云南十里香茶樹空間轉(zhuǎn)錄組測序研究

王冬雪 滿佳旭 武思敏 趙雪婷 張冬英

摘要：近年來，云南大葉種茶和古茶樹資源備受關(guān)注，而對于云南小葉種茶樹資源研究報道較少。十里香茶樹品種是云南特有的小葉種茶樹資源，品質(zhì)獨特且飲用歷史悠久。空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)作為一種新興的基因表達分析技術(shù)，目前尚未見在茶樹資源應(yīng)用上的文獻報道。利用空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對十里香茶樹嫩芽的基因表征情況和空間調(diào)控機制進行研究，結(jié)果顯示，Spot聚類分析識別嫩芽細胞類型，劃分為13個不同細胞類型cluster，構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，觀察到不同細胞類型cluster在嫩芽的兩種發(fā)育時期的空間表達位置存在差異，呈現(xiàn)空間異質(zhì)性。進一步鑒定不同細胞類型cluster中的差異基因，主要以抗逆脅迫、生長發(fā)育調(diào)控為主，抗逆脅迫代表性基因為LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011、LOC114289235，生長發(fā)育代表性基因為LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858；并繪制空間分布圖，發(fā)現(xiàn)這些抗逆脅迫和生長發(fā)育基因在幼葉中高表達，這說明在嫩芽發(fā)育的早期階段，其在抗逆脅迫和生長發(fā)育調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。GO與KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，十里香茶樹嫩芽的差異基因涉及多個重要通路，如翻譯、茉莉酸信號調(diào)控、鈣離子結(jié)合、植物激素信號轉(zhuǎn)導等，這些都與茶樹生長發(fā)育緊密相關(guān)。此研究結(jié)果可為十里香茶樹發(fā)育生物學提供一定的科學依據(jù)，同時也為其他茶樹資源的研究提供一種新的思路。

關(guān)鍵詞：十里香；空間轉(zhuǎn)錄組；差異基因；空間異質(zhì)性；發(fā)育生物學

中圖分類號：S571.1；S326????????????? 文獻標識碼：A????????????? 文章編號：1000-369X（2024）03-399-12

Spatial Transcriptome Sequencing of Shilixiang in Yunnan Province

WANG Dongxue1，2， MAN Jiaxu3， WU Simin1，2， ZHAO Xueting1， ZHANG Dongying1，2*

1. College of Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2. Key Laboratory of Pu'er Tea Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

3. Institute of Agricultural Products Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650201， China

Abstract： In recent years， Yunnan's large leaf tea and ancient tea resources have attracted much attention， while there are relatively few reports on the research of small leaf tea resources. Shilixiang， a distinctive small leaf tea resource in Yunnan， possessed unique quality and a long drinking history. Spatial transcriptome technology， an emerging gene expression analysis technique， has not been previously applied to tea resources according to current literature. The gene characterization and spatial regulation mechanism of the tender buds of Shilixiang were researched by spatial transcriptome sequencing technology in this study. The results show that 13 clusters of different cell types in the tender bud cells were identified by a spot clustering analysis and the spatial transcriptome map was constructed. The expression positions of clusters during the two developmental stages of the bud were different and spatial heterogeneity was observed from this analysis. Further exploration involved the identification of differential genes in various cell type clusters， with a focus on stress response and growth and development regulation. Representative stress responsive genes included LOC114312694， LOC114319171， LOC114320792， LOC114287723， LOC114284011 and LOC114289235. Meanwhile， representative growth and development genes included LOC114263486， LOC114320821， LOC114292779， LOC114321117， and LOC114286858. A spatial distribution map illustrated the high expression of these stress response and growth development genes in young leaves， indicating their crucial role in the early stage of tender bud development. Further GO and KEGG enrichment analysis reveal that the differential genes in the tender buds of Shilixiang are associated with multiple important pathways. These pathways included translation， jasmonic acid signal regulation， calcium ion binding， and plant hormone signal transduction， all of which are closely linked to the growth and development of tea plants. The results of this study provided a solid scientific foundation for understanding the developmental biology of Shilixiang. Additionally， they provided a new perspective for exploring other tea resources.

Keywords： Shilixiang， spatial transcriptome， differential gene， spatial heterogeneity， developmental biology

隨著科學技術(shù)的日新月異，茶樹基因組的研究從未止步[1]。自2010年中國科學院啟動“茶基因組”計劃以來，歷經(jīng)7年，構(gòu)建了第一個茶樹基因組（阿薩姆種基因組），為后續(xù)的茶樹研究提供了先例[2]。茶樹基因組具有高雜合性，極大制約了茶樹基因組的進展[3-4]。迄今為止，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中，已經(jīng)公布眾多茶樹基因組，如云抗10號[2]、舒茶早[5-6]、龍井43[7]等。這些基因組的公布為茶樹的遺傳育種、進化起源等提供了一定的科學參考[8]。目前，轉(zhuǎn)錄組學分析已被廣泛用于揭示茶樹特征性次級代謝通路、抗逆性和產(chǎn)量相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機制的研究[9-11]，包括采用不同組織的不同時空樣本[12]、生物脅迫樣本和非生物脅迫樣本[13-14]。也有研究者使用二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對茶樹舒茶早品種進行了轉(zhuǎn)錄組測序[15]，這使得茶樹二代轉(zhuǎn)錄組測序研究進入到快速發(fā)展階段。近些年來，大量的基因組測序加速了茶樹的遺傳育種進程[16-19]，這些研究結(jié)果對促進茶樹品種改良具有重要意義。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)作為近幾年新興的高通量測序技術(shù)，為我們解析基因在組織結(jié)構(gòu)中的復(fù)雜調(diào)控提供了一種全新的視角。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，雖可以提供基因在總體水平上的表達信息，但不能揭示基因在組織或細胞水平上的具體分布情況。而空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可在組織原位同時獲得基因表達特征和空間分布數(shù)據(jù)，進一步推進了對組織原位細胞真實基因表達的研究。擬南芥是第一個構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的樣本，該圖譜揭示了擬南芥跨組織結(jié)構(gòu)域的141個差異表達基因[20]。在馬齒莧植物中應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聚焦光合作用場所的葉肉細胞和束鞘細胞群體，進行了兩種不同的空間基因表達分析[21]。通過構(gòu)建蘭花發(fā)育過程中的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)圖譜，為進一步研究蘭花開花過程中復(fù)雜而重要的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了寶貴的資源[12]。也有研究報道，利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)創(chuàng)建的番茄愈傷組織的細胞圖譜，可以揭示其異質(zhì)性并鑒定出不同的細胞類型[22]。在江南卷柏（Selaginella moellendorffii）根系中進行空間轉(zhuǎn)錄組測序研究，支持了控制根系發(fā)育機制高度趨同進化的觀點[23]。目前，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在茶樹資源中的應(yīng)用還未見報道。

云南是茶樹的起源地，大葉種茶樹資源和古茶樹資源備受人們關(guān)注[25]，而當?shù)匦∪~種茶樹資源關(guān)注度較低。十里香茶樹作為云南特有的小葉種茶樹資源，栽培歷史悠久，其最早應(yīng)用可追溯到唐代[25]。近些年來，十里香茶樹研究多集中在遺傳多樣性和種質(zhì)資源保護、栽培技術(shù)、新品種的選育和產(chǎn)量優(yōu)化等方面，且多采用傳統(tǒng)研究技術(shù)，目前整體研究水平較低，研究進程較為緩慢[26-27]。本文利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對十里香茶樹嫩芽進行研究，旨在為十里香茶樹發(fā)育生物學提供科學依據(jù)，同時也為其他茶樹資源的研究提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品于2022年6月采集自昆明市云南農(nóng)業(yè)大學茶葉種植基地，茶樹品種為十里香，同一茶樹上取5個嫩芽。

1.2 樣品制備

使用異戊烷和液氮浴冷凍新鮮嫩芽，用OCT包埋冷凍組織樣本，﹣80 ℃保存；在冷凍切片機中進行冷凍切片；并收集組織切片用于RNA提取及質(zhì)檢，保證組織冷凍過程中RNA無降解。

1.3 組織優(yōu)化

將冷凍切片按照區(qū)域貼在組織優(yōu)化的玻片上，然后對組織切片進行甲醇固定、蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and eosin staining，HE染色）和明場成像，再進行不同時間梯度透化和熒光標記的cDNA合成，最后移除組織進行熒光成像，通過熒光信號的強度和彌散程度確定最佳的透化條件，即熒光信號的強度最大且沒有彌散為最佳透化時間，用于后續(xù)基因表達文庫的構(gòu)建。

1.4 基因表達文庫構(gòu)建和質(zhì)檢

將組織切片貼于基因表達的玻片上，進行甲醇固定、H&E染色和明場成像；根據(jù)組織優(yōu)化確定的透化時間進行組織透化，基因表達玻片上的組織切片釋放的mRNA被spot上的特殊引物捕獲并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。從載玻片上收集帶有空間條形碼的cDNA，經(jīng)過二鏈合成、變性、PCR擴增得到初步cDNA，再通過酶切片段化處理、末端修復(fù)加A尾、磁珠片段篩選、接頭連接、磁珠純化、添加樣本indexes PCR構(gòu)建標準二代測序文庫。

1.5 組織透化和cDNA合成

根據(jù)組織優(yōu)化試驗確定的透化時間進行組織透化，使細胞中的mRNA得到釋放，并結(jié)合到相應(yīng)的捕獲探針上；再進行mRNA逆轉(zhuǎn)錄，得到完整cDNA一鏈；經(jīng)過二鏈合成、二鏈變性回收、cDNA擴增和cDNA純化得到完整的cDNA。

1.6 cDNA定量及質(zhì)控

取1 ?L樣品稀釋至2 ng·?L-1，使用Qubit測定純化后cDNA產(chǎn)物濃度，使用High sensitivity Agilent Technologies 2100 Bioanalyzerd對cDNA產(chǎn)物峰型進行測定。

1.7 文庫定量和質(zhì)控

取10 ?L cDNA進行建庫，通過片段化、末端修復(fù)加A尾，接頭連接，磁珠純化，樣本index PCR，PCR后的磁珠雙端片段篩選等步驟完成文庫構(gòu)建。并利用Qubit4.0測定文庫濃度；稀釋到合適的濃度，利用Qseq400進行片段檢測，一般文庫分布于在300～800 bp，平均片段分布于400～500 bp。

1.8 上機測序

文庫質(zhì)檢合格后，利用百邁客公司二代測序儀平臺對空間基因表達文庫進行測序，測序策略為PE150。

1.9 測序數(shù)據(jù)及其質(zhì)量評估

采用百邁客公司Illumina技術(shù)對樣本的轉(zhuǎn)錄組進行雙端150 bp測序。為確保測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性，使用Fastp（v0.23.4）對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列，限制N堿基的存在，修剪了序列的前端和尾端，確保所保留的序列長度不低于75 bp。

1.10 BSTMarits分析

使用百邁客公司平臺的BSTMatrix數(shù)據(jù)分析軟件包，以過濾后的fastq文件和組織切片的甲苯胺藍染色圖片為輸入數(shù)據(jù)，進行參考基因組比對、組織檢測和Spatial Barcode/UMI統(tǒng)計，生成spot-基因表達矩陣。

1.11 Spot聚類分析

利用Seurat包中的sctransform算法對數(shù)據(jù)進行標準化處理，之后通過vst算法篩選出數(shù)據(jù)中表達變化最大的基因集，默認選擇3 000個差異基因作為高變異基因（High-variance genes，HVGs），使用UMAP[28]和t-SNE[29]兩種降維手段進行spot聚類分析，將空間spot劃分成不同區(qū)域cluster并進行后續(xù)分析。

1.12 區(qū)域功能富集分析

使用7個公共數(shù)據(jù)庫根據(jù)差異基因序列的相似性進行比對注釋，包括Nr非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫（www.expasy.org）、GO基因本體數(shù)據(jù)庫（http：//geneontology.org）、COG同源蛋白簇數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/research/

cog）、KOG真核同源基團數(shù)據(jù)庫（http：//genome.

jgi-psf.org/help/kogbrowser.jsf）、Pfam大型蛋白結(jié)構(gòu)域家族的數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）和京都基因與基因組百科全書（KEGG，www.genome.jp/kegg），得到基因的注釋信息，并為對應(yīng)cluser進行空間轉(zhuǎn)錄組亞群分析、差異表達基因分析、GO/KEGG功能富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估結(jié)果

由于目前還沒有十里香茶樹基因組數(shù)據(jù)作為參考，因此將十里香茶樹測序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已有的茶樹基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)與舒茶早基因組數(shù)據(jù)的比對率最高，達到80%以上。轉(zhuǎn)錄組比對結(jié)果同樣顯示與舒茶早比對率最高。而且舒茶早是中小葉品種，因此選擇舒茶早作為參考基因組。本研究共獲得59.42 G的原始測序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計獲取352 196個Spots，去除低質(zhì)量的序列后獲得198 075 303個reads。十里香茶樹基因組的GC含量值為35.32%；質(zhì)量值≥20的堿基所占的百分比（Q20）為93.39%，質(zhì)量值≥30的堿基所占的百分比（Q30）為87.75%，與參考基因組和轉(zhuǎn)錄組的平均比對率分別為93.52%和77.22%，測序飽和度為71.38%，測序各項指標質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)分析條件。

2.2 十里香茶樹嫩芽空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建

聚類分析獲得不同細胞類型的cluster共13個，不同顏色的區(qū)域代表不同功能，空間距離代表表達模式的關(guān)聯(lián)程度（圖1）。構(gòu)建不同細胞類型cluster分布空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，可以觀察細胞群的全局性和局部相似性。從圖2中可以看到兩種發(fā)育形態(tài)的嫩芽（嫩芽主要包括幼葉和芽軸），第一種嫩芽的發(fā)育形態(tài)（以cluster0的123為例），cluster4、cluster5、cluster9主要富集于芽軸；cluster1、cluster2、cluster6、cluster10富集于幼葉。第二種嫩芽發(fā)育形態(tài)（以cluster0的45為例），cluster3、cluster7富集于幼葉；cluster4、cluster8、cluster11富集于芽軸。這一分析發(fā)現(xiàn)，不同細胞類型cluster在不同的發(fā)育階段，基因的表達位置存在空間異質(zhì)性，暗示嫩芽發(fā)育過程中基因的表達呈動態(tài)變化。準確劃分細胞邊界和鑒定細胞的確切位置對理解嫩芽區(qū)域特異性的細胞分化過程至關(guān)重要。

2.3 十里香茶樹差異基因的表達分析

對十里香茶樹嫩芽中不同細胞類型cluster的差異基因進行功能注釋，由表1可知，這些基因主要涉及植物抗逆性調(diào)節(jié)、生長發(fā)育以及兒茶素合成。從表1中選取具有代表性基因進一步繪制空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，如圖3所示。LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011和LOC114289235等基因參與了植物生長發(fā)育中的抗逆性調(diào)節(jié)過程，這些基因紅色基本集中在幼葉區(qū)域，在幼葉中有高表達（圖3A～圖3F）。幼葉生長在植物的頂端和外端，對環(huán)境變化非常敏感，在生長發(fā)育過程中受到各種環(huán)境壓力和逆境條件的挑戰(zhàn)，從而演化出一種適應(yīng)機制，故抗逆性基因表達較高。LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858等基因參與調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)，紅色基本集中在幼葉區(qū)域（圖3G～圖3K），說明這些與調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)的基因在幼葉

區(qū)域有高表達，在芽軸表達較低。LOC1142266906是類黃酮代謝途徑下游的無色花青素還原酶，它是決定茶樹兒茶素類化合物類型的關(guān)鍵酶類，具有多種重要的生物學功能。如圖3L所示，LOC1142266906基因在整個嫩芽組織高表達，說明類黃酮代謝在十里香茶樹嫩芽發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。

2.4 十里香茶樹嫩芽差異基因GO功能分類注釋

GO功能分類注釋結(jié)果分為生物學過程、細胞組分和分子功能3類（圖4）。生物學過程主要包括生物調(diào)節(jié)（32%）、對刺激的反應(yīng)（29%）、代謝過程（18%）、細胞過程（16.4%）

等。細胞組分中細胞部分、細胞器、細胞器部分和大分子復(fù)合物分別占比為65%、6.4%、7.7%、8.8%。分子功能中，酶調(diào)節(jié)活性、結(jié)合活性、蛋白活性占比較高，分別為20.8%、26.7%、23.4%。

從GO富集結(jié)果選取每個cluster最顯著的GO通路富集項（表2），結(jié)合2.3章節(jié)分析發(fā)現(xiàn)，抗逆脅迫基因聚類于cluster1、cluster2、cluster4、cluster6、cluster7和cluster12，其在GO富集通路主要涉及翻譯、核糖體、核小體、細胞壁大分子分解代謝、茉莉酸介導信號通路調(diào)控、幾丁質(zhì)分解代謝、蛋白質(zhì)異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ等。生長發(fā)育基因聚類于cluster0、cluster2、cluster4和cluster10。GO富集通路主要關(guān)于核糖體、細胞壁、核小體、轉(zhuǎn)錄輔阻遏蛋白活性、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性、鈣離子結(jié)合、對刺激的反應(yīng)調(diào)控、茉莉酸介導信號通路調(diào)控、細胞壁大分子分解代謝、幾丁質(zhì)分解代謝、蛋白質(zhì)異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統(tǒng)Ⅰ、

光系統(tǒng)Ⅱ等通路。翻譯、核糖體和核小體是植物細胞內(nèi)生命活動的關(guān)鍵組成部分，直接參與蛋白質(zhì)合成，而蛋白質(zhì)是植物嫩芽發(fā)育和生理過程中不可或缺的重要分子。細胞壁大分子分解代謝、茉莉酸介導信號通路調(diào)控、幾丁質(zhì)分解代謝、蛋白質(zhì)異源二聚化活性、轉(zhuǎn)錄輔阻遏

蛋白活性、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性、鈣離子結(jié)合、對刺激的反應(yīng)調(diào)控等過程在植物嫩芽的發(fā)育中都具有重要作用，直接或間接影響植物的生長、發(fā)育和逆境響應(yīng)。葉綠體類囊體膜和光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ的發(fā)育對植物嫩芽的生長、發(fā)育和能量供給至關(guān)重要。

2.5 十里香茶樹嫩芽差異基因KEGG功能分類注釋

KEGG注釋結(jié)果可以分為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝、有機系統(tǒng)和組織系統(tǒng)6類，共注釋1 335條通路，其中代謝富集到的基因數(shù)量最多，為777條，其次為遺傳信息處理，為378條，環(huán)境信息處理、有機系統(tǒng)、細胞過程、組織系統(tǒng)分別富集到81、43、36、20條（圖5）。結(jié)果表明，在十里香茶樹嫩芽發(fā)育階段，植物的代謝和遺傳信息處理的生物活動占據(jù)著重要的位置。從KEGG富集結(jié)果選取各cluster最顯著的KEGG通路富集項（表3）。結(jié)果表明，13個cluster中差異基因表達主要涉及氨基酸生物合成、氨基糖

和核苷酸糖代謝等通路，均與蛋白質(zhì)代謝過程緊密相關(guān)。蛋白質(zhì)是生命活動的基因組成部分，植物生長發(fā)育過程中的所有關(guān)鍵步驟都與蛋白質(zhì)表達密切相關(guān)，如光合作用、呼吸作用、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)化、逆境響應(yīng)和信號傳遞等。這些差異基因表達的富集結(jié)果為茶樹發(fā)育過程中蛋白質(zhì)代謝提供了重要線索，有助于更全面地理解十里香茶樹嫩芽在生長發(fā)育階段的生物學調(diào)控機制。

3 討論

本研究應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)識別十里香茶樹嫩芽的基因表達情況和空間信息。Spot聚類注釋嫩芽不同細胞類型，劃分13個不同細胞類型cluster，空間轉(zhuǎn)錄組圖譜表明，不同細胞類型cluster在嫩芽不同發(fā)育時期的表達位置存在空間異質(zhì)性。推測嫩芽作為茶樹幼嫩組織，處于高度發(fā)育狀態(tài)，細胞處于不斷分裂分化過程，導致一些基因在特定階段的特定細胞類型中表達，執(zhí)行特定的生物學功能。

進一步鑒定不同細胞類型cluster的差異基因，發(fā)現(xiàn)LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011、LOC114289235基因參與嫩芽的抗逆性調(diào)節(jié)，在嫩芽的幼葉部位高表達，在芽軸低表達。這可能是因為在茶樹的嫩芽中，幼葉包裹著芽軸，葉片充當了芽軸的保護外層，芽軸受外界的影響遠小于嫩葉，所以抗逆性基因在芽軸的表達較少而在幼葉中表達量較高，是機體適應(yīng)外界環(huán)境機制的體現(xiàn)。LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858基因參與生長發(fā)育調(diào)控，在幼葉中高表達，在芽軸中低表達。這可能是由于幼葉比芽軸接觸到更多的光，光合作用更強，因此這些與生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的基因在幼葉中高表達。LOC1142266906是類黃酮代謝途徑下游的無色花青素還原酶（LAR），LOC1142266906基因在整個嫩芽組織中高表達，說明類黃酮代謝在十里香茶樹嫩芽發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。

基于空間轉(zhuǎn)錄組圖譜分析嫩芽中特定細胞類型的表達模式，鑒定了大量在十里香茶樹嫩芽不同部位間表達水平顯著差異的基因，且涉及多個生物學過程和功能。GO功能富集分析結(jié)果顯示，細胞組分中主要富集于細胞部分、細胞器等；在分子功能中主要富集于結(jié)合、蛋白和酶調(diào)節(jié)活性部分；顯著的GO富集通路包括翻譯、核糖體、核小體、細胞壁大分子分解代謝、轉(zhuǎn)錄輔阻遏蛋白活性、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性、鈣離子結(jié)合、對刺激的反應(yīng)調(diào)控、茉莉酸介導信號通路調(diào)控、幾丁質(zhì)分解代謝、蛋白質(zhì)異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ等，這些通路直接或間接影響著嫩芽的生長發(fā)育、能量供給和逆境脅迫反應(yīng)，在嫩芽發(fā)育過程中具有重要作用。KEGG數(shù)據(jù)庫共注釋到1 335條代謝通路，代謝占據(jù)主導位置，與Muthusamy等[30]研究結(jié)果相似，基因富集的代謝途徑包括氨基酸代謝、碳代謝等代謝調(diào)節(jié)，花青素、生長素、植物激素等前提物質(zhì)的合成，植物信號傳導，以及耐寒、耐旱、耐抗病等抗逆脅迫。綜合富集分析發(fā)現(xiàn)，嫩芽基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要參與逆境脅迫、生長發(fā)育等過程，反映了嫩芽對生態(tài)環(huán)境變化的適應(yīng)性，在發(fā)育階段需要平衡生長發(fā)育和應(yīng)對外部逆境的需求，以確保其在不同生態(tài)條件下生長發(fā)育。

參考文獻

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