菜豆EST-SSR分子標記開發及部分種質分子身份證構建

DOI： 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.006

付陽云，文曉鵬．菜豆EST-SSR分子標記開發及部分種質分子身份證構建 ［J］．西南大學學報（自然科學版），2024，46（6）： 63-73．

收稿日期：20240208

基金項目：

貴州2023年省級財政種業發展項目（黔科合中引地〔2023〕009）．

作者簡介：

付陽云，碩士研究生，主要從事種質鑒定研究．

通信作者： 文曉鵬，博士，教授．

摘要：

為開發菜豆高效新型分子標記，從分子水平解析菜豆重要種質的遺傳多樣性及親緣關系，基于菜豆轉錄組數據，設計EST-SSR引物，建立EST-SSR標記系統．利用PCR篩選出多態性引物，結合毛細管電泳，分析81份菜豆種質的親緣關系，并構建分子身份證．通過MISA軟件，在菜豆轉錄組數據85 276條非冗余序列中，共挖掘出11 649個EST-SSR位點．菜豆轉錄組SSR標記主要重復單元為1～3個堿基，其中單堿基為主要類型，占總量的56.7%； 其次是三堿基重復，占總量的21.1%．從128對EST-SSR引物中篩選出18對多態性高、重復性好的引物進行PCR擴增．供試種質的多態性信息量（PIC）為0.50～0.95，平均為0.88； 遺傳相似性系數為0.15～0.65，以0.35為閾值可將81份種質分為3大類，其中貴州種質主要分布于第Ⅰ，Ⅲ類，而省外品種僅分布在第Ⅱ類．利用核心引物TDc9和TDc66可以有效區分81份菜豆種質，并構建其分子身份證．研究開發的EST-SSR標記系統，可用于菜豆種質的鑒定及親緣關系分析．

關" 鍵" 詞：

菜豆； 轉錄組； 分子標記開發； EST-SSR標記； 分子身份證

中圖分類號：

S643.1

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2024）06006311

Development of EST-SSR Marker System for

Phaseolus vulgaris and Construction of

Molecular ID for Some Important Germplasms

FU Yangyun， WEN Xiaopeng

Institute of Agro-Bioengineering，Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education），Guiyang 550025，China

Abstract：

To develop an efficient marker system for Phaseolus vulgaris as well as to elucidate the phylogenetic relationships of important germplasms，in the present work，EST-SSR primers were designed based on the transcriptome data，subsequently，an EST-SSR marker system was established．Using PCR and capillary electrophoresis with selected polymorphic primers，the 81 Phaseolus vulgaris germplasms，most of which originated in Guizhou Province，were fingerprinted and genetically identified．With MISA software，a total of 11 649 EST-SSR loci were identified from 85 276 unigene sequences in the transcriptome data of Phaseolus vulgaris．The main repetitive units of SSR markers in the transcriptome of Phaseolus vulgaris are 1 to 3 bases，with single base repeats being the main type，accounting for 56.7% of the total，followed by triple base repeats，accounting for 21.1% of the total．Totally，18 pairs of EST-SSR primers with higher polymorphism and better repeatability were selected from 128 primer pairs．The polymorphic information content （PIC） of the tested germplasms were ranged from 0.50 to 0.95，with an average value of 0.88．The genetic similarity coefficient （DICE） varied from 0.15 to 0.65．When DICE is 0.35，the 81 germplasms can be divided into three categories，among which，the germplasms from Guizhou were mainly distributed in class Ⅰ and Ⅲ，and the cultivars from the other provinces were only distributed in class Ⅱ．The core primers TDc9 and TDc66 might efficiently differentiate the 81 Phaseolus vulgaris germplasms，thereby were employed to construct the molecular ID．Conclusively，the established EST-SSR marker system may be effective for identifying Phaseolus vulgaris germplasms and elucidating genetic diversity．

Key words：

Phaseolus vulgaris； transcriptome； molecular marker development； EST-SSR marker； molecular ID

菜豆（Phaseolus vulgaris L.）屬豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）菜豆屬（Phaseolus）植物，是菜豆屬重要的栽培種之一，又稱蕓豆、四季豆［1］，由墨西哥、中美洲中心和南美洲中心馴化為栽培種［2］．中國有悠久的菜豆栽培歷史，主要分布在黑龍江、內蒙古、吉林、云南、貴州、山西、陜西等地［3］．我國菜豆產業目前存在品種單一、退化嚴重，以及種質資源命名混亂等問題，如“同物不同名，同名不同物”等現象普遍存在［4-5］，因此，對菜豆種質的真實性進行區分整理，揭示其親緣關系，對菜豆種質資源的保護與利用有重要意義．

簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），又稱微衛星DNA，是指基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位多次重復而構成的DNA片段，因其多態性豐富、穩定性好和具共顯性而備受關注．根據來源不同，可分為基因組SSR和表達序列標簽SSR（EST-SSR），其中EST-SSR標記因開發簡單、快捷和低成本而在很多作物上得到應用．徐國輝等［6］利用10對EST-SSR核心引物，對藍莓優良品系的父本進行了鑒定，并構建了相應的DNA指紋圖譜．楊仕美等［7］基于火龍果轉錄組測序數據，開發出EST-SSR標記并用于火龍果種質的親緣關系分析．李松等［8］利用20對SSR核心引物，對云南玉溪玉米自交系進行遺傳多樣性分析，為云南玉米品種推廣提供了理論依據．在菜豆上，陳其福等［9］采用SSR標記分析了14個食莢菜豆品種的親緣關系，并建立了特異性指紋圖譜．楊義杰等［10］應用8對SSR引物分析了20份蕓豆品種的遺傳多樣性．Shabib等［11］利用SSR分子標記技術對11份菜豆品種作遺傳多樣性分析，為新品種選育提供了研究依據，但尚未見菜豆EST-SSR分子標記開發利用的報道．

菜豆是貴州主要夏季蔬菜之一，也有極為豐富的種質資源，但其親緣關系和遺傳背景不清晰，極大地影響了遺傳育種和知識產權保護．本文基于菜豆轉錄組數據，設計EST-SSR引物，建立EST-SSR標記系統； 篩選出核心引物，分析了50種貴州種質和31個省外品種間的親緣關系，并構建其分子身份證，旨在為菜豆育種親本的選擇、品種鑒定以及品種知識產權保護提供可靠的遺傳學依據．

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

本研究所用菜豆種質共81份，其中50份采自貴州各地，由貴州大學蔬菜研究院提供，剩余31個品種為市面采購．種質名稱信息見表1．

1.2" 菜豆轉錄組測序及引物設計

將菜豆轉錄組測序樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina HiSeq平臺進行分析測序，對上機測序得到的原始序列進行過濾，去掉含接頭的短序列和低質量的短序列，得到高質量的測序數據．使用MISA軟件對基因轉錄本進行SSR檢測，根據搜索出的SSR位點及其側翼序列，使用Primer 3完成EST-SSR引物設計．

1.3" PCR擴增及產物檢測

將獲得的81份菜豆種子浸種2～3 d后，移栽至土壤培養2～3周，直至長出2片真葉，采摘包于錫紙，放置于-20 ℃冰箱內，用于后續DNA提取．采用北京天根生化科技有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取所有樣品DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行．DNA提取完成后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，采用全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）檢測其濃度與純度，質量合格后將其存于-20 ℃冰箱中備用．

選取種子性狀差異性較大的8個樣品DNA為模板，利用128對引物分別進行擴增．PCR擴增體系為10 μL： 模板基因組DNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL（北京天根生化科技有限公司），ddH2O補充至10 μL．SSR-PCR擴增程序： 94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性30 s，最適退火溫度57～60 ℃反應30 s，72 ℃ 反應1 min，共38個循環； 72 ℃延伸10 min； 擴增產物放置于4 ℃冰箱中冷藏保存．

PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步篩選出有多態性的引物．將多態性較好、重復性高、穩定性好的引物對81份菜豆樣品進行PCR擴增，最后使用毛細管電泳對擴增產物進行檢測分析．毛細管電泳由Qsep100TM全自動核酸蛋白分析儀完成．

1.4" 數據處理

利用毛細管電泳方法采集條帶，人工讀條統計100～500 bp內的條帶，記錄明顯條帶，對多態性佳的引物重復擴增至少3次，其中絕大多數帶型可重復，對不穩定譜帶忽略不計．有譜帶的標記為“1”，沒有譜帶的標記為“0”，建立數據庫．利用POPGEN 32軟件分析每對EST-SSR引物的等位基因數、有效等位基因數、Nei s基因多樣性指數及Shannon信息指數； 應用PIC_CALC軟件計算PIC值； 用NTSYS pc 2.10e軟件計算相似系數，并按UPMGA方法構建親緣關系樹狀圖．

1.5" DNA分子身份證構建

利用核心引物擴增的帶型數據，賦值“0/1”形成菜豆種質的指紋代碼，通過條形碼和二維碼生成器（https： //www.qr-batch.com/）生成包含各供試種質基本信息的DNA分子身份證．

2" 結果與分析

2.1" 菜豆轉錄組EST-SSR位點分析及引物設計

利用MISA軟件對菜豆轉錄組測序數據85 276條非冗余序列進行分析，共挖掘出11 649個EST-SSR位點．SSR標記的重復單元堿基數有單堿基重復、二堿基重復、三堿基重復、四堿基重復、五堿基重復、六堿基重復，還有復雜的重復堿基（略），對應的標記數目分別為6 610，2 389，2 458，132，36，24．菜豆轉錄組EST-SSR標記主要重復單元為1～3個堿基，其中單堿基重復位點數最多，占總量的56.7%； 其次是三堿基重復，占總量的21.1%．使用Primer 3共設計EST-SSR引物30 177對，隨機合成128對EST-SSR引物，分析81份菜豆種質的遺傳多態性．

2.2" 菜豆EST-SSR引物篩選

在128對EST-SSR引物中，122對引物能擴增出條帶，有效擴增比例為95%．經重復篩選，有18對引物能穩定擴增出多態性好、重復性高的條帶（表2），部分引物篩選結果見圖1．

2.3" 菜豆EST-SSR引物多態性分析

利用18對多態性引物對81份菜豆樣品進行PCR擴增，將擴增產物進行毛細管電泳，部分種質的電泳結果見圖2．通過POPGEN 32對統計的“0/1”數據進行分析，結果顯示，18對引物在81份樣品中共檢測出492個多態性位點： 最小多態性位點數為8個，最大為39個，平均27.3個．等位基因數平均為2.0個，有效等位基因總數為23.0個，單對引物產生有效等位基因數為1.1～1.4個，平均為1.3個．Nei s基因多樣性指數為0.07～0.25，平均為0.18．Shannon信息指數變化范圍為0.14～0.40，平均為0.30．PIC值為0.50～0.95，平均為0.88（表3）．結果表明，篩選出的18對EST-SSR引物具有很好的多態性，81份菜豆種質也具有豐富的遺傳多樣性．

2.4" 菜豆種質的親緣關系分析

利用NTSYSpc 2.01e軟件計算81份菜豆種質的遺傳相似性系數．聚類結果表明，遺傳相似性系數變化幅度為0.15～0.65，其中MD4和MD8親緣關系較近，相似系數為0.65，而MD37和MD77親緣關系較遠，相似系數僅為0.15．在遺傳相似系數為0.35時，可將81份種質分為3大類（圖3）： 第Ⅰ類包含MD1，MD3，MD4等18份種質．第Ⅱ類中包含的種質數量最多，共計59份種質，在相似系數為0.37時，又可將其分為3個亞類，其中第一亞類包含MD24，MD25，MD30等36份種質，第二亞類包含MD56，MD58，MD63等22份種質，而第三亞類僅有種質MD57．第Ⅲ類僅有4份來源于貴州的種質，即MD36，MD37，MD38和MD47．省外種質（MD51～MD81）全部聚在第Ⅱ類群，極有可能與來源地有關，因為這31份品種均是來源于北方，可能其遺傳背景重合度較高； 而來自貴州的50份種質在3大類中均有聚類，折射出貴州種質間的遺傳差異大，可以從中挖掘優異資源，在遺傳育種上有較大的潛在價值．

2.5" DNA分子身份證的構建

利用18條EST-SSR引物對81份菜豆種質進行毛細管電泳，獲得每對引物擴增的帶型數據，這些 “0/1 ”數據可作為菜豆種質指紋圖譜或分子身份證構建的直接依據．PIC值較高的引物為TDc17（0.95），TDc47（0.95），TDc66（0.94），TDc69（0.94）及TDc97（0.95）（表3），其中TDc17，TDc66，TDc97均能鑒別出77份種質，TDc66的Shannon信息指數（0.40）最高，故選取TDc66作為核心引物，但仍有4份種質不能被識別，分別為MD42，MD49，MD57和MD63．TDc9，TDc47和TDc97等3對引物可鑒定這4份種質．這3對引物的多態性位點數分別為33，39，37，選取多態性位點數少且具備同等鑒別力的引物對TDc9，能避免構建分子身份證的繁瑣性，因此，利用引物對TDc9和TDc66擴增的EST-SSR標記，可構建全部供試種質的分子身份證，分別生成包含基本信息的條形碼和二維碼（表4）．

3" 討論

3.1" 菜豆的EST-SSR分子標記

相比于主觀意識強，且易受環境、氣候等外界因素影響的傳統形態學標記，共顯性強、標記數量充足、多態性高、能夠高效快速鑒別種質特異性的分子標記備受關注．菜豆作為我國主要的糧食作物，卻存在種植品種單一、品種退化嚴重以及種質資源命名混亂等問題，因此急需開發更為可靠且方便快捷的分子標記來促進菜豆育種．轉錄組數據是開發標記的理想資源［12］，相較于基因組測序，轉錄組測序成本低、耗時短．近年來許多果樹［13］、木本植物［14］、藥用植物［15］以及食用菌［16］等，均基于轉錄組測序開發出EST-SSR分子標記用于遺傳多樣性分析和品種種質鑒定及輔助育種．本研究基于菜豆轉錄組數據分析結果，開發合成了128對EST-SSR引物，并驗證挖掘了18對重復性好、特異性強、多態性高的引物，用于分析菜豆的遺傳多樣性．

根據目前的相關研究報道，當PIC＞0.5時，表明引物有較高多態性； 0.5≥PIC＞0.2時，表明引物有中等多態性； PIC≤0.2，則表明引物多態性較低［17］．夏春陽等［3］利用SSR分子標記分析了69份普通菜豆種質資源的遺傳多樣性，PIC值平均為0.659．另外，陳瓊［18］也利用33對SSR核心引物對26份菜豆DUS測試標準品種的遺傳多樣性進行了分析，PIC值平均為0.604．本研究中所篩選的18對引物的PIC（0.50～0.95）≥0.5，表明這18對引物具有較高多態性，因此，本文開發的EST-SSR標記系統能用于菜豆種質的鑒定及親緣關系分析．

3.2" 貴州菜豆種質親緣關系

地理來源不僅是物種親緣關系分析的重要指標，更是影響物種遺傳分化的重要因素［19］．在長期的自交或近交下，不但會降低種群的遺傳多樣性，還會大大限制挖掘優良種質的可能性和培育新品種的創新性．本研究中所用種質主要分為貴州省內及省外兩類樣本，省外31份菜豆樣本主要來源于山東、河北和甘肅等地．基于菜豆轉錄組分析結果，本研究成功完成EST-SSR分子標記的引物設計開發，篩選出18對多態性極佳的EST-SSR引物，利用這些多態性好的引物能將81份菜豆種質明確區分開，可分為3大類群．由聚類結果可以看出，省外品種主要集中在第Ⅱ類群．這一趨勢表明這些品種的親緣關系較近，極有可能是具有相同或相似的遺傳背景，導致遺傳變異水平低．貴州省內收集的50份菜豆種質資源可被分為3大類群，且第Ⅰ，Ⅲ類群均為省內種質，僅有少量種質在第Ⅱ類群的第三亞類中，表明這50份種質遺傳變異水平高，且遺傳背景豐富多樣．這可能與我國西南優質菜豆種質資源交流逐年加強、少量新育成品種逐漸具備更豐富的遺傳背景有關［18］，因此，在雜交育種時需盡量選取來源不同的資源進行組配，以拓寬遺傳背景，從而提高我國菜豆種質資源的遺傳多樣性［20］．

3.3" 菜豆種質的分子身份證

目前，有3種構建分子身份證的方式： 1） 賦值“0/1”形成字符串； 2） 編碼等位基因； 3） 編碼基因型［21］．謝倩等［22］利用12對EST-SSR引物對59份橄欖種質進行遺傳多樣性分析，并構建了分子身份證．劉偉等［23］應用SSR熒光標記法構建山東地方桃種質資源分子身份證．陸育生等［24］利用SSR標記分析了廣東黃皮種質資源的遺傳多樣性水平及親緣關系，并構建了分子身份證．本研究以“0/1”字符串生成條形碼，作為構建分子身份證的直接依據； 利用TDc9和TDc66作為鑒定全部供試種質的高效核心引物，以此構建81份菜豆種質的分子身份證．

本研究開發的EST-SSR標記可用于菜豆的系統發育、物種進化及親緣關系等研究，為今后菜豆品種資源保存、利用、育種和提高育種效率等奠定理論基礎，充分發揮它們在育種工作中的應用價值．

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責任編輯" 周仁惠