MB-SF/cRGD的合成及其化學動力學抗腫瘤研究

DOI： 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.005

張興莉，焦曉丹，于云龍，等．MB-SF/cRGD的合成及其化學動力學抗腫瘤研究 ［J］．西南大學學報（自然科學版），2024，46（6）： 51-62．

收稿日期：20240325

基金項目：

重慶市魯渝科技協作項目（CSTB2023TIAD-LDX0015）； 國家自然科學基金項目（32071375）； 重慶市高等教育教學改革研究項目（223079）； 國家重點研發計劃項目（2023YFF0713900）； 宜賓市雙城協議保障科研經費科技項目（XNDX2022020013）．

作者簡介：

張興莉，碩士研究生，主要從事納米藥物的結構設計和醫學應用研究．

通信作者： 薛鵬，博士，副教授．

摘要：

化學動力學治療（CDT）具有一定的抗腫瘤效果，但由于腫瘤微環境（TME）的復雜性，導致藥物無法高效積聚到腫瘤部位，從而無法達到滿意的治療效果．先通過水解與提純得到絲素蛋白，再通過酰胺化反應在絲素蛋白表面連接cRGD，最后加入Bi（NO3）·5H2O和MnCl2·4H2O，攪拌過夜獲得MB-SF/cRGD．設計了一種具有主動靶向能力的CDT治療體系，旨在通過提高癌癥細胞藥物攝取率，加強化學動力學治療效果．絲素蛋白作為一種具有良好生物相容性和降解性的藥物載體，可以有效改善藥物遞送系統引起的生物相容性差等問題； MnO2利用內源性H2O2實現化學動力學治療、消耗GSH以及產生O2，發揮抗腫瘤療效．此外，在藥物表面修飾cRGD不但可以減少對正常細胞的毒性，還可以提高化學動力學治療的價值．實驗結果表明： 利用MB-SF本身的活性能達到一定的抗腫瘤療效，在此基礎上，修飾有主動靶向癌細胞的cRGD所獲得的MB-SF/cRGD能達到更好的腫瘤治療效果．

關" 鍵" 詞：

化學動力學治療； 腫瘤微環境； 靶向治療； 活性氧

中圖分類號：

R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2024）06005112

Synthesis of MB-SF/cRGD for Antitumor Chemodynamic Therapy

ZHANG Xingli1， JIAO Xiaodan1， YU Yunlong2，

ZHONG Li3， KANG Yuejun1， XUE Peng1

1. School of Materials and Energy，Southwest University，Chongqing 400715，China；

2. Burns Research Institute，The First Affiliated Hospital of the Army Medical University，Chongqing 400038，China；

3. School of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China

Abstract：

Chemodynamic therapy （CDT） has shown some therapeutic effects toward tumors，but due to the complexity of the tumor microenvironment （TME），the drugs do not accumulate efficiently at the tumor site，thus failing to achieve a satisfactory therapeutic effect．In this study，silk fibroin was obtained by hydrolysis and purification．Then，cRGD was attached to the surface of the fibroin protein by amidation reaction．Finally，Bi（NO3）·5H2O and MnCl2·4H2O were added and stirred overnight to obtain MB-SF/cRGD．A hybrid system with active targeting ability was designed to enhance the therapeutic effect of CDT by increasing the cellular uptake rate of nanodrug．As drug carriers with good biocompatibility and degradability，silk fibroin can effectively improve the biocompatibility and other safety issues caused by drug delivery system．MnO2 utilizes endogenous H2O2 for triggering CDT，GSH depletion and O2 production to promote antitumor efficacy．In addition，the modified cRGD on the drug surface reduces toxicity to normal cells and increases the efficacy of CDT．Experimental results show that MB-SF alone can achieve a certain level of antitumor effect，but an improved tumor treatment effect can be achieved by MB-SF/cRGD，due to the modified cRGD can actively target the cancer cells．

Key words：

chemodynamic therapy； tumor microenvironment； targeted therapy； reactive oxygen species

據統計，2018年全球新增1810萬癌癥病例，但只有亞洲和非洲的癌癥死亡率（分別為57.3%和7.3%）高于癌癥發病率（分別為48.4%和5.8%），其中乳腺癌是全球第二大致死癌癥類型［1］．納米技術的快速發展帶動著納米生物技術的進步，其中納米材料的研究領域已擴展到農業、能源、醫療等行業［2-5］．化學動力學治療（Chemodynamic Therapy，CDT）作為近年來新興的一種“特洛伊木馬”抗腫瘤策略，即鐵、銅、錳和鈷基利用Fenton或類Fenton效應產生高效率活性氧，誘導細胞凋亡．MnO2納米粒子本身可以利用類Fenton效應產生最具毒性的羥基自由基（·OH），但由于腫瘤內部H2O2不足等原因，導致CDT對腫瘤治療效果有限．由于MnO2還能消耗腫瘤細胞中重要的還原性物質谷胱甘肽（GSH），因此大大提高了CDT療效［6-10］，并同時產生O2緩解腫瘤乏氧微環境［4］．此外，體系中加入的絲素蛋白作為腫瘤治療的天然藥物遞送載體，具有良好的生物相容性、副作用小以及易于降解等優點［11］．

由于納米材料本身能對腫瘤起到增強的滲透性和滯留性（EPR）效應以及易于功能化、高生物相容性等原因，納米藥物成為腫瘤治療的熱議話題．但是由于單一的納米材料無法主動靶向腫瘤，因此藥物無法高效積累到腫瘤部位并發生作用［12-14］．近年來，研究發現通過在納米材料表面修飾各種特異性抗體、整合素配體以及肽等，能夠實現特異性靶向癌細胞［15-16］．據報道，cRGD能與癌細胞表面過表達的整合素αVβ3特異性結合［17］．因此，在MB-SF上修飾cRGD可以有效提高藥物利用率［15］．基于此，本研究構建的MB-SF/cRGD化學動力學治療體系，在腫瘤治療領域具有一定應用潛力．

1" 實驗部分

1.1" 實驗儀器與試劑

儀器： 動態光散射粒度儀（Nano ZS90），透射電子顯微鏡（JEM-2100），紫外可見分光光度計（UV-2550），多功能酶標儀（Tecan Infini Spark-10M），共聚焦激光顯微鏡（Zeiss LSM 800），流式細胞儀（NovoCyte 2060R），倒置熒光顯微鏡（IX73），X射線光電子能譜儀（ESCALAB 250Xi），傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR Nicolet 6700）．

試劑： Bi（NO3）·5H2O（AR），MnCl2·4H2O（AR），CaCl2（AR），HNO3（AR），NaOH（AR），NHS（AR），EDC（AR）以及乙醇、DMSO等，直接用于實驗．

1.2" MB-SF、MB-SF/cRGD的合成

1.2.1" 絲素蛋白的制備

將蠶繭剪成小塊，在0.5%的Na2CO3溶液中煮沸60 min，之后用大量的去離子水沖洗除去絲膠，并將脫下的脫膠絲素在常溫下干燥．在三元體系中（氯化鈣/乙醇/水）溶解脫膠絲素（0.8%），各組分的摩爾比為1∶2∶8，并將其放在90 ℃恒溫水浴鍋中溶解2 h．趁熱將絲素混合溶液進行抽濾除雜，用分子量為3.5 kDa的纖維素半透膜透析3天，獲得絲素蛋白溶液，取部分凍干定量，放入4 ℃冰箱儲存［18］．

1.2.2" SF/cRGD的合成

取50 mg的絲素蛋白溶液，加入NHS和EDC（比例為1∶6∶6）活化1 h，再加入0.2 mg cRGD溶液（1 mg/mL），室溫避光攪拌12 h，即獲得SF/cRGD．

1.2.3" MB-SF和MB-SF/cRGD的合成

先提前將19.4 mg的Bi（NO3）·5H2O溶于2 mL的HNO3溶液中，并將15.76 mg的MnCl2·4H2O溶于2 mL的去離子水中．隨后，將Bi（NO3）·5H2O加入到50 mg的絲素蛋白溶液或SF/cRGD溶液中，并用NaOH調節pH值到12，再加入MnCl2·4H2O，置于37 ℃下攪拌12 h，轉移至透析袋中透析24 h，得到產物MnO2/Bi2S3-SF以及MnO2/Bi2S3-SF/cRGD（分別簡寫為MB-SF、MB-SF/cRGD），置于4 ℃儲存［19］．

1.3" 材料的表征

用透射電子顯微鏡觀察MB-SF/cRGD納米材料的形貌．通過傅里葉變換紅外光譜儀檢測各樣品的特征峰．通過動態光散射粒度儀測量納米粒子的流體動力學尺寸以及表面電勢．MB-SF/cRGD的化學元素以及元素價態由X射線光電子能譜儀表征．

1.4" 體外性能分析

亞甲基藍（MB）被·OH氧化后在655 nm波長處有特征吸收峰，可用于測試過氧化物酶活性．在25 mmol/L NaHCO3緩沖體系中，使用MB（10 μg/mL）探究MB-SF/cRGD在不同體系中產·OH的性能．檢測MB-SF/cRGD分解H2O2產生O2性能的具體步驟如下： 將MB-SF/cRGD溶解于磷酸鹽緩沖溶液，設置一系列濃度梯度后，加入10 mmol/L H2O2，使用溶解氧測定儀檢測溶液中的氧濃度，利用GSH能與2-硝基苯甲酸（DTNB）反應生成黃色GSSG，檢測谷胱甘肽過氧化物酶活性； 將DTNB溶解在磷酸緩沖溶液（pH=8，EDTA 1 mmol/L）中，終濃度為4 mg/mL； 將MB-SF/cRGD分散在0.2 mg/mL GSH中，隨后加入200 μL DTNB，室溫孵育0～4 h，利用紫外可見分光光度計測量．

1.5" 生物相容性

使用鼠源成纖維細胞（L929）評估MB-SF/cRGD對小鼠正常細胞的生物相容性．實驗步驟為： 將L929細胞以1×104每孔接種到96孔板中（37 ℃，12 h）； 隨后使用不同濃度MB-SF/cRGD與細胞共培養24 h，棄去培養液，PBS洗滌3遍； 接著每孔加入200 μL MTT（0.5 mg/mL）培養4 h，棄去上清液，加入200 μL DMSO，震蕩15 min使紫色甲臜完全溶解； 最后使用酶標儀檢測每孔在490和630 nm波長處的吸光度（OD值）．按照式（1）計算每孔細胞存活率：

細胞存活率（%）=（OD490-OD630）加藥處理組細胞/（OD490-OD630）未加藥處理組細胞 （1）

溶血率實驗是先取BALB/c雌鼠眼眶血，使用PBS離心洗滌3遍（3 000 rpm，5 min）．然后，將紅細胞按4%（v/v）的比例與一系列濃度梯度的MB-SF/cRGD（PBS體系）混合．同時，設置陽性對照組，將去離子水與紅細胞混合．在37 ℃條件下反應6 h后，10 000 rpm離心10 min，取上清液在酶標儀上檢測570 nm處的吸光度．然后根據式（2）計算小鼠細胞溶血率：

溶血率（%）=［（OD樣品-OD陰性）/（OD陽性-OD陰性）］×100%（2）

1.6" 體外細胞毒性

使用小鼠乳腺癌腫瘤細胞（4T1）評估MB-SF/cRGD對腫瘤細胞的毒性．將4T1癌細胞以1×104個細胞每孔接種到96孔板中（37 ℃，12 h），然后用不同濃度MB-SF/cRGD與細胞分別共培養24，48，72 h，后續按照MTT法測量細胞活力．

1.7" 細胞攝取

為了分析cRGD對腫瘤細胞攝取的影響，使用二氫卟吩e6（Ce6）作為熒光標志物修飾納米粒子．具體操作如下： 先將30 mg EDC和20 mg NHS溶解于MB-SF或MB-SF/cRGD的水溶液體系中（1 mg/mL），并在攪拌狀態下進行30 min的羧基自由基活化； 使用去離子水離心洗滌3遍后，將沉淀物與Ce6（1 mg/mL）混合，室溫避光攪拌24 h； 最后通過離心洗滌獲得與Ce6共價連接的MB-SF和MB-SF/cRGD，并使用流式細胞儀檢測癌細胞對其的吞噬效果．

將4T1細胞接種到12孔板（5×104個細胞/孔）中，在37 ℃培養箱培養12 h．使用濃度為100 μg/mL的MB-SF、MB-SF/cRGD的培養液與不同孔細胞分別共培養0～6 h．然后使用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，PBS清洗后，重懸于含有Ca2+、Mg2+的PBS中，使用流式細胞儀進行單個細胞熒光強度分析．

1.8" 產活性氧能力和GSH消耗能力

為了檢測MB-SF/cRGD在癌細胞中產活性氧性能，將4T1癌細胞接種到12孔板（1×105個細胞/孔）中培養過夜，加入濃度均為100 μg/mL的MB-SF、MB-SF/cRGD材料，共培養8 h，空白對照組加入等體積PBS．共培養結束后使用PBS洗滌3遍，與DCFH-DA（10 μM）處理30 min，再用PBS洗滌3遍，用DAPI染色10 min，進行共聚焦拍照．

為檢測細胞水平MB-SF/cRGD對谷胱甘肽的消耗能力，將4T1細胞與MB-SF、MB/cRGD在96孔板（1×104細胞/孔）中共培養8 h，然后加入50 μL提前預冷的6.5% TCA，在4 ℃條件下裂解細胞30 min，隨后加入250 μL的DTNB（4 mg/mL），避光震蕩5 min，最后使用酶標儀檢測412 nm波長處的吸光度．

1.9" ICD生物標志物檢測

為進一步研究MB-SF/cRGD的抗腫瘤效果，通過免疫熒光評估ICD生物標志物CRT和HMGB1．具體步驟如下： 將12孔板（3×105個細胞/孔）中的4T1細胞在37 ℃條件下培養過夜，后續步驟與檢測活性氧的處理步驟相似； 然后使用多聚甲醛（4%）固定細胞15 min，再加入Triton X-100（0.1%）孵育15 min，使用BSA（1%）進行封閉1 h； 隨后使用CRT（2 μg/mL）或HMGB1（2 μg/mL）一抗與處理過的細胞孵育過夜（4 ℃），然后繼續在4 ℃條件下用攜帶有Cy3或FITC（2 μg/mL）的二抗孵育4 h； 經DAPI染色10 min后，使用共聚焦顯微鏡分析不同組間熒光差異．

另一方面，通過ATP試劑盒檢測細胞內ATP釋放情況，將處理后的懸浮細胞（與GSH消耗能力實驗處理相似）使用ATP裂解液在冰上裂解1 h，然后在4 ℃條件下12 000 rpm離心10 min，取上清，并按照說明書步驟檢測ATP含量．

1.10" 活/死細胞染色

為了直觀觀察MB-SF/cRGD對癌細胞的殺傷效果，將4T1細胞接種到12孔板（2×105個細胞/孔）中培養12 h后，分別加入等體積PBS、MB-SF、MB-SF/cRGD共培養．隨時觀察細胞形態，待細胞變為圓形且大小均一時，按照Calcein AM/PI試劑盒步驟對細胞進行染色．清洗過后使用倒置熒光顯微鏡拍照．

1.11" 建立4T1皮下瘤模型

所有動物實驗流程均通過西南大學動物保護和使用委員會的批準，并遵循《實驗動物 動物實驗通用要求》（GB/T 35823-2018）．購買4周齡小鼠，飼養1周后，將對數生長時期的4T1細胞注射進入雌性BALB/c小鼠右側后背皮下，等待1周左右，腫瘤體積達到200 mm3左右，成功構建實體瘤模型．根據下式計算腫瘤體積：

V=0.5×l×w2（3）

式中： V為腫瘤體積； l為腫瘤最長直徑； w為腫瘤最短直徑．

1.12" 體內抗腫瘤

在動物水平上研究MB-SF/cRGD對小鼠腫瘤生長的抑制作用．將小鼠分為生理鹽水、MB-SF、MB-SF/cRGD 3組，在第0、5 d分別靜脈注射生理鹽水100 μL，MB-SF、MB-SF/cRGD組按照濃度為5 mg/kg注射100 μL到小鼠體內，每兩天測量一次腫瘤體積．到第14 d時，將所有老鼠進行安樂死處理．取小鼠實體腫瘤稱重，并將腫瘤用于Hamp;E染色，Ki67、CRT、HMGB1免疫組化染色以及TUNEL、CD8+免疫熒光染色等組織學病理分析．根據腫瘤生長抑制率（TGI）計算腫瘤抑制生長程度：

RTGI=（VC-VT）/VC×100%（4）

式中： RTGI為腫瘤抑制生長程度； VC為注射生理鹽水組小鼠的腫瘤體積； VT為不同藥物處理組的腫瘤體積．

2" 結果與討論

2.1" 形貌、物相和元素分析

圖1a是合成MB-SF/cRGD納米粒子透射電子顯微鏡（TEM）圖片，由此可以看出由三步合成的MB-SF/cRGD呈現出不規則形狀且粒徑小于200 nm．圖1b是各樣品的傅里葉變換紅外光譜圖，MB-SF/cRGD具有酰胺V帶（N-H，665 cm-1）、酰胺III帶（C-H，1 228 cm-1）以及酰胺Ⅰ帶（C=O，1 640 cm-1），與絲素蛋白（SF）的特征峰完全符合，證實了MB-SF/cRGD中包含有絲素蛋白［20-21］．

圖2a、2b分別是MB-SF與MB-SF/cRGD納米粒子在純水中的流體動力學粒徑圖以及電位圖，MB-SF修飾cRGD后，MB-SF/cRGD的流體動力學直徑比MB-SF增大約20 nm．由圖2b可以看出，MB-SF修飾cRGD后電位從-13.4 mV變為-5.6 mV．以上結果均說明了cRGD成功共價連接在MB-SF表面從而改變納米材料粒徑大小以及電位．

圖3是MB-SF/cRGD的X射線光電子能譜圖（XPS）．圖3a是Bi 4f的核心級XPS能譜圖，164.8 eV和159.4 eV結合能分別對應Bi 4f5/2和Bi 4f7/2，與其相對應的是Bi3+［22］．圖3b是Mn 2P的核心級XPS能譜圖，641.8 eV和653.3 eV結合能分別對應Mn 2p3/2與Mn 2p1/2，與其相對應的是Mn2+/Mn3+［23-24］．全范圍的XPS能譜圖證實了MB-SF/cRGD由Mn、Bi、C、S、O、N和O元素組成（圖3c）．上述數據證明了Bi2S3/MnO2-SF/cRGD納米材料成功合成．

2.2" 性能分析

根據上述數據表明MB-SF/cRGD納米藥物中MnO2具有+2和+3價，因此MB-SF/cRGD具有多種酶活性，包括CAT、POD．這對O2和·OH的產生、GSH的消耗至關重要．在富含HCO-3的情況下，Mn2+能夠發揮類Fenton效應，發生MnO2+HCO-3+H2O2→·OH+H2O反應，從而分解內源性H2O2產生·OH［23］．因此，在探究MB-SF/cRGD產ROS的性能實驗中采用25 mmol/L NaHCO3緩沖液體系．首先，為探究MB-SF/cRGD在不同環境中產活性氧的效率，按Control、H2O2、MB-SF/cRGD、MB-SF/cRGD+GSH、MB-SF/cRGD+GSH+H2O2、MB-SF/cRGD+H2O2分組，其中MB-SF/cRGD質量濃度為200 μg/mL，使用MB試劑檢測·OH產生情況，可以明顯看到MB-SF/cRGD+H2O2組活性氧產率最高，Control、H2O2、MB-SF/cRGD、MB-SF/cRGD+GSH組幾乎沒有產生活性氧，MB-SF/cRGD+GSH+H2O2組由于GSH的存在產活性氧效率大大降低（圖4a）．然后為探究不同質量濃度MB-SF/cRGD產O2的效率，配置了0、50、100、150、200 μg/mL的MB-SF/cRGD溶液，并在室溫條件下檢測溶解氧產率與時間的關系．由圖4b可以看出，溶解氧產率隨著MB-SF/cRGD濃度增大而升高．此外，MB-SF/cRGD在腫瘤微環境中還會發生2GSH+MnO2+2H+→GSSG+Mn2++2H2O反應．因此，使用DTNB試劑檢測MB-SF/cRGD與還原性谷胱甘肽分別孵育0，0.5，1，2，4 h后，在412 nm波長處的吸光度．由圖4c可以看出，MB-SF/cRGD隨時間增加消耗越來越多的GSH，證明了MB-SF/cRGD具有類谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，可以消耗內源性GSH．

2.3" 細胞水平抗腫瘤性能分析

上述實驗結果表明本研究所構建的MB-SF/cRGD體系具有良好的活性氧生成能力、產生氧氣的能力以及消耗GSH能力．于是進一步對MB-SF/cRGD的生物應用展開研究．首先，為了確保MB-SF/cRGD在生物應用時的安全性，進行了生物相容性實驗．分別將0，12.5，25，50，100，200 μg/mL質量濃度的MB-SF/cRGD與L929細胞共培養24 h．當藥物濃度達到200 μg/mL時，細胞存活率仍然高達70%以上，根據此數據可以推出MB-SF/cRGD具備良好的生物相容性（圖5a）．相比之下，在相同藥物劑量以及時間處理下，小鼠乳腺癌細胞（4T1）活力大大降低．當濃度為200 μg/mL，處理時間為72 h時，大量腫瘤細胞被殺死，存活率僅24.3%（圖5b）．這種特異性抗腫瘤特性可能是由于cRGD介導的主動靶向腫瘤以及Mn2+/Mn3+對腫瘤內部高H2O2水平引發的CDT效應等原因［25-26］．

緊接著分別將連接有Ce6的MB-SF和MB-SF/cRGD與4T1細胞按0，0.5，1，2，4，6 h共培養后，再使用流式細胞儀取樣分析．從圖6a、6b可以看出，MB-SF/cRGD-Ce6在與細胞共培養0.5 h時，幾乎所有細胞都已成功吞噬納米材料，而MB-SF-Ce6還有一部分細胞未吞噬材料．由此成功證明了cRGD主動靶向腫瘤細胞的特性增強了4T1細胞對MB-SF/cRGD納米材料的吞噬效果，并由此推斷較強的吞噬效果有利于提高藥物對腫瘤的治療效果［27］．

為驗證這個推論，實驗分為Control、MB-SF、MB-SF/cRGD 3組進行研究．從圖7a、7b可以看出，修飾了cRGD的MB-SF/cRGD比MB-SF產生更多的ROS，消耗了細胞內更多GSH．證明了cRGD增強了4T1細胞對納米材料的吞噬，從而提高了產活性氧效率以及消耗谷胱甘肽的能力．因此，在這一研究基礎上，推斷MB-SF/cRGD與MB-SF相比，MB-SF/cRGD對腫瘤治療效果有著顯著的提升（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）．

據報道，腫瘤細胞在受到藥物刺激時，會引發免疫原性細胞死亡（ICD）．在免疫原性細胞死亡過程中，會有一系列損傷相關分子（DAMPs）發生變化．鈣網蛋白（CRT）從內質網遷移到細胞表面，釋放“eat”信號，被免疫細胞識別進而殺傷腫瘤細胞．高遷移率族蛋白B1（HMGB1）從細胞核易位到細胞質，起到促進免疫細胞成熟的功效．三磷酸腺苷（ATP）從細胞中釋放出來．圖8a可以明顯看到MB-SF/cRGD導致4T1細胞中大量CRT釋放出來．MB-SF/cRGD組比MB-SF組也發生了更顯著的HMGB1易位（圖8b）．圖8c表明經過MB-SF/cRGD藥物處理后，細胞內ATP含量較少，表明細胞中更多的ATP釋放出去．上述數據均表明4T1細胞在MB-SF/cRGD藥物刺激下，激發了比MB-SF組更強的免疫原性細胞死亡（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）［28］．

為了更直觀地觀察細胞水平抗腫瘤效果，使用鈣黃綠素乙酰甲酯對活細胞進行染色（綠色），使用碘化丙啶對死細胞進行染色（紅色），用熒光顯微鏡記錄并觀察樣品，結果如圖9所示．

圖9可以直觀地看到，MB-SF/cRGD藥物處理組的紅色熒光數量最多，同時綠色熒光也是最少的．表明MB-SF/cRGD殺死癌細胞數量最多，MB-SF效果次之．該實驗結果與上述活性氧、胞內谷胱甘肽以及ICD生物標志物實驗結果一致．以上數據表明所構建的MB-SF/cRGD體系因為cRGD的存在，在細胞水平高效發揮化學動力學治療療效，提高了細胞水平腫瘤治療效果．

2.4" 動物水平抗癌性能分析

在動物水平探究了MB-SF/cRGD對小鼠血液的生物相容性．將0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度梯度的MB-SF/cRGD與紅細胞共培養．根據比濁法測定的結果顯示，MB-SF/cRGD濃度為200 μg/mL時，溶血率為1.45%，遠小于5%，這表明MB-SF/cRGD對小鼠血液也具有良好的生物相容性（圖10）．

為進一步驗證MB-SF/cRGD藥物的抗腫瘤性能，在動物水平上作進一步的研究．在2周的治療時間里記錄小鼠腫瘤體積變化以及治療結束后離體腫瘤重量．圖11a可以看出MB-SF/cRGD組腫瘤不僅與生理鹽水組形成鮮明對比，與MB-SF治療組也形成顯著差異．此外，與生理鹽水組和MB-SF組相比，在腫瘤體積方面MB-SF/cRGD起到了較強的腫瘤治療效果．根據式（4）計算腫瘤生長抑制率（TGI），到第14 d時MB-SF/cRGD藥物處理組TGI指數高達90.9%（圖11b）（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）．

將小鼠實體瘤用于Hamp;E、TUNEL、Ki67、CRT、HMGB1、CD8+染色并進行組織學分析（圖12）．在Hamp;E切片中，MB-SF/cRGD藥物處理組切片表現出最嚴重的組織損傷，表現為嚴重的核破裂、核溶解．在TUNEL以及Ki67切片中，MB-SF/cRGD藥物處理組分別表現出高水平的綠色熒光凋亡信號和陽性細胞的顯著減少，證明了MB-SF/cRGD抑制腫瘤細胞生長和侵襲的能力顯著提升．此外，在動物水平上也激發了強烈的免疫原性細胞死亡（ICD），CRT和HMGB1切片數據分別表明MB-SF/cRGD藥物處理組可以引發顯著的CRT暴露、HMGB1易位［29］．CD8+細胞作為免疫的主力軍，發揮了重要作用．從CD8+免疫熒光切片可以看出，MB-SF/cRGD藥物處理組CD8+免疫細胞表達更多，說明修飾了cRGD能有效激發免疫應答，進行高效腫瘤治療［30］．

3" 結論

本研究構建的MB-SF/cRGD納米材料分別在細胞以及動物水平上進行腫瘤治療性能研究，并且從多角度證明MB-SF/cRGD與MB-SF相比抗腫瘤效果更加顯著．由于MB-SF/cRGD修飾有cRGD，因此賦予了該材料主動靶向癌細胞的功能，實現了高效的ROS產率以及GSH消耗能力，從而擊潰腫瘤細胞的抗氧化系統．同時消耗內源性H2O2產生O2，緩解了內部乏氧．當材料濃度僅為200 μg/mL時，腫瘤細胞死亡率高達75.7%．在動物水平，MB-SF/cRGD濃度僅為5 mg/kg時，腫瘤抑制率達到90.9%．此外，MB-SF/cRGD復合體系中還含有Bi2S3，Bi2S3由于具有1.33 eV帶隙寬度，成為一種優良的光熱劑，可用于抗腫瘤光熱治療．但在本文中并未對Bi2S3功能開展進一步的探究，在未來的研究中會深入探索．總之，本文報道的MB-SF/cRGD體系能夠通過主動靶向癌細胞實現高效的化學動力學治療，在腫瘤治療領域有巨大的應用潛力．

參考文獻：lt;參考文獻起gt;

［1］

BRAY F，FERLAY J，SOERJOMATARAM I，et al．Global Cancer Statistics 2018： GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries ［J］．CA： A Cancer Journal for Clinicians，2018，68（6）： 394-424．

［2］" 陶建波，伍浩天，王藝鋼，等．硅肥和納米土墑材料配施對苦蕎倒伏的影響 ［J］．西南大學學報（自然科學版），2023，45（9）： 25-35．

［3］" 馬雪瑩，李明．Ce摻雜Ni2P納米片的電子調控促進高效析氧 ［J］．西南大學學報（自然科學版），2024，46（1）： 188-195．

［4］" 陸娟，殷琪峰，胡珊珊，等．Cu2-xSe@MIL-100（Fe）-DOX的合成及多模式抗腫瘤研究 ［J］．西南大學學報（自然科學版），2022，44（1）： 108-117．

［5］" 許子藝，樊莉，盧光照，等．尺寸可調納米顆粒的抗腫瘤作用研究進展 ［J］．中國藥學雜志，2023，58（20）： 1814-1822．

［6］" WANG X W，ZHONG X Y，LIU Z，et al．Recent Progress of Chemodynamic Therapy-Induced Combination Cancer Therapy ［J］．Nano Today，2020，35： 100946．

［7］" ZHAO P R，LI H Y，BU W B．A Forward Vision for Chemodynamic Therapy： Issues and Opportunities ［J］．Angewandte Chemie （International Ed in English），2023，62（7）： e202210415．

［8］" YANG G B，XU L G，CHAO Y，et al．Hollow MnO2 as a Tumor-Microenvironment-Responsive Biodegradable Nano-Platform for Combination Therapy Favoring Antitumor Immune Responses ［J］．Nature Communications，2017，8（1）： 902．

［9］" LIN L S，SONG J B，SONG L，et al．Simultaneous Fenton-Like Ion Delivery and Glutathione Depletion by MnO2 -Based Nanoagent to Enhance Chemodynamic Therapy ［J］．Angewandte Chemie （International Ed in English），2018，57（18）： 4902-4906．

［10］NIU B Y，LIAO K X，ZHOU Y X，et al．Application of Glutathione Depletion in Cancer Therapy： Enhanced ROS-Based Therapy，Ferroptosis，and Chemotherapy ［J］．Biomaterials，2021，277： 121110．

［11］YU B，LI Y L，LIN Y X，et al．Research Progress of Natural Silk Fibroin and the Application for Drug Delivery in Chemotherapies ［J］．Frontiers in Pharmacology，2023，13： 1071868．

［12］BJRNMALM M，THURECHTK J，MICHAEL M，et al．Bridging Bio-Nano Science and Cancer Nanomedicine ［J］．ACS Nano，2017，11（10）： 9594-9613．

［13］SHI D，ZHUANG J Y，FAN Z X，et al．Self-Targeting Nanotherapy Based on Functionalized Graphene Oxide for Synergistic Thermochemotherapy ［J］．Journal of Colloid and Interface Science，2021，603： 70-84．

［14］王英杰，高平，孫萌，等．鉍基納米藥物系統的抗腫瘤診療及生物安全性研究進展 ［J］．藥學學報，2023，58（4）： 852-855．

［15］馬麗，蔡在龍，王慶蓉，等．靶向抗腫瘤肽的構建及其生物學活性研究 ［J］．中國生化藥物雜志，2010，31（1）： 19-22．

［16］SONG Z W，LIN Y，ZHANG X，et al．Cyclic RGD Peptide-Modified Liposomal Drug Delivery System for Targeted Oral Apatinib Administration： Enhanced Cellular Uptake and Improved Therapeutic Effects ［J］．International Journal of Nanomedicine，2017，12： 1941-1958．

［17］FAN X，YUAN Z T，SHOU C T，et al．CRGD-Conjugated Fe3O4@PDA-DOX Multifunctional Nanocomposites for MRI and Antitumor Chemo-Photothermal Therapy ［J］．International Journal of Nanomedicine，2019，14： 9631-9645．

［18］田娟，楊華，馬林，等．蠶絲不同溶解方法的研究 ［J］．化學世界，2011，52（11）： 665-668．

［19］LI T H，SHI S Q，LU X S，et al．A Versatile Bi2S3/MnO2 Based Nano-Theranostic Agent for Triple-Modal Imaging Guided Photothermal/Photodynamic Synergistic Therapy ［J］．Chinese Journal of Analytical Chemistry，2021，49（11）： 19-27．

［20］巢夢穎，凌新龍，劉雨鷺，等．絲素蛋白/海藻酸鈉水凝膠的制備及其釋藥性能 ［J］．紡織高校基礎科學學報，2023，36（6）： 22-29．

［21］應勇，汪蕓萱，郭蕾，等．再生絲素蛋白在Na+溶液中的分子聚集行為及生物學性能研究 ［J/OL］．食品工業科技，（2024-01-31） ［2024-03-25］．https： //doi.org/10.13386/j.issn1002-0306.2023090155．

［22］葉夢穎，于佳匯，王彤彤，等．Bi2S3/CdS/TiO2納米復合材料的制備及對304不銹鋼的光生陰極保護性能研究 ［J］．中國腐蝕與防護學報，2024，44（2）： 372-380．

［23］HUANG J S，LI Y C，ZHANG L，et al．A Platinum Nanourchin-Based Multi-Enzymatic Platform to Disrupt Mitochondrial Function Assisted by Modulating the Intracellular H2O2 Homeostasis ［J］．Biomaterials，2022，286： 121572．

［24］周國霖，謝水波，胡戀．MnO2/Ti3C2TX復合劑對水中U（VI）的吸附性能與機制 ［J/OL］．復合材料學報，（2024-02-07） ［2024-03-25］．https： //doi.org/10.13801/j.cnki.fhclxb.20240205.004．

［25］JIAO X D，SUN L H，ZHANG W，et al．Engineering Oxygen-Deficient ZrO2-x Nanoplatform as Therapy-Activated Immunogenic Cell Death （ICD） Inducer to Synergize Photothermal-Augmented Sonodynamic Tumor Elimination in NIR-II Biological Window ［J］．Biomaterials，2021，272： 120787．

［26］FU S Y，YANG R H，REN J J，et al．Catalytically Active CoFe2O4 Nanoflowers for Augmented Sonodynamic and Chemodynamic Combination Therapy with Elicitation of Robust Immune Response ［J］．ACS Nano，2021，15（7）： 11953-11969．

［27］CHEN D，LI B W，CAI S H，et al．Dual Targeting Luminescent Gold Nanoclusters for Tumor Imaging and Deep Tissue Therapy ［J］．Biomaterials，2016，100： 1-16．

［28］曾宇祺，郭麗娟，楊森．免疫原性細胞死亡在口腔腫瘤中的初步機制 ［J］．腫瘤預防與治療，2023，36（4）： 340-348．

［29］YU H L，LI Y C，ZHANG Z Y，et al．Silk Fibroin-Capped Metal-Organic Framework for Tumor-Specific Redox Dyshomeostasis Treatment Synergized by Deoxygenation-Driven Chemotherapy ［J］．Acta Biomaterialia，2022，138： 545-560．

［30］金晶，吳水蓮，郭可?。Y腸癌患者外周血CD4+、CD8+細胞PD-1表達水平及其臨床意義 ［J］．浙江創傷外科，2024，29（1）： 7-9，13．

責任編輯" 湯振金"

柳劍