基于金包覆磁性納米探針的多模態(tài)LFIA檢測(cè)胃癌標(biāo)志物

DOI： 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.003

程杰，袁浩嵐，嚴(yán)家圣，等．基于金包覆磁性納米探針的多模態(tài)LFIA檢測(cè)胃癌標(biāo)志物 ［J］．西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，46（6）： 29-39．

收稿日期：20240327

基金項(xiàng)目：

國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目（62122017）．

作者簡(jiǎn)介：

程杰，博士研究生，主要從事光電生物傳感研究．

通信作者： 郭勁宏，博士，研究員．

摘要：

多模態(tài)側(cè)流免疫層析（Lateral Flow Immunoassay，LFIA）技術(shù)能夠提供不同靈敏度水平的多種檢測(cè)模式，極大地提高了即時(shí)檢測(cè)的實(shí)用性和靈活性，已迅速發(fā)展成為一個(gè)極具潛力的研究方向．研究中合成了一種金包裹的超順磁性納米晶簇（SMNC@Au）多功能納米探針，開發(fā)了用于同時(shí)檢測(cè)胃癌標(biāo)志物胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG）Ⅰ和Ⅱ的多模態(tài)LFIA傳感平臺(tái)．首先通過水熱法合成超順磁性納米晶簇，然后通過種子生長法在其上涂覆一層金殼，最后用4-巰基苯甲酸修飾顆粒表面形成最終的SMNC@Au探針．該多功能探針可以提供比色、磁性和表面增強(qiáng)拉曼散射3種輸出信號(hào)，且能通過磁力實(shí)現(xiàn)分析物的分離和富集，簡(jiǎn)化樣本的處理．基于SMNC@Au納米探針LFIA支持定性比色讀數(shù)以及磁信號(hào)和拉曼信號(hào)的兩種定量讀數(shù)，可適應(yīng)不同的檢測(cè)場(chǎng)景和要求．檢測(cè)結(jié)果表明，PG Ⅰ和PG Ⅱ的視覺檢測(cè)限分別為10 ng/mL和1 ng/mL； 磁性模式的檢測(cè)限分別為0.5 ng/mL和0.1 ng/mL； 拉曼模式的檢測(cè)限分別為0.1 ng/mL和0.05 ng/mL．兩種定量模式的檢測(cè)范圍為1～500 ng/mL（PG Ⅰ）和0.1～100 ng/mL（PG Ⅱ），完全符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)．該測(cè)定表明，所開發(fā)的多模態(tài)LFIA在不同環(huán)境下靈敏檢測(cè)分析物均有較大潛力．

關(guān)" 鍵" 詞：

多模態(tài)探針； 多功能納米材料； 側(cè)流免疫層析； 胃蛋白酶原； 即時(shí)檢測(cè)

中圖分類號(hào)：

TH776

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：16739868（2024）06002911

Multimodal Lateral Flow Immunoassay Based on Gold-Coated

Magnetic Nanoprobes for Gastric Cancer Marker Detection

CHENG Jie1， YUAN Haolan2， YAN Jiasheng1，

GUO Jiuchuan3， GUO Jinhong1

1. School of Sensing Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；

2. College of Computer Science and Cyber Security（Pilot Software College），Chengdu University of" "Technology，Chengdu 610059，China；

3. School of Information and Communication Engineering，University of Electronic Science and" "Technology of China，Chengdu 611731，China

Abstract：

Multimodal lateral flow immunoassay （LFIA） technology provides various detection modes with different sensitivity levels，which significantly enhances the practicality and flexibility of point-of-care testing （POCT），rapidly evolving into a promising research direction．This study synthesized a multifunctional nanoprobe consisting of gold-coated superparamagnetic nanocrystal clusters （SMNC@Au），and developed a multimodal LFIA sensing platform for the simultaneous detection of gastric cancer biomarkers pepsinogen （PG） Ⅰ and Ⅱ．Superparamagnetic nanocrystal clusters （SMNC） were synthesized firstly by the hydrothermal method，followed by coating of a gold shell through the seed growth method，and finally，the surface was modified with 4-MBA to create the SMNC@Au probe．This multifunctional probe can provide three types of output signals： colorimetric，magnetic，and surface-enhanced Raman scattering （SERS），and can achieve separation and enrichment of analytes through magnetic force，simplifying the sample processing．The LFIA based on SMNC@Au probes supports qualitative colorimetric readings as well as two quantitative readings of magnetic and SERS signals，and are adaptable to different detection scenarios and requirements．Detection results indicate that the visual limits of detection for PG Ⅰ and PG Ⅱ are 10 ng/mL and 1 ng/mL，respectively．The magnetic mode detection limits are 0.5 ng/mL for PG Ⅰ and 0.1 ng/mL for PG Ⅱ，while the Raman mode detection limits are 0.1 ng/mL for PG Ⅰ and 0.05 ng/mL for PG Ⅱ．The quantitative detection ranges are 1-500 ng/mL （PG Ⅰ） and 0.1-100 ng/mL （PG Ⅱ），fully meeting the clinical diagnostic standards．This demonstrates that the developed multimodal LFIA has significant potential for sensitive analyte detection in various environments．

Key words：

multimodal probe； multifunctional nanomaterials； LFIA； pepsinogen； POCT

胃癌是死亡率較高的常見癌癥之一，在全球癌癥死亡原因中排名第四［1-2］．據(jù)2020年統(tǒng)計(jì)，全球每年胃癌新增病例109萬人，死亡病例77萬人［3］．近年來，盡管胃癌發(fā)病率有所下降，但預(yù)計(jì)到2040年，這種惡性腫瘤的全球發(fā)病率將會(huì)增加62%［1，4］．癌癥生物標(biāo)志物的量化是控制和管理癌癥最有效的策略之一［5］．胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG）是胃蛋白酶的無活性前體，根據(jù)其生化和免疫特性可以分為PG Ⅰ和PG Ⅱ兩個(gè)亞群．血清中PG Ⅰ、Ⅱ的水平以及它們的比值（PG Ⅰ/Ⅱ）被認(rèn)為是胃癌篩查的有效生物標(biāo)志物，其準(zhǔn)確檢測(cè)可以有效地對(duì)患者的胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分級(jí)，并決定進(jìn)一步的檢查策略［1，6］．傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)方法如高效液相色譜法［7-8］、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法［9］、氣相色譜法［10］等可以提供精確的檢測(cè)結(jié)果，但這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿足大規(guī)模篩查的即時(shí)檢測(cè)需求．因此，針對(duì)胃癌的早期篩查和治療控制建立快速準(zhǔn)確的特異性檢測(cè)方法具有重要意義．

側(cè)流免疫層析（Lateral Flow Immunoassay，LFIA）是一種經(jīng)典的即時(shí)檢測(cè)技術(shù)，因其簡(jiǎn)單、快速、便宜等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于早期疾病診斷、食品安全檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域［11-13］．然而，基于膠體金的傳統(tǒng)LFIA的靈敏度較低，定量檢測(cè)困難，大多用于定性或半定量檢測(cè)．為了提高LFIA的靈敏度，各種納米顆粒被開發(fā)作為探針來增強(qiáng)信號(hào)，如熒光、上轉(zhuǎn)換、磁性和光熱納米材料等［12］．盡管這些納米顆粒的引入使得LFIA可與先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)相媲美，但它們都只能提供單一維度的信息，難以滿足用戶在不同場(chǎng)景中的檢測(cè)需求．例如，時(shí)間分辨熒光LFIA的信號(hào)讀取儀器價(jià)格昂貴，在資源有限的地區(qū)普及受限［14］； 磁性納米材料能夠有效地從復(fù)雜的基質(zhì)中富集目標(biāo)物從而提高檢測(cè)靈敏度，但磁信號(hào)很容易受到外部環(huán)境的干擾，這無疑增加了對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求［15-16］．因此，有必要針對(duì)不同的診斷場(chǎng)景開發(fā)具有多維信號(hào)（多模態(tài)）輸出的多功能納米探針．

LFIA典型的輸出檢測(cè)信號(hào)包括比色、熒光、磁、光熱、拉曼等［11-12，17-22］．其中，比色信號(hào)具有視覺定性解釋的便捷性，是LFIA最優(yōu)秀的特征之一［12，23］．相對(duì)于比色信號(hào)來說，熒光信號(hào)的靈敏度較高，是定量分析最常見的選擇［11-12］．由于磁信號(hào)的低背景噪聲，它被認(rèn)為有潛力實(shí)現(xiàn)比熒光信號(hào)更高的靈敏度，此外，磁性探針能夠提供富集和分離功能［15-16］，但需要特殊的設(shè)備支持［21］．光熱信號(hào)具有高靈敏度，可以通過手持式紅外相機(jī)或普通溫度計(jì)獲得［19，24-25］，并且由于光熱效應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)精確的熱量控制，因此在治療應(yīng)用、抗菌領(lǐng)域引起了巨大的研究興趣［26-27］．表面增強(qiáng)拉曼散射則因?yàn)槠浼ぐl(fā)波長較長，可以有效避免熒光猝滅和光漂白的干擾，可實(shí)現(xiàn)超靈敏的檢測(cè)，被認(rèn)為是一種極具潛力的技術(shù)［28-29］．多模態(tài)LFIA即是利用多功能納米探針實(shí)現(xiàn)各種信號(hào)之間的組合，不僅能夠保持定性模式下便捷的視覺解釋，而且還集成了不同靈敏度水平的各種定量模式以適應(yīng)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，在即時(shí)檢測(cè)的實(shí)用性和靈活性方面有巨大提升，已迅速發(fā)展成為一個(gè)新興的研究和開發(fā)方向［30-32］．例如，Huang等［32］將磁性材料和熒光團(tuán)嵌入納米結(jié)構(gòu)中制備了一種雙功能的納米探針，結(jié)合磁性免疫分離技術(shù)和免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，無需洗脫和孵育步驟即可靈敏檢測(cè)食源性病原體，但該研究沒有將磁信號(hào)作為輸出來進(jìn)一步增加檢測(cè)的彈性．Hu等［17］開發(fā)了一種比色—熒光—磁性納米球多模態(tài)檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)分離富集、多信號(hào)讀出和兩種定量檢測(cè)的多功能集成．Li等［24］利用自組裝的多價(jià)熒光納米抗體和金屬有機(jī)碳納米材料構(gòu)建的比色、熒光和光熱多模態(tài)探針，在黃曲霉毒素B1的檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能．

本研究通過金包裹超順磁性納米晶簇（SMNC@Au）合成了一種集成比色、磁和拉曼信號(hào)的多功能納米探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胃癌標(biāo)志物的多模態(tài)檢測(cè)．探針SMNC@Au是首先通過水熱法合成的超順磁性納米晶簇作為核心，然后通過種子生長法在其上涂覆一層金殼，并在金殼表面結(jié)合4-巰基苯甲酸（4-MBA）作為拉曼報(bào)告分子而形成的．該多功能探針可以提供比色、磁性和拉曼3種信號(hào)，且可以通過磁力實(shí)現(xiàn)分析物的分離和富集，極大簡(jiǎn)化樣本的處理．最終，基于SMNC@Au的LFIA檢測(cè)平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)PG Ⅰ和PG Ⅱ的同時(shí)檢測(cè)，并具有一種視覺定性模式和兩種不同靈敏度的定量模式（圖1）．為了證明其可行性，本研究使用了不同質(zhì)量濃度的樣本組進(jìn)行了性能驗(yàn)證．結(jié)果表明，PG Ⅰ和PG Ⅱ的視覺檢測(cè)限分別為10 ng/mL和1 ng/mL．在磁性模式下，可以將PG Ⅰ和PG Ⅱ的檢測(cè)限分別降低到0.5 ng/mL和0.1 ng/mL．而拉曼模式可以大幅提高PG Ⅰ和PG Ⅱ檢測(cè)的靈敏度，其檢測(cè)限分別為0.1 ng/mL和0.05 ng/mL．磁性模式和拉曼模式可以分別實(shí)現(xiàn)從1 ng/mL到500 ng/mL（PG Ⅰ）和0.1 ng/mL到100 ng/mL（PG Ⅱ）的檢測(cè)范圍，并具有高準(zhǔn)確性，完全符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)．此外，PG Ⅰ和PG Ⅱ之間沒有內(nèi)源性交叉反應(yīng)．基于金包覆磁性納米探針的多模態(tài)LFIA能夠顯著提高即時(shí)檢測(cè)的靈活性和普遍適用性，在LFIA領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?/p>

1" 材料與方法

1.1" 主要材料和儀器

無水氯化鐵（FeCl3）、乙酸鈉、檸檬酸三鈉二水合物（Na3Cit）、鹽酸羥胺、甘氨酸（GLY）、氯金酸（HAuCl4）、4-巰基苯甲酸（4-MBA）購自上海麥克林生化科技有限公司．乙二醇（EG）、硼氫化鈉（NaBH4）、乙醇胺（EA）、2-（N-嗎啉）-乙烷磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司．乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和聚乙烯亞胺（PEI）溶液購自Sigma-Aldrich（上海，中國）．玻璃纖維、吸水墊和基板購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司．硝酸纖維素（NC）膜購自賽多利斯有限公司．磷酸鹽緩沖液（PBS）購自長春賽斯醫(yī)療生物工程有限公司．聚乙烯吡咯烷酮（PVP）購自Diamond生物技術(shù)有限公司．抗人PG Ⅰ mAb K56t1（Anti-PG Ⅰ-D）、抗人PG Ⅰ mAb K50f4（Anti-PG Ⅰ-C）、抗人PG Ⅱ mAb K30t2（Anti-PG Ⅱ-D）、抗人PG Ⅱ mAb K28c9（Anti-PG Ⅱ-C）以及標(biāo)準(zhǔn)品PG Ⅰ mAb、PG Ⅱ mAb均購自南京歐凱生物科技有限公司．兔IgG（R-IgG）和山羊抗兔IgG（G-IgG）購自山東亞瑞特生物科技有限公司．所有實(shí)驗(yàn)均使用去離子水．

SMNC和SMNC@Au的形態(tài)和元素分布使用TESCAN掃描電子顯微鏡（SEM）MIRA3表征．動(dòng)態(tài)光散射（DLS）設(shè)備用于表征納米顆粒的粒徑、Zeta電勢(shì)和聚合物分散性指數(shù)（PDI）．超聲波均質(zhì)器SCIENTZ-IID（購自寧波賽特生物科技有限公司）用于分散顆粒．LakeShore7404振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）用于表征SMNC和SMNC@Au的飽和磁化強(qiáng)度．拉曼分析儀（購自法國侯布里亞公司）用于檢測(cè)拉曼信號(hào)．基于本團(tuán)隊(duì)之前使用的微型磁檢測(cè)設(shè)備［22］檢測(cè)磁信號(hào)．劃膜噴金儀（HM3035）用于在NC膜上固定抗體．測(cè)試條切割機(jī)（WM-100）用于生成側(cè)流免疫層析試紙條．電熱鼓風(fēng)爐用于干燥玻璃纖維和PVC基板．

1.2" 多功能納米粒子的制備

圖1a展示了核殼結(jié)構(gòu)的多功能納米探針SMNC@Au的合成過程．根據(jù)文獻(xiàn)［33］，使用水熱法合成了超順磁性納米晶簇（SMNC）來作為探針的核心．首先向20 mL的乙二醇中加入649 mg無水FeCl3和200 mg Na3Cit，充分?jǐn)嚢韬螅砑? g乙酸鈉繼續(xù)攪拌30 min．隨后，將液體倒入50 mL的高溫反應(yīng)釜中，在205 ℃的條件下反應(yīng)12 h．最后，所得液體用去離子水和乙醇磁吸洗滌5次，得到粒徑均勻的SMNC顆粒（約190 nm）．

金殼的制備采用種子原位生長法［34］．首先將10 mg的SMNC顆粒分散于1 mL的去離子水中，并加入110 μL 10 mg/mL的PEI溶液，超聲處理20 min，得到SMNC@PEI溶液．將1 mL 10 mg/mL的SMNC@PEI溶液加入到6 mL提前制備的Au溶液［35］中，超聲處理30 min后，用去離子水磁吸清洗得到SMNC@Au種子顆粒．隨后將1 mg的SMNC@Au種子分散在10 mL 3 mg/mL PVP和0.5 mg/mL鹽酸羥胺溶液中超聲處理15 min，并在超聲過程中緩慢滴入10 μL 50 mmol/L HAuCl4溶液，繼續(xù)超聲處理15 min．經(jīng)過兩次去離子水洗滌后得到SMNC@Au．采用4-MBA作為表面修飾拉曼報(bào)告分子．將1 mg SMNC@Au溶于2 mL 10 μmol/L 4-MBA乙醇溶液中，振動(dòng)過夜．然后用乙醇洗滌兩次后分散在乙醇中備用．

1.3" 抗體偶聯(lián)

準(zhǔn)備1mg SMNC@Au-4MBA探針，用pH值為 6.5 的MES緩沖液洗滌上述探針兩次并最終分散于1 mL的MES緩沖液中．在緩沖液中加入1.2 mg NHS和1.5 mg EDC并振動(dòng)1 h以活化羧基．然后利用磁鐵將反應(yīng)完的探針析出并分散于1mL 1x PBS 溶液中．100 μL 抗體（Anti-PG Ⅰ-D、Anti-PG Ⅱ-D或R-IgG）加入到溶液中，反應(yīng)4 h用于偶聯(lián)抗體．再將100 μL 10% BSA溶液、200 mg/mL甘氨酸溶液和200 mmol/L乙醇胺溶液加入到上述溶液中，繼續(xù)振動(dòng)1 h．隨后用磁鐵將探針標(biāo)記后的抗體析出并用PBS清洗3次，最后存放于1%BSA溶液中備用．

1.4" 免疫層析試紙條的組裝

免疫層析試紙條由PVC基板、玻璃纖維（樣品墊）、NC膜和吸水紙組成，如圖1b所示．所用的玻璃纖維在由1.21%的Tris、1%的PVP、1%的S9、5%的T-酪蛋白組成的處理液進(jìn)行浸泡，然后放置于37 ℃的鼓風(fēng)干燥箱干燥4 h．利用劃膜噴金儀將0.8 mg/cm的Anti-PG Ⅰ-C、Anti-PG Ⅱ-C和G-IgG固定在NC膜上，分別形成兩條測(cè)試線（T1和T2）和質(zhì)控線（C）．然后將試驗(yàn)卡片放置于37 ℃烘箱中過夜干燥．最后，使用切割機(jī)將試驗(yàn)卡片裁切成寬度為4.05 mm的小條并裝配卡殼，干燥保存．

1.5" 檢測(cè)流程

圖1b展示了基于SMNC@Au的多模態(tài)LFIA的檢測(cè)方案．首先將10 μL樣品滴加到試管中，然后分別滴加質(zhì)量濃度為2 mg/mL的SMNC@Au-Anti-PG Ⅰ-C、4 mg/mL的SMNC@Au-Anti-PG Ⅰ-C和1.5 mg/mL的SMNC@Au-R-IgG各2 μL，混合大約1 min后，使用磁鐵富集顆粒并用移液槍吸出原有液體．隨后將樣品用100 μL 1x PBS稀釋，然后滴加到樣品墊上．15 min后，即可進(jìn)行比色信號(hào)的觀察．20 min后，可用自制的手持設(shè)備進(jìn)行磁性模式檢測(cè)．在排除殘余水分干擾后，可以在拉曼信號(hào)檢測(cè)儀下對(duì)表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）信號(hào)進(jìn)行測(cè)量．

2" 結(jié)果與討論

2.1" 檢測(cè)原理

LFIA是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)特定目標(biāo)分子的識(shí)別和捕獲．可根據(jù)分子量的大小，使用夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法來檢測(cè)目標(biāo)分子．在本研究中，由于PG Ⅰ和PG Ⅱ的分子量較大，故采用更為合適的夾心法．在預(yù)處理樣品時(shí)，探針標(biāo)記的抗體會(huì)先和目標(biāo)結(jié)合形成復(fù)合物．當(dāng)預(yù)制備的樣品溶液被滴加到樣品墊上后，液體將在毛細(xì)管力的作用下沿NC膜流向吸水墊．在此過程中，樣品中包含有PG Ⅰ、PG Ⅱ抗原的復(fù)合物將分別被固定在兩個(gè)測(cè)試線（T1與T2）上的Anti-PG Ⅰ-C和Anti-PG Ⅱ-C捕獲，形成夾心結(jié)構(gòu)．不管樣品中是否存在PG Ⅰ和PG Ⅱ，探針標(biāo)記的R-IgG都將被固定在質(zhì)控線上的G-IgG捕獲．層析完成后，可以通過觀察NC膜上的線條顏色或檢測(cè)磁信號(hào)或SERS信號(hào)的強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子濃度的檢測(cè)．值得注意的是，本研究的試紙條與傳統(tǒng)的免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)不同，通過混合樣品和探針進(jìn)行預(yù)處理，不需要使用結(jié)合墊，從而精簡(jiǎn)了試條的結(jié)構(gòu)．此外，本研究利用探針SMNC@Au磁性在外部磁場(chǎng)下對(duì)樣品進(jìn)行富集和清洗，這極大地提高了檢測(cè)靈敏度．同時(shí)，它也為自動(dòng)化樣品預(yù)處理系統(tǒng)的集成研發(fā)提供了一個(gè)思路．

2.2" 多模態(tài)探針的表征與優(yōu)化

水熱法合成的磁性納米顆粒的粒徑通常為180～300 nm．相比于化學(xué)共沉淀法，水熱法合成的顆粒在磁性、分散性和比表面積方面表現(xiàn)更優(yōu)．因此，我們采用水熱法來合成SMNC作為探針顆粒的核心．所合成的SMNC由粒徑非常小的Fe3O4納米晶體組成，這不僅使SMNC具有超順磁性，而且有利于金殼的涂覆和抗體的結(jié)合．在其他條件不變的情況下，調(diào)整檸檬酸鈉的量可以調(diào)整合成的SMNC粒徑大小［33］，SMNC的飽和磁化強(qiáng)度隨著SMNC粒徑的增大而增加．SMNC的飽和磁化越強(qiáng)，操作起來越容易，產(chǎn)生的信號(hào)越強(qiáng)．但過大的粒徑可能會(huì)在免疫層析過程中引起堵塞并影響LFIA的結(jié)果．使用掃描電子顯微鏡（SEM）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）對(duì)合成的SMNC形貌和尺寸進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2a所示．可以看到，本研究合成的SMNC顆粒的平均粒徑為205 nm，PDI為0.018，尺寸分布均勻，金殼的合成采用種子原位生長法．圖2c顯示了在金殼涂覆過程中納米顆粒的Zeta電位變化．首先，通過超聲波將PEI涂覆在Fe3O4表面．由于PEI中含有大量的胺基團(tuán)，與SMNC相比，SMNC@PEI的Zeta電位急劇增加．隨后，添加金納米顆粒溶液以提供Au種子．金納米顆粒帶負(fù)電，通過靜電吸附在SMNC周圍．此時(shí)，由于仍然有很多胺基團(tuán)暴露出來，納米顆粒的電位只是略微降低．為了得到完整的金殼，以SMNC周圍吸附的金顆粒為種子，加入HAuCl4還原為金，使Au種子不斷生長，最終在SMNC表面形成了一層不均勻的金殼．此時(shí)納米顆粒SMNC@Au上的胺基被金殼完全包圍，Zeta電位大幅降低．圖2b中顯示了SMNC@Au顆粒的形貌和大小，其中的插圖為SEM圖像．此外，對(duì)單個(gè)SMNC@Au進(jìn)行了EDS線性掃描（圖2d），可以發(fā)現(xiàn)金元素的相對(duì)強(qiáng)度在顆粒邊緣較高，在中心較低，而鐵元素的分布與金恰恰相反，這證明金已成功涂覆在SMNC上．最后，測(cè)試了SMNC和SMNC@Au的磁化曲線（圖2e），結(jié)果顯示合成的顆粒無剩磁，飽和磁化強(qiáng)度分別達(dá)到73.9 emu/g和51.5 emu/g．這表明本研究合成的探針保持了高飽和磁化強(qiáng)度．

產(chǎn)生獨(dú)特且強(qiáng)大的拉曼信號(hào)需要兩個(gè)條件： 報(bào)告分子和合適的基底．過去的研究表明，不均勻的膠體金表面可以顯著增強(qiáng)拉曼信號(hào)．本研究選擇4-MBA作為拉曼報(bào)告分子，因?yàn)樗哂?個(gè)優(yōu)勢(shì)： 一是4-MBA含有硫醇基團(tuán)，可以輕易地與金殼反應(yīng)形成金硫鍵，使4-MBA能穩(wěn)定地綁定在SMNC@Au表面； 二是4-MBA的苯環(huán)振動(dòng)可以產(chǎn)生獨(dú)特的拉曼信號(hào)，且能被膠體金增強(qiáng)； 三是4-MBA的生物相容性強(qiáng)，它含有暴露的羧基，激活后可以輕易地與蛋白質(zhì)的胺基團(tuán)結(jié)合．為了證明SMNC@Au的SERS效應(yīng)，本研究分別將0.5 mg的SMNC、SMNC@Au seed和SMNC@Au分散在1 mL的10 μmol/L 4-MBA溶液中，混合均勻后，用乙醇洗滌納米顆粒3次．然后測(cè)試了它們的拉曼信號(hào)，結(jié)果如圖2f所示．4-MBA標(biāo)記的SMNC@Au顆粒在4-MBA特征峰處（1 080 cm-1和1 587 cm-1）顯示出強(qiáng)烈的信號(hào)，證明了其顯著的增強(qiáng)作用．相比之下，SMNC顆粒不能與4-MBA反應(yīng)，在清洗后表面沒有報(bào)告分子附著，因此無法檢測(cè)到4-MBA的特征峰．SMNC@Au種子表面吸附了少量的金納米顆粒，可以與4-MBA結(jié)合，因此在拉曼信號(hào)光譜中可以觀察到弱的特征峰．

2.3" 多模態(tài)LFIA系統(tǒng)檢測(cè)性能

為了驗(yàn)證本研究開發(fā)的比色—磁—拉曼多模態(tài)LFIA系統(tǒng)的性能，使用一系列不同質(zhì)量濃度的PG Ⅰ和PG Ⅱ的溶液樣本進(jìn)行測(cè)試．根據(jù)人血清中PG Ⅰ和PG Ⅱ的質(zhì)量濃度范圍（PG Ⅰ： 32.69～129.35 ng/mL； PG Ⅱ： 3.51～20.68 ng/mL）［36-39］，分別設(shè)置了6個(gè)不同質(zhì)量濃度的PG Ⅰ（1，10，50，100，200，500 ng/mL）和PG Ⅱ（0.1，1，10，20，50，100 ng/mL）的溶液樣本，每個(gè)樣本測(cè)試3次．圖3顯示了層析的比色檢測(cè)結(jié)果．可以看到隨著樣本質(zhì)量濃度的增加，T線的顏色逐漸變深，而C線的顏色基本保持不變．通過肉眼觀察得到PG Ⅰ和PG Ⅱ的視覺檢測(cè)限分別為10 ng/mL和1 ng/mL．

對(duì)于磁信號(hào)的檢測(cè)，采用課題組之前研究自制的微型檢測(cè)儀［22］進(jìn)行分析，該儀器能夠自動(dòng)掃描試紙條上每點(diǎn)的磁強(qiáng)度，從樣本到結(jié)果整個(gè)檢測(cè)時(shí)間低于20 min．記錄不同質(zhì)量濃度的PG Ⅰ和PG Ⅱ樣本的磁模態(tài)信號(hào)，如圖4a和4d所示．在T線和C線的位置可以觀察到明顯的磁信號(hào)峰，C線處的磁信號(hào)強(qiáng)度幾乎不變，而T線的信號(hào)強(qiáng)度隨著樣本質(zhì)量濃度的降低而減小，當(dāng)樣本質(zhì)量濃度過低時(shí)，磁信號(hào)幾乎淹沒在噪聲中．以樣本質(zhì)量濃度為X軸，T/C值為Y軸對(duì)其進(jìn)行了擬合分析，結(jié)果如圖4b和4e所示，兩者呈對(duì)數(shù)關(guān)系．對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，得到了質(zhì)量濃度和T/C值之間的線性擬合曲線（圖4c和4f），其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.973 1（PG Ⅰ）和0.970 1（PG Ⅱ），表明兩者高度相關(guān)．目前，一般將檢測(cè)限（LOD）定義為信噪比3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度．因此，本研究使用空白樣本評(píng)估了磁模態(tài)檢測(cè)下系統(tǒng)的LOD，PG Ⅰ和PG Ⅱ的LOD分別為0.5 ng/mL和0.1 ng/mL．

為了準(zhǔn)確地檢測(cè)SERS信號(hào)，本研究沿試紙條流動(dòng)方向均勻選取3個(gè)區(qū)域進(jìn)行拉曼映射，每個(gè)區(qū)域包含52個(gè)均勻分布的點(diǎn)．以這3個(gè)區(qū)域獲得的1 587 cm-1處的拉曼信號(hào)的平均值作為有效測(cè)量信號(hào)來評(píng)估拉曼模態(tài)的檢測(cè)性能．圖5顯示了拉曼模式下的測(cè)試結(jié)果．可以看到，相比于磁模態(tài)，拉曼檢測(cè)的性能表現(xiàn)更好．PG Ⅰ和PG Ⅱ的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996 0和0.995 5，LOD分別到達(dá)了0.1 ng/mL和0.05 ng/mL．值得注意的是，拉曼模式獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果耗時(shí)更長，大約需要3 h，而磁信號(hào)測(cè)試只需約20 min．

此外，使用特定質(zhì)量濃度的樣本來驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及兩種抗原之間是否存在內(nèi)源性交叉反應(yīng)，每個(gè)樣本測(cè)試5次．比色結(jié)果（圖6）顯示，兩條T線上的顏色深度與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，這證明了PG Ⅰ和PG Ⅱ之間沒有內(nèi)源性交叉反應(yīng)．本研究統(tǒng)計(jì)了兩種定量模式的重復(fù)性和準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示．磁模式下，PG Ⅰ和PG Ⅱ樣本5次重復(fù)測(cè)試的變異系數(shù)（CV）分別為8.4%～18.7%和11.4%～21.0%，準(zhǔn)確度分別為80.3%～108.6%和80.6%～110.1%．而拉曼模式下，PG Ⅰ和PG Ⅱ樣本5次重復(fù)測(cè)試的變異系數(shù)分別為3.4%～6.8%和3.2%～13.2%，準(zhǔn)確度分別為97.7%～104.5%和95.6%～106.0%．

表2列出了本研究方法和一些其他免疫層析方法的性能比較．與其他免疫層析方法相比，磁模式在相近的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了更優(yōu)的檢測(cè)性能，同時(shí)，本研究的儀器操作簡(jiǎn)單且造價(jià)便宜，在社區(qū)篩查和家庭自測(cè)的應(yīng)用環(huán)境中具有巨大的潛力．而拉曼模式的檢測(cè)精度可以媲美實(shí)驗(yàn)室方法，從而滿足醫(yī)院診斷的更高要求．

3" 結(jié)論

本研究成功合成了一種具有磁性和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）效應(yīng)的多功能納米探針，并基于此探針開發(fā)了用于同時(shí)檢測(cè)胃癌標(biāo)志物PG Ⅰ和PG Ⅱ的多模態(tài)LFIA．該檢測(cè)平臺(tái)可以同時(shí)有效地輸出比色、磁和拉曼三重信號(hào)，并同時(shí)提供兩種目標(biāo)分子的一個(gè)定性和兩個(gè)定量的檢測(cè)結(jié)果，允許用戶根據(jù)不同的測(cè)試條件靈活選擇應(yīng)用模式，以適應(yīng)不同的場(chǎng)景和要求．上述研究結(jié)果表明，這種多模態(tài)檢測(cè)方法為側(cè)流免疫層析檢測(cè)提供了更加靈活高效的平臺(tái)．

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責(zé)任編輯" 包穎

崔玉潔