?QuEChERS -高效液相色譜-串聯質譜法檢測甘薯和土壤中烯效唑殘留的方法研究?

左仁芳　戴桂金　王妙　張玉涵　羅杰　熊浩　劉志邦　陳武瑛　張卓

摘要：采用改良的QuEChERS方法進行前處理，建立了甘薯和土壤中烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品用含0.1%乙酸的乙腈振蕩提取，經C18凈化劑進行基質凈化，采用C18反相色譜柱分離，進行LC-MS/MS檢測。結果表明：烯效唑在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內，質量濃度與對應的峰面積間呈良好的線性關系，相關系數為0.995 1～0.995 9；在0.002、0.02、0.20 mg/kg 3個添加水平下，烯效唑在甘薯和土壤中的平均回收率為90.3%～106.7%，相對標準偏差為0.6%～3.6%，方法定量限為0.002 mg/kg。該方法方便快捷、精準定量、檢測靈敏，適用于甘薯和土壤樣品中烯效唑的檢測。

關鍵詞：烯效唑；甘薯；高效液相色譜-串聯質譜；殘留；方法

中圖分類號：O657.63文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0090-06

Determination of Uniconazole Residue in Sweet Potatoes and Soil by

QuEChERS-HPLC-MS/MS

ZUO Ren-fang1，DAI Gui-jin2，WANG Miao3，ZHANG Yu-han3，LUO Jie3，XIONG Hao3，

LIU Zhi-bang3，CHEN Wu-ying3，ZHANG Zhuo3

（1. Plant Protection and Inspection Station， Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416200， PRC;?2. Agricultural Characteristic Industry Service Center， Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416299， PRC; 3. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract： A method for determining the uniconazole residue in sweet potatoes and soil was established by the combination of improved QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rugged， and safe） with high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Each sample was extracted by shaking with acetonitrile containing 0.1% （volume fraction） acetic acid， purified by C18 purification agent， separated by reversed-phase C18 column chromatography， and detected by LC-MS/MS. The results showed good linearity between the peak area and the uniconazole concentration within the range of 0.000 5-1.0 mg/L?（R2 of 0.995 1-0.995 9）. The recovery of uniconazole in sweet potatoes and soil at the spike levels of 0.002， 0.02， and 0.20 mg/kg ranged from 90.3% to 106.7% with the relative standard deviations （RSDs） of 0.6%-3.6%. The established method showed the limit of quantification （LOQ） of 0.002 mg/kg. With easy operation， high sensitivity， and high accuracy， the established method is suitable for the detection of uniconazole in sweet potatoes and soil.

Key words： uniconazole; sweet potato; high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; residue; method

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam]屬于旋花科植物，適應性強，廣泛種植于熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區，是一種重要的糧食作物。甘薯起源于拉丁美洲，目前中國是世界上最大的甘薯生產國和消費國，主要將甘薯用于食品、動物飼料和工業加工等方面。在甘薯生產過程中，常因物候條件、品種等原因出現甘薯莖葉徒長的現象，導致甘薯地下部分產量降低、淀粉含量下降，嚴重影響甘薯的經濟產量[1]；而噴施外源化學調控劑可有效抑制莖葉徒長，從而增加塊根產量[2]。

烯效唑（Uniconazole）作為一種新型植物生長調節劑，可以調控多種植物的生理功能，如生長發育、光合和呼吸作用、礦質營養和碳水化合物的代謝與分配和植物抗性等，是目前中國農業生產中使用面積最廣的植物生長延緩劑之一[3]。研究表明，對塊根、塊莖類作物施加烯效唑，可抑制莖葉的生長，增加其根冠比，促進光合同化產物向作物產品器官（果實、種子、塊根、塊莖等）的分配，從而增加作物產量和增強作物抗逆能力[4-6]，因此烯效唑現已廣泛應用于薯類、蘿卜等塊根塊莖類作物[7]。在實際生產中，過量使用植物生長調節劑會影響動物及人體健康，如低于日允許攝入量濃度的矮壯素仍會對動物的繁殖能力產生不良影響[8]。此外，烯效唑施用不當會造成殘留超標，而我國食品中農藥最大殘留限量標準GB 2763—2021[9]尚未對烯效唑在甘薯中的最大殘留限量進行規定。因此需要創建甘薯中烯效唑殘留的檢測方法，用以評估烯效唑應用于甘薯生產的安全性。

目前檢測烯效唑殘留主要采用的方法有氣相色譜法（GC）[10]、液相色譜法（HPLC）[11]和液質聯用法（HPLC-MS/MS）[4]等，但由于烯效唑具有相對分子質量較大、氣化溫度高、極性較強等特點，采用氣相色譜法的檢測效果不理想，所以采用液相色譜法[10-12]和液質聯用法[13-17]檢測烯效唑殘留更常見。另張良等[18]采用包被抗體直接競爭模式建立了蘋果中烯效唑的酶聯免疫吸附分析法，該方法中烯效唑的檢出限（LOD）為0.024 μg/kg。表1總結了3種檢測方法測定不同農產品中烯效唑殘留的前處理方法和方法定量限（LOQ）。國內外關于農產品中烯效唑殘留的檢測主要涉及葉類蔬菜和水果等，但在甘薯中還尚未見相關報道。該研究通過改良的QuEChERS方法對甘薯和土壤中烯效唑進行提取和凈化，建立甘薯和土壤中烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，為評估烯效唑在甘薯生產中應用的安全性提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯和土壤空白樣品采自鳳凰縣林峰鄉土洞村紅薯種植基地，烯效唑標準品購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，色譜級甲酸、甲醇和乙腈購自默克化工技術（上海）有限公司，分析級乙酸、乙腈和氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，PSA、C18和石墨化炭黑（GCB）購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CPA225D電子天平（德國賽多利斯公司），多管渦旋振蕩儀（杭州瑞誠儀器有限公司），TDL-40B低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），移液器（Eppendorf艾本德公司），Centrifuge 5424高速離心機（Eppendorf艾本德公司），LC1290-AB SCIEX 4500Q高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用系統（美國Aglient公司和美國SCIEX公司）。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 稱取5 g均質后的甘薯樣品于50 mL離心管中，加入5 mL雙蒸水，輕微振蕩混勻后浸泡5 min，加入10 mL含0.1%（體積分數）乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩10 min，加入5 g NaCl，顛倒混勻后再渦旋振蕩2 min，4 500 r/min轉速下低速離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有50 mg C18凈化劑的2 mL離心管中，渦旋30 s后在10 000 r/min轉速下高速離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，濾液待LC-MS/MS檢測。

稱取5 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入10 mL雙蒸水，輕微振蕩混勻后浸泡5 min，加入10 mL乙腈提取液，渦旋振蕩10 min，加入5 g NaCl，顛倒混勻后渦旋振蕩2 min，4 500 r/min轉速下低速離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有50 mg C18凈化劑的2 mL離心管中，渦旋30 s后在10 000 r/min轉速下高速離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，濾液待LC-MS/MS檢測。

1.3.2 儀器條件 液相模塊：色譜分離柱為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 ?m）；柱溫箱設為25℃，進樣量設為1.0 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，流速為0.4 mL/min；流動相梯度洗脫程序如表2所示。

質譜模塊：使用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度500℃，離子噴霧電壓5 500 V，噴霧氣壓和輔助加熱氣壓310.3 kPa，氣簾氣壓275.8 kPa，采用多反應監測模式（MRM）進行檢測。烯效唑質譜測定參數設置為：保留時間2.49 min，母離子291.9，子離子70.0*和125.1，錐孔電壓51 V，碰撞能59 eV和29 eV；其中“*”表示定量離子。

1.3.3 標準溶液的配制 準確稱取烯效唑標準品0.010 1 g配制成1 000 mg/L的母液；準確量取烯效唑母液，用乙腈逐級稀釋成1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.000 5 mg/L標準溶液。將甘薯和土壤空白樣品進行前處理得到空白基質溶液，稀釋得到濃度梯度為1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.000 5 mg/L的基質標準溶液。將可檢測出烯效唑溶劑標準溶液的最小濃度定義為方法檢出限（LOD）。

1.3.4 添加回收試驗 將空白甘薯和土壤樣品前處理后進行添加回收試驗，添加水平分別設置為0.002、0.02和0.2 mg/kg，每個水平重復5次，通過計算添加回收率及其對應的相對標準偏差考察方法精確度，將最小添加濃度水平定義為方法定量限（LOQ）。

1.3.5 基質效應 由于質譜離子豐度易受甘薯和土壤樣品復雜基質的干擾，根據公式（1）計算甘薯和土壤樣品的基質效應（ME），根據ME值的范圍判定基質效應的強弱[19]。

式中，km為空白基質標準溶液所制得的標準曲線的斜率，ks為溶劑標準溶液所制得的標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的確定

烯效唑分子含有羥基，在電噴霧下易離子化，所以選取ESI源作為質譜離子源。首先在ESI+模式下通過質譜調諧優化找到母離子291.9，然后優化碰撞能量選擇響應值較高的碎片子離子作為定量離子70.0和定性離子125.1。烯效唑在C18色譜柱上的保留效果好，比較不同有機流動相（甲醇和乙腈）的烯效唑洗脫效果，結果表明乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，色譜峰形對稱，信號穩定，保留時間為2.49 min。

2.2 提取方法的改良

在常規QuEChERS方法中，提取溶劑通常選擇乙腈，但不同的農藥結構、樣品基質、提取液pH值條件對農藥的提取效果均有很大影響。前期研究表明在乙腈提取液中加入不同比例的乙酸，可以更好的將烯效唑從復雜基質中提取出來[16-17]。該研究比較了乙腈和含0.1%乙酸的乙腈對甘薯中烯效唑提取效率的影響，由圖1 A可知，用乙腈提取的平均回收率為75.43%，而用含0.1%乙酸的乙腈提取的平均回收率為89.12%，因此選擇含0.1%乙酸的乙腈作為甘薯中烯效唑的提取溶劑。

在QuEChERS前處理方法中，分散固相萃取凈化過程中常見的吸附劑有C18、PSA和GCB。其中C18是一種廣譜性的非極性凈化劑，能有效吸附基質中微量的非極性雜質；PSA屬于氨基吸附劑，它能夠通過氫鍵除去基質中的有機酸、糖等物質；而GCB具有極強的吸附能力，能去除部分色素，但有時也會吸附某些農藥[16]。該研究分別以50 mg C18、50 mg C18+50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg PSA+50 mg GCB為凈化劑，比較其對甘薯中烯效唑回收率的影響。由圖1 B可知，50 mg C18、50 mg C18+50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg PSA+50 mg GCB為凈化劑時，甘薯中烯效唑的平均回收率分別為92.18%、79.51%、86.84%和78.63%，因此選擇C18作為固相萃取凈化的凈化劑。

2.3 分析方法的線性關系、準確度

由表3可知，在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內，烯效唑在基質中均呈良好的線性關系，相關系數為0.995 1～0.995 9，表明該研究建立的甘薯和土壤中烯效唑殘留的分析方法能滿足農藥殘留分析所要求的準確度。此外，烯效唑在甘薯和土壤中的基質效應分別為5.5%和6.2%，表明甘薯和土壤提取液經過凈化后，均可以消除大部分基質雜質的干擾，因此該方法中數據的校準采用基質標準曲線進行，以消除基質效應的影響。

由表4可知，烯效唑在甘薯中的平均回收率為90.4%～106.7%，相對標準偏差（RSD）為0.6%～2.3%；烯效唑在土壤中的平均回收率為90.3%～94.6%，RSD為1.2%～3.6%。烯效唑在甘薯和土壤中的定量限以最小添加濃度表示，均為0.002 mg/kg。烯效唑在溶劑、甘薯空白基質和土壤空白基質中的色譜圖見圖2、圖3和圖4。由圖2、圖3和圖4可知，在該研究方法中，甘薯和土壤中各濃度烯效唑的色譜峰均能較好地與基線分離，可以滿足甘薯和土壤中烯效唑殘留分析檢測的要求。

3 討論與結論

該研究通過改良的QuEChERS方法提取甘薯和土壤中的烯效唑，在提取溶劑乙腈中加入乙酸，提高了提取效率。質譜技術現已廣泛應用于農產品中農藥殘留的檢測，但農產品的復雜基質會對化合物在質譜中的響應產生干擾，從而影響分析結果的準確度，因此在農產品的農藥殘留檢測中應考慮基質效應[17]。經分散固相凈化劑C18凈化處理后，烯效唑在甘薯和土壤中的基質效應分別為5.5%和6.2%，屬于弱基質效應，表明甘薯和土壤提取液經過凈化后，均可以消除大部分基質雜質的干擾。此外，烯效唑在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內，質量濃度與對應的峰面積間呈良好的線性關系，相關系數為0.995 1～0.995 9，這表明該研究建立的甘薯和土壤中烯效唑殘留的分析方法能滿足農藥殘留分析所要求的準確度。在0.002、0.02、0.2 mg/kg這3個添加水平下，烯效唑在甘薯和土壤中的平均回收率為90.3%～106.7%，相對標準偏差為0.6%～3.6%，方法定量限均為0.002 mg/kg。總體而言，該研究建立了檢測甘薯和土壤中的烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法前處理操作簡單，方法靈敏度高，各種性能指標符合農藥殘留試驗準則的相關要求，具備了較高的檢測精度和檢測通量，可為評估烯效唑在甘薯中應用的安全性提供技術支撐。

參考文獻：

[1] 王欣，李強，曹清河，等. 中國甘薯產業和種業發展現狀與未來展望[J]. 中國農業科學，2021，54（3）：483-492.

[2] RADEMACHER W. GROWTH RETARDANTS：effects on gibberellin biosynthesis and other metabolic pathways[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，2000，51：501-531.

[3] 汪寶卿，解備濤，王慶美，等. 甘薯內源激素和化學調控研究進展[J]. 山東農業科學，2010，42（1）：51-56，62.

[4] 胡啟國，劉亞軍，王文靜，等. 烯效唑對甘薯產量和生長發育的影響[J]. 山西農業科學，2018，46（8）：1299-1301，1395.

[5] 解備濤，王慶美，張海燕，等. 植物生長調節劑對甘薯產量和激素含量的影響[J]. 華北農學報，2016，31（1）：155-161.