的生長和發酵周期差異明顯，棘孢曲霉GPG-75、黑曲霉Lys2280生長最快，發酵3 d后發酵曲完全變黑；其次是青霉Lys-4，3.5 d后發酵曲發白泛綠；再次是菌株TL06，4 d后發酵曲完全變綠；而菌株Lyz217、菌株Lyz318生長緩慢，直到培養6 d后發酵曲才鋪滿白色菌絲。從菌絲生物量看，青霉Lys-4的菌絲最發達，發酵持續時間長，期間菌絲滲透、包裹整個發酵曲，發酵曲蓬松發白，可見青霉Lys-4菌絲對培養基利用最好。菌株TL06對培養基的利用僅次于青霉Lys-4，菌絲前期蓬松發白，后期變綠。菌株Lyz217和菌株Lyz318雖然生長緩慢，但后期菌絲豐滿，培養基的利用程度很好。棘孢曲霉GPG-75和黑曲霉Lys2280雖然生長很快，但過早進入形態分化期，產生大量黑褐色孢子，說明培養基利用不足。

由于培養基的固形物中，硝化纖維素和麩皮占比均為50%，菌絲生長良好不一定是充分利用硝化纖維素的結果，也有可能是利用麩皮的結果。因此，檢測發酵曲中纖維素酶和酯酶活力，以檢驗菌株對硝化纖維素的糖苷鍵和酯鍵的水解能力。表1顯示，纖維素酶活力以菌株Lyz318最優，活力達到0.93 IU/g，與其他菌株產生的纖維素酶活力差異顯著（P＜0.05，下同）；其次是菌株TL06、青霉Lys-4和棘孢曲霉GPG-75。酯酶活力以菌株TL06最優，活力達到1.95 IU/g，其次是棘孢曲霉GPG-75和青霉Lys-4。從發酵曲中游離的亞硝酸根離子濃度來看，菌株TL06游離的最多，達120.73 μg/g，其次是菌株Lyz217。考慮到硝化纖維素由大量糖苷鍵和硝酸酯鍵組成，若選擇單一降解菌，總體降解效果菌株TL06最優；若是選擇復合菌，可以考慮將菌株TL06和菌株Lyz318混菌發酵，但其工藝有待進一步優化。

2.3 硝化纖維素降解菌的鑒定

對固態發酵復篩的優良菌株TL06進行形態觀察，并進行ITS測序，所獲序列與GenBank數據庫進行比對，構建進化樹。進行Blast同源性比較得出，菌株TL06與菌株Trichoderma simmonsii CBS 130431同源性最高，因此菌株TL06鑒定為西蒙斯木霉（Trichoderma simmonsii），命名為西蒙斯木霉TL06，基因庫登錄號為SUB13859491，構建的進化樹見圖3。西蒙斯木霉TL06，菌絲初期呈白色，后逐步產生淺綠色孢子和墨綠色孢子；菌絲有隔膜，向上伸出直立的分生孢子梗；在22～36℃能夠較好生長，最適溫度為28～30℃；西蒙斯木霉TL06在pH值3.0～7.0都能生長，最適pH值為4.5～6.0。

2.4 培養基成分對西蒙斯木霉TL06產生纖維素酶與酯酶活力的影響

硝化纖維素中富含糖苷鍵和硝酸酯鍵，培養基中硝化纖維素含量和含水量直接影響西蒙斯木霉TL06對硝化纖維素的利用程度。表2顯示，硝化纖維素與麩皮的質量比為5∶5，料水比為10∶12時，其纖維素酶和酯酶活力相對最優，且顯著優于其他配比。

在固態發酵培養基上，研究碳源、氮源對西蒙斯木霉TL06產生的纖維素酶與酯酶活力的影響。從表3可知，培養基成分中添加酵母膏、黃豆粕、玉米漿、蛋白胨等有機氮源，會顯著降低纖維素酶和酯酶活力；添加無機氮源硫酸銨顯著提高纖維素酶活力，達到1.04 IU/g，但酯酶活力有所減小。在基礎培養基條件下，進一步探究單一無機氮源硫酸銨對纖維素酶與酯酶活力的影響。表3顯示，硫酸銨濃度為1.5%時，西蒙斯木霉TL06的纖維素酶活力顯著提高，達到1.12 IU/g。除此之外，發酵曲形態分化差異明顯，添加硫酸銨還能延長菌絲繁殖時間，發酵曲的綠色孢子分化緩慢，菌絲產酶時間長，這與秸稈“氨化”的降解作用一致。

由表4可知，與固態發酵培養基相比，培養基中添加碳源時，會顯著降低西蒙斯木霉TL06的纖維素酶活力。當環境中有快速可利用的碳源時，西蒙斯木霉TL06無需分泌纖維素酶水解復雜碳源，而是直接吸收利用環境中速效碳源。另外，碳源的添加對酯酶活力影響不明顯。

2.5 培養條件對西蒙斯木霉TL06的纖維素酶與酯酶活力影響

西蒙斯木霉TL06對硝化纖維素的降解會受環境條件影響，因此，試驗探究了溫度、發酵時間和環境pH值對其產生纖維素酶和酯酶的影響。從表5可知，西蒙斯木霉TL06在pH值為4.0～7.0時能很好的生長，其纖維素酶活力在pH值5.0～6.5范圍內無顯著差異。但酯酶活力受pH值影響顯著，最適pH值為5.5，此時酯酶活力達2.09 IU/g。由于硝化纖維素與麩皮配制的培養基，pH值范圍處于5.2～5.8范圍，因此無需調配pH值，西蒙斯木霉TL06就可以很好的生長。此外，西蒙斯木霉TL06產纖維素酶的最適溫度為28～32℃，產酯酶的最適溫度為30℃；產纖維素酶的最適發酵時間為4～5 d，產酯酶的最適發酵時間為5 d，纖維素酶活力優先于酯酶達到峰值，推測西蒙斯木霉TL06優先降解硝化纖維素的糖苷鍵。

2.6 西蒙斯木霉TL06產生纖維素酶的正交試驗分析

從單因素試驗結果來看，西蒙斯木霉TL06與其他木霉屬菌株，如綠色木霉、康氏木霉相比，能產生具有較高活力的纖維素酶，對降解硝化纖維素的主鏈起到關鍵作用。因此，試驗選擇硫酸銨濃度（A）、硝化纖維素與麩皮配比（B）、發酵時間（C）作為考察因素，其中，硫酸銨濃度分別設置為1%（I）、1.5%（II）、2%（III），硝化纖維素與麩皮配比分別設置為4∶6（I）、5∶5（II）、6∶4（III），發酵時間分別設置為4 d（I）、4.5 d（II）、5 d（III），進行3因素3水平的正交試驗，試驗設計及結果見表6。極差分析表明，3個因素對西蒙斯木霉TL06產纖維素酶的影響程度排序為硝化纖維素與麩皮的質量比＞發酵時間＞硫酸銨濃度。根據K值判斷，最佳組合為A2B2C3，即硫酸銨濃度為1.5%、硝化纖維素與麩皮的質量比為5∶5、發酵時間5 d為最佳方案。該組合方案下設置料水比10∶12，培養溫度30℃，培養基起始pH值為自然pH值，纖維素酶活力達到1.36 IU/g，比優化前（0.47 IU/g）提高了189.36%。

3 討論與結論

退役報廢雙基火藥的一些成分會抑制生物細胞生長，這大大增加了其生物降解的難度。硝化纖維素是退役報廢雙基火藥的主要成分，糖苷鍵連接其主鏈，硝酸酯鍵連接側鏈基團。要將大分子硝化纖維素降解為小分子，主鏈降解必不可少，而要實現硝化纖維素的充分降解，側鏈水解也極其重要。由此可見，退役報廢雙基火藥的無害化、資源化、肥料化利用，要充分發揮糖苷鍵水解酶和酯鍵水解酶的作用。目前，報廢彈藥的主要銷毀方式仍然是物理拆卸、焚燒、爆炸等方法，其操作安全和環境污染等問題難以克服[8-9]。因此，根據硝化纖維素富含β-1，4糖苷鍵和硝酸酯鍵的特點，該研究設計了生物酶水解這2種化學鍵的試驗方案，獲得能利用硝化纖維素的西蒙斯木霉TL06。西蒙斯木霉TL06降解硝化纖維素的機制是分泌纖維素酶和酯酶水解β-1，4糖苷鍵和硝酸酯鍵，纖維素酶和酯酶活力分別達0.47和1.95 IU/g，其中糖苷鍵的水解啟動先于酯鍵的水解。研究中纖維素酶的活性測定使用的是濾紙纖維素，不溶于水，是纖維素酶作用的真實底物；酯酶活力測定則使用乙酸對硝基苯酯，溶解性好，是酯類的類似底物，間接反映酯酶活力，由于測定分析方法選用的酶解底物不同，相關酶活性數據上產生的差異較大[10]。

培養基中的成分會影響西蒙斯木霉TL06對硝化纖維素的利用程度。在固態發酵培養基中添加有機氮源，會顯著降低纖維素酶和酯酶活力；添加無機氮源硫酸銨則能顯著提高纖維素酶活力，但酯酶活力有所減小。培養基中添加碳源時，會顯著降低纖維素酶活力，但對酯酶活力影響不明顯。此外，西蒙斯木霉TL06對硝化纖維素的降解程度還會受到溫度、發酵時間和環境pH值的影響。設計正交試驗發現，西蒙斯木霉TL06在硫酸銨濃度1.5%、硝化纖維素與麩皮的質量比5∶5、發酵時間5 d、料水比10∶12，培養溫度30℃和自然pH值條件下，纖維素酶活力達到1.36 IU/g，比優化前提高了189.36%。該研究為硝化纖維素的微生物降解提供了參考方案，為報廢退役雙基火藥的無害化、資源化、肥料化利用提供了方向。

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（責任編輯：王婷）

收稿日期：2023-12-04

基金項目：湖南省農業領域重點研發項目（2016NK2114）

作者簡介：劉強（1985—），男，山西侯馬市人，工程師，主要從事資源可持續利用研究。

通信作者：周喜新