普洱茶素Ⅴ~Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞作用研究

楊銳 趙興平 何明婕 劉敏 羅蓉 陳川龍 潘淑康 丁章貴

摘要：普洱茶素（Puerins）是從普洱熟茶中分離得到的兒茶素衍生物，是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的含氮多酚化合物。開(kāi)展普洱茶素Ⅴ～Ⅶ抗乳腺癌細(xì)胞作用的研究，以4種不同受體表型的乳腺癌細(xì)胞株為模型，進(jìn)行噻唑藍(lán)（MTT）比色試驗(yàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)等試驗(yàn)。結(jié)果表明，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ等3個(gè)單體化合物對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞都有顯著的抑制作用；蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，普洱茶素干預(yù)后乳腺癌細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生差異的蛋白主要集中于代謝通路，其次是癌癥通路和黏附斑信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3個(gè)普洱茶素化合物均可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。本研究報(bào)道了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌細(xì)胞活性及初步作用機(jī)制，為研究普洱熟茶抗癌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)信息。

關(guān)鍵詞：普洱熟茶；普洱茶素；乳腺癌；蛋白質(zhì)組學(xué)；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：S571.1；R737.9?????????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?????????????? 文章編號(hào)：1000-369X（2024）03-501-14

Study on the Effects of Puerins Ⅴ-Ⅶ on Four Kinds of Breast Cancer Cells

YANG Rui1，2，6， ZHAO Xingping 1，2，6， HE Mingjie1，2，6， LIU Min1，2，6， LUO Rong1，2，6，

CHEN Chuanlong5，6， PAN Shukang1，2，6*， DING Zhanggui1，2，3，4，6*

1. Yunnan TAETEA Microbial Technology Co.， Ltd.， Kunming 650217， China; 2. Fermentation Engineering Research Center for Yunnan Pu-erh Tea， Kunming 650217， China; 3. Yunnan Institute of Microbiology， School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming 650091， China; 4. Key Laboratory for Southwest Microbial Diversity of the Ministry of Education， Yunnan University， Kunming 650091， China;

5. Menghai Tea Industry Co.， Ltd.， TAETEA Group， Menghai 666200， China; 6. Key Laboratory of Pu-erh Tea Processing Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming 650217， China

Abstract： Puerins， a kind of nitrogen-containing polyphenol compound with unique structure， is a kind of catechin derivative first isolated from ripened Pu-erh tea. In this paper， the effects of puerins Ⅴ-Ⅶ on breast cancer cells were studied. Four breast cancer cell lines with different receptor phenotypes were used as models， and MTT assay， proteomics detection and apoptosis detection were carried out. The results show that all puerins Ⅴ， Ⅵ and Ⅶ had obvious inhibitory effects on the four kinds of breast cancer cells. Proteomics analysis indicates that the differentially expressed proteins were mainly concentrated in the metabolic pathway， followed by cancer pathway and adhesion spot signal pathway under the intervention of puerins Ⅴ-Ⅶ. Apoptosis detection demonstrates that all three puerins compounds could induce the apoptosis of MDA-MB-231 cells. This study first reported the anti-breast cancer activity and preliminary mechanism of puerins Ⅴ-Ⅶ， which provided basic information for studying the anti-cancer active substances of ripened Pu-erh tea.

Keywords： ripened Pu-erh tea， puerins， breast cancer， proteomics， apoptosis

普洱茶，是一種由云南大葉種曬青毛茶加工制成的茶葉，是云南的地理標(biāo)志產(chǎn)品，根據(jù)加工工藝的不同，普洱茶可分為普洱生茶和普洱熟茶，其中普洱熟茶由曬青毛茶經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成，是一種獨(dú)特的微生物發(fā)酵茶。普洱熟茶具有降脂減肥、調(diào)節(jié)腸道菌群、降糖、抗氧化、抗癌等多種保健功能，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。普洱熟茶的化學(xué)成分與曬青毛茶相比差異較大，除簡(jiǎn)單兒茶素、黃酮及黃酮苷、簡(jiǎn)單酚酸類、生物堿等成分外，普洱熟茶中的茶多糖、茶褐素等物質(zhì)的含量較高，此外，還存在一系列特殊的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如特征兒茶素類（A環(huán)取代產(chǎn)物普洱茶素puerins、B環(huán)衍生產(chǎn)物teadenols）、奎寧酸衍生物、他汀類和酰胺類化合物等[3]，這些特殊的成分是其成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多變的物質(zhì)基礎(chǔ)，普洱熟茶的一些特殊保健功能可能與這些特殊的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有關(guān)，因而通過(guò)對(duì)這些物質(zhì)成分的進(jìn)一步研究，可為普洱熟茶的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)和更多可能。

普洱茶素Ⅰ～Ⅷ（Puerins Ⅰ-Ⅷ）是普洱熟茶中一類特殊的含氮多酚化合物，由兒茶素與茶氨酸環(huán)化加合而成，是微生物作用下天然形成的兒茶素A環(huán)8位取代形成的N-乙基-2-吡咯烷酮取代的黃烷-3-醇化合物。Zhou等[4]在普洱茶中發(fā)現(xiàn)了一類新的8-C取代的黃烷-3醇化合物，普洱茶素A和B，證實(shí)了普洱熟茶中存在有特異的多酚類物質(zhì)。東方等[5]在普洱茶的抗氧化活性成分中檢測(cè)到了普洱茶素A和B，并推測(cè)這些特異多酚物質(zhì)可能具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Wang等[6]在普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)并分離得到了普洱茶素Ⅰ～Ⅷ化合物，并且發(fā)現(xiàn)普洱茶素Ⅰ～Ⅳ在1 μmol·L-1（0.401 μg·mL-1）劑量時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC）損傷具有保護(hù)作用，且作用強(qiáng)于表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子酸（GA）等兒茶素類和酚酸物質(zhì)。上述研究表明，普洱茶素Ⅰ～Ⅷ作為普洱熟茶的活性成分，可能具有特殊的活性潛力。除抗氧化活性外，普洱茶素Ⅰ～Ⅲ還具有改善高脂血癥小鼠的糖脂代謝紊亂[7]、改善動(dòng)脈粥樣硬化[8]和降脂[9]等作用，且濃度為500 μmol·L-1（200.5 μg·mL-1）普洱茶素Ⅲ對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響，以50 mg·kg-1·d-1劑量連續(xù)給藥6周未見(jiàn)小鼠的明顯毒副反應(yīng)[9]。而普洱茶素Ⅴ～Ⅷ作為普洱熟茶中的特征性物質(zhì)之一，其活性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率不斷升高，據(jù)報(bào)道，2020年，全球約有230萬(wàn)新發(fā)乳腺癌病例，預(yù)計(jì)到2040年，每年將有超過(guò)300萬(wàn)例乳腺癌新病例，每年死亡人數(shù)將超過(guò)100萬(wàn)[10]，乳腺癌的新發(fā)病例在女性癌癥中占31%，盡管增加了篩查并改進(jìn)了治療方法，但乳腺癌仍是導(dǎo)致女性死亡的第二大癌癥原因[11]。乳腺癌并不是單一的疾病，根據(jù)其細(xì)胞雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體（HER2）表型特征的不同，可分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER-2陽(yáng)性型及三陰性4種亞型[12-13]，其中，三陰性乳腺癌侵襲性強(qiáng)，對(duì)常規(guī)治療不敏感且容易產(chǎn)生耐藥性，是目前臨床治療預(yù)后最差的一類乳腺癌[14]。Xie等[15]研究表明，普洱熟茶水提物具有抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，但其中的功能物質(zhì)尚不清楚。為探究普洱茶素Ⅴ～Ⅶ（化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）在抗乳腺癌方面的作用，選用4種受體表型特征不同的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7

和BT474為研究對(duì)象，分析普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ對(duì)乳腺癌的抑制作用，以期為乳腺癌治療藥物的研發(fā)提供更多可能。

1 材料與方法

1.1 試劑

普洱茶素Ⅴ～Ⅶ從普洱熟茶中分離制備得到（云南大益微生物技術(shù)有限公司，純度≥98%），PBS緩沖液購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，L-15培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液均購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%胰蛋白酶購(gòu)自上海朗頓生物技術(shù)有限公司，胰島素購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，他莫昔芬（TAM）購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，乙腈（ACN）和蒸餾水購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀，美國(guó)Bioteck EON；Nano-UPLC EASY-nLC1200與UltiMate 3000聯(lián)用設(shè)備，美國(guó)Thermo Scientific；流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼公司。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、BT474和MCF-7細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；MDA-MB-453細(xì)胞購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的有酚紅L-15培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 μg·mL-1胰島素的有酚紅MEM培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；BT474細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 ?g·mL-1胰島素的含酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT試驗(yàn)

MTT試驗(yàn)測(cè)試普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和BT474等4種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。分別收集4種對(duì)數(shù)期乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，細(xì)胞密度為每孔8 000個(gè)。CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，換用無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液，分別加入普洱茶素Ⅴ～Ⅶ（濃度梯度為0、1、10、20、50、100、150、200 ?g·mL-1）和TAM（濃度梯度為0、1.8、3.7、5.6、7.4、9.3、11.1 ?g·mL-1）進(jìn)行處理，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍后，每孔加入150 μL DMSO，輕輕振蕩，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解。置于酶標(biāo)儀上，測(cè)定570 nm處各孔的吸光度值，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔和對(duì)照孔，每組5個(gè)重復(fù)。

1.5 蛋白樣品制備

培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后，在6孔板中按照每毫升5×105個(gè)細(xì)胞加入2 mL細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，加入30 ?g·mL-1普洱茶素Ⅴ～Ⅶ進(jìn)行處理，每種細(xì)胞均設(shè)置普洱茶素處理組與溶劑對(duì)照組，普洱茶素處理組每孔添加2 mL處理液，溶劑對(duì)照組每孔添加2 mL溶劑對(duì)照液，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)1 h后，去掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（4 ℃）溶液洗滌細(xì)胞，將培養(yǎng)皿置于冰上，加入200 ?L預(yù)冷的PBS溶液并用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)至離心管，4 ℃，1 000 g離心1 min，去除上清液，液氮速凍后存于﹣80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理

取凍存的蛋白樣品，加入適量RIPA裂解液進(jìn)行裂解，離心得到蛋白樣品，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量并將樣品調(diào)整至相同蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行Nano LC-MS/MS檢測(cè)，進(jìn)樣量2 ?g，反相色譜柱Reprosil-Pur 120 C18-AQ（100 μm ID×15 cm），流動(dòng)相為乙腈-水體系，A相為2%乙腈（含0.1%甲酸），B相為80%乙腈（含0.1%甲酸），流速300 nL·min-1。洗脫梯度：流動(dòng)相B 2%～5%持續(xù)2 min，5%～22%持續(xù)88 min，22%～45%持續(xù)26 min，45%～95%持續(xù)2 min，95%持續(xù)2 min。質(zhì)譜原始文件使用MaxQuant軟件（版本1.6.5.0）在SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索分析，采用IBAQ（基于強(qiáng)度的絕對(duì)蛋白質(zhì)定量）算法進(jìn)行定量分析，對(duì)比不同處理組以確定具有相似差異的蛋白質(zhì)，差異蛋白利用Proteome Discoverer軟件（2.4.0.305版本，Thermo Fisher Scientific公司）及京都基因與基因組百科全書(shū)通路（KEGG Pathway）數(shù)據(jù)庫(kù)（www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取MDA-MB-231對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔加入2 mL，細(xì)胞密度為每孔5×107個(gè)，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，換用無(wú)酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)液，添加2 mL普洱茶素Ⅴ（質(zhì)量濃度為20、40 ?g·mL-1）、普洱茶素Ⅵ（質(zhì)量濃度為15、30 ?g·mL-1）和普洱茶素Ⅶ溶液（質(zhì)量濃度為20、40 ?g·mL-1），分別培養(yǎng)6、12、24 h，進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。樣品處理結(jié)束后，收集培養(yǎng)基上清液中的細(xì)胞，并用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞從6孔板上消化下來(lái)，300 g離心5 min，與上清液中的細(xì)胞合并，取1×106個(gè)重懸的細(xì)胞，PBS洗滌后置于500 ?L稀釋的1×Annexin V-FITC緩沖液（含1%的Annexin V-FITC和PI染液）中重懸，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min，樣品置于冰上，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

普洱茶素Ⅴ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的作用如圖2所示，與對(duì)照組（不添加普洱茶素）相比，當(dāng)普洱茶素Ⅴ質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1后，MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1后，MCF-7細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1后，BT474細(xì)胞存活率顯著下降。

普洱茶素Ⅵ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的作用如圖3所示，與對(duì)照組（不添加普洱茶素）相比，當(dāng)普洱茶素Ⅵ質(zhì)量濃度≥1 μg·mL-1，MDA-

MB-453細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1，MDA-MB-453細(xì)胞存活率急劇下降，而MCF-7細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1，MDA-MB-231細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1，BT474細(xì)胞存活率顯著下降。

普洱茶素Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的作用如圖4所示，與對(duì)照組（不添加普洱茶素）相比，當(dāng)普洱茶素Ⅶ質(zhì)量濃度≥1 μg·mL-1，MDA-MB-453細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1，BT474細(xì)胞存活率顯著降低，而MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞存活率急劇下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1，MDA-MB-231和BT474細(xì)胞存活率急劇下降。

陽(yáng)性藥TAM對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的作用如圖5所示，與對(duì)照組（不添加TAM）相比，當(dāng)TAM質(zhì)量濃度≥1.8 μg·mL-1，MDA-MB-453細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度≥3.7 μg·mL-1，MDA-MB-231和BT474細(xì)胞存活率顯著下降；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5.6 μg·mL-1，MCF-7細(xì)胞存活率顯著下降，且MDA-MB-453、MCF-7和BT474細(xì)胞存活率急劇下降。

由上述結(jié)果可知，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ及TAM對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）如表1所示。普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)于上述4種乳腺癌細(xì)胞的IC50均在較低范圍內(nèi)（5 ～30 μg·mL-1），特別是對(duì)MDA-MB-231、

MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞的IC50低至5～

20 μg·mL-1。陽(yáng)性對(duì)照TAM對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的IC50在5～7 μg·mL-1。整體來(lái)看，普洱茶素Ⅴ和Ⅵ對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照TAM相當(dāng)。

2.2 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ抗乳腺癌潛在作用靶點(diǎn)的篩選

2.2.1 差異表達(dá)蛋白篩選

以FLOD CHANGE（FC）≤0.5或FC≥2，且蛋白有對(duì)應(yīng)基因名稱為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出普洱茶素Ⅴ～Ⅶ處理組相較于溶劑對(duì)照組的差異蛋白，所有差異蛋白匯總?cè)绫?所示。

2.2.2 KEGG富集分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析以研究普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮干預(yù)作用的生物學(xué)途徑，根據(jù)Fisher精確檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)差異前十的KEGG通路富集分析結(jié)果如圖6～圖8。

普洱茶素Ⅴ干預(yù)4種乳腺癌細(xì)胞的代謝通路分析結(jié)果如圖6所示。普洱茶素Ⅴ干預(yù)后，4種乳腺癌細(xì)胞中差異蛋白主要富集于代謝通路（Metabolic pathways，hsa01100），MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞映射到此通路中的蛋白差異最顯著，而MDA-MB-453和BT474細(xì)胞中富集差異蛋白最顯著的通路分別為肝細(xì)胞癌信號(hào)通路（Hepatocellular carcinoma，hsa05225）和黏附斑信號(hào)通路（Focal adhesion，hsa04510）。此外，普洱茶素Ⅴ干預(yù)后篩選得到的差異蛋白還與癌癥中蛋白聚糖信號(hào)通路（Proteoglycans in cancer，hsa05205）、癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer，hsa05200）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway，hsa04010）、人乳頭瘤病毒感染通路（Human papillomavirus infection，hsa05165）、人巨細(xì)胞病毒感染通路（Human cytomegalovirus infection，hsa05163）、神經(jīng)退行性病變通路（Pathways of neurodegeneration，hsa05022）、胞吞作用通路（Endocytosis，hsa04144）、阿爾茨海默病信號(hào)通路（Alzheimer disease，hsa05010）等相關(guān)。

普洱茶素Ⅵ干預(yù)4種乳腺癌細(xì)胞的代謝通路分析結(jié)果如圖7所示。普洱茶素Ⅵ干預(yù)后，4種乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生顯著差異的蛋白也主要富集于代謝通路，BT474細(xì)胞中富集于代謝通路的差異蛋白差異最顯著，而MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞中差異蛋白富集差異最顯著的通路依次為脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)信號(hào)通路（Spinocerebellar ataxia，hsa05017）、癌癥信號(hào)通路和小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路（Small cell lung cancer，hsa05222）。此外，普洱茶素Ⅵ干預(yù)后的差異蛋白還與肝細(xì)胞癌信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路（Ubiquitin mediated proteolysis，hsa04120）、癌癥中蛋白聚糖信號(hào)通路、病毒致癌作用通路（Viral carcinogenesis，hsa05203）、化學(xué)致癌作用通路（Chemical carcinogenesis，hsa05204）、癌癥中MicroRNA通路（MicroRNAs in cancer，hsa05206）、人乳頭瘤病毒感染通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、神經(jīng)退行性病變通路等相關(guān)。

普洱茶素Ⅶ干預(yù)4種乳腺癌細(xì)胞的代謝通路分析結(jié)果如圖8所示。與普洱茶素Ⅴ和Ⅵ類似，普洱茶素Ⅶ干預(yù)后，4種乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生顯著差異的蛋白主要富集于代謝通路，且MDA-MB-231細(xì)胞富集于代謝通路的差異蛋白差異最顯著；而MDA-MB-453、MCF-7和BT474細(xì)胞差異蛋白差異最顯著的通路依次為志賀菌病信號(hào)通路（Shigellosis，hsa05131）、癌癥中蛋白聚糖信號(hào)通路、黏附斑信號(hào)通路。此外，普洱茶素Ⅶ干預(yù)后的差異蛋白還與肝細(xì)胞癌信號(hào)通路、病毒致癌作用通路、癌癥信號(hào)通路、胞吞作用通路、人乳頭瘤病毒感染通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、神經(jīng)退行性病變通路等相關(guān)。

綜上所述，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的干預(yù)作用比較一致，主要集中于代謝通路，對(duì)小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路以及黏附斑信號(hào)通路的干預(yù)作用也比較明顯，表明這3條通路與普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的乳腺癌抑制作用機(jī)制直接相關(guān)，而其他與癌癥相關(guān)的通路如癌癥中蛋白聚糖信號(hào)通路等也可能與其抗乳腺癌作用有關(guān)。

2.3 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的效果及機(jī)制結(jié)果分析

Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，被熒光染料FITC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，而PI可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ誘導(dǎo)了MDA-MB-231細(xì)胞凋亡（圖9～圖11和表3）。MDA-MB-231細(xì)胞在添加普洱茶素Ⅴ～Ⅶ分別培養(yǎng)6、12 h和24 h后，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。培養(yǎng)6、12 h和24 h后，20 g·mL-1普洱茶素Ⅴ組細(xì)胞凋亡率分別為8.53%、14.96%和21.68%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅴ組細(xì)胞凋亡率分別為10.25%、14.22%和27.21%，隨著作用時(shí)間和作用濃度增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量和細(xì)胞凋亡率增加；15 g·mL-1普洱茶素Ⅵ組細(xì)胞凋亡率分別為8.47%、19.43%和24.03%，30 g·mL-1普洱茶素Ⅵ組細(xì)胞凋亡率分別為24.18%、22.75%和22.44%，低劑量作用24 h的誘導(dǎo)凋亡效果略強(qiáng)于高劑量，且低劑量時(shí)普洱茶素Ⅵ的誘導(dǎo)凋亡效果與普洱茶素Ⅴ相當(dāng)；20 g·mL-1普洱茶素Ⅶ組細(xì)胞凋亡率分別為8.29%、11.32%和32.36%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅶ組細(xì)胞凋亡率分別為14.10%、18.83%和40.10%，隨著作用時(shí)間和作用濃度增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量和細(xì)胞凋亡率增加，且相同劑量下誘導(dǎo)凋亡效果強(qiáng)于普洱茶素Ⅴ。

綜合來(lái)看，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡都表現(xiàn)出了明顯的誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)程度及誘導(dǎo)機(jī)制基本一致，普洱茶素Ⅴ處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)均增加，40 g·mL-1作用24 h時(shí)早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為15.49%和11.72%，差異不大，說(shuō)明普洱茶素Ⅴ可以通過(guò)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的正常程序性死亡和非正常程序性死亡這兩條途徑抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。同樣，普洱茶素Ⅵ和Ⅶ處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)均增加，且早期凋亡數(shù)增加更明顯，30 g·mL-1普洱茶素Ⅵ作用24 h時(shí)早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為16.86%和5.58%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅶ作用24 h時(shí)早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率分別為29.65%、10.45%，說(shuō)明普洱茶素Ⅵ和Ⅶ主要通過(guò)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的正常程序性死亡來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞膜基本保持其完整性。

3 討論

隨著科技的發(fā)展，乳腺癌的治療方法不斷進(jìn)步，從乳腺癌根治術(shù)、放療和化療方法的輔助應(yīng)用到靶向治療和內(nèi)分泌藥物的發(fā)展，乳腺癌患者的生存率不斷提升[16-17]，但不同亞型的乳腺癌治療效果和生存情況不盡相同，隨著新診斷人群的增加，死亡人數(shù)仍呈增加趨勢(shì)。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠用于乳腺癌安全防治的新型藥物顯得尤為必要。普洱茶作為一種日常飲品，具有多種保健功效，受到眾多消費(fèi)者喜愛(ài)。現(xiàn)有研究報(bào)道，普洱茶能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[18]，具有抗胃癌[19]、肝癌[20]、宮頸癌[21]、口腔癌[22]等多種抗癌活性，也具有抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用[15]。普洱熟茶經(jīng)微生物發(fā)酵后化學(xué)成分多樣，這些復(fù)雜的化學(xué)成分是其功能發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，普洱茶素系列化合物的活性研究報(bào)道較少，除普洱茶素Ⅰ～Ⅳ被報(bào)道具有抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HMEC損傷的保護(hù)作用、改善高糖高脂攝入引起的糖脂紊亂和高脂血癥外，尚未見(jiàn)普洱茶素Ⅴ～Ⅶ化合物的活性研究報(bào)道。

本研究首次報(bào)道了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌作用，研究結(jié)果顯示，在MTT試驗(yàn)中普洱茶素Ⅴ～Ⅶ都表現(xiàn)出對(duì)4種不同受體表型乳腺癌細(xì)胞的顯著抑制作用，其中，普洱茶素Ⅴ和Ⅵ對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，與陽(yáng)性對(duì)照藥物TAM作用相當(dāng)；在4種細(xì)胞中，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ均對(duì)BT474細(xì)胞的抑制作用較弱，這可能與其受體表型不同有關(guān)。采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法進(jìn)一步分析普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的干預(yù)作用比較一致，作用后差異最顯著的細(xì)胞信號(hào)途徑主要集中于代謝通路，其次是小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路和黏附斑信號(hào)通路，表明普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的乳腺癌抑制作用機(jī)制可能與這3條通路直接相關(guān)，這可為后續(xù)開(kāi)展其抗癌機(jī)制研究提供一定的信息基礎(chǔ)。基于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞臨床預(yù)后最差，本研究進(jìn)行了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響測(cè)試，結(jié)果顯示，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ均能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，普洱茶素Ⅴ可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的正常程序性死亡和非正常程序性死亡這兩條途徑抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)，而普洱茶素Ⅵ和Ⅶ可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的正常程序性死亡來(lái)抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)。據(jù)此推測(cè)，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ極有可能是普洱熟茶抗乳腺癌活性的功能成分之一，其抗乳腺癌作用機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究初步證明了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的抗癌活性以及對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但其發(fā)揮抗乳腺癌活性的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，不同類型的乳腺癌細(xì)胞的敏感性不盡相同，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對(duì)不同類型乳腺癌的治療價(jià)值仍需進(jìn)一步探討。本研究拓展了普洱茶素系列化合物的活性范圍，為乳腺癌防治藥物的研究在細(xì)胞水平上提供了新的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[124]顧睿， 李瑞明， 張?zhí)m蘭， 等. 普洱茶化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué)， 2011， 23（1）： 47-51.

Gu R， Li R M， Zhang L L， et al. Advances in study on chemical composition and pharmacological properties of pu-erh tea [J]. Tianjin Pharmacy， 2011， 23（1）： 47-51.

[125]顧小盼， 潘勃， 吳臻， 等. 普洱茶藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2017， 42（11）： 2038-2041.

Gu X P， Pan B， Wu Z， et al. Progress in research for pharmacological effects of pu-erh tea [J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 2017， 42（11）： 2038-2041.

[126]孟憲鈺， 付亞軒， 李明超， 等. 普洱熟茶化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2019， 45（12）： 289-294.

Meng X Y， Fu Y X， Li M C， et al. Advance in the study on the chemical composition of pu-erh tea [J]. Food and Fermentation Industries， 2019， 45（12）： 289-294.

[127]Zhou Z H， Zhang Y J， Xu M， et al. Puerins A and B， two new 8-C substituted flavan-3-ols from pu-er tea [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（22）： 8614-8617.

[128]東方， 楊子銀， 何普明， 等. 普洱茶抗氧化活性成分的LC-MS分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2008， 8（2）： 133-141.

Dong F， Yang Z Y， He P M， et al. Liquid chromatographic-mass spectrometric analysis of antioxidant compounds from pu-erh tea [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2008， 8（2）： 133-141.

[129]Wang W， Zhang L， Wang S， et al. 8-C N-ethyl-2-pyrrolidinone substituted flavan-3-ols as the marker compounds of Chinese dark teas formed in the post-fermentation process provide significant antioxidative activity [J]. Food Chemistry， 2014， 152： 539-545.

[130]顧小盼， 吳臻， 靳鳳玉， 等. 普洱茶素Ⅰ改善糖脂代謝紊亂的藥效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2018， 43（11）： 2339-2344.

Gu X P， Wu Z， Jin F Y， et al. Efficacy and mechanism of puerin Ⅰ in improving disorder of glycolipid metabolism in ApoE-/- mice [J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 2018， 43（11）： 2339-2344.

[131]王鑫玉， 趙一慕， 高云， 等. 普洱茶素Ⅱ改善高脂血癥ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究[J]. 中草藥， 2023， 54（4）： 1157-1163.

Wang X Y， Zhao Y M， Gao Y， et al. Mechanism of puerin Ⅱ on improving atherosclerosis in ApoE-/- mice with hyperlipidemia [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2023， 54（4）： 1157-1163.

[132]Gu X P， Meng Y X， Jin F Y， et al. Puerin III alleviates glucose and lipid metabolism disorders in high-fat high-sucrose diet-induced hyperlipidemic and hyperglycemic ApoE-/-mice [J]. Journal of Functional Foods， 2022， 93： 105085. doi： 10.1016/j.jff.2022.105085.

[133]Ye F， Dewanjee S， Li Y H， et al. Advancements in clinical aspects of targeted therapy and immunotherapy in breast cancer [J]. Molecular Cancer， 2023， 22（1）： 105. doi： 10.1186/s12943-023-01805-y.

[134]Siegel R L， Miller K D， Wagle N S， et al. Cancer statistics， 2023 [J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2023， 73（1）： 17-48.

[135]Feng Y X， Spezia M， Huang S F， et al. Breast cancer development and progression： risk factors， cancer stem cells， signaling pathways， genomics， and molecular pathogenesis [J]. Genes & Diseases， 2018， 5（2）： 77-106.

[136]Sviderskiy V O， Blumenberg L， Gorodetsky E， et al. Hyperactive CDK2 activity in basal-like breast cancer imposes a genome integrity liability that can be exploited by targeting DNA polymerase ε [J]. Molecular Cell， 2020， 80（4）： 682-698.

[137]陳安莉， 沈浩元， 舒王. 三陰性乳腺癌新輔助治療的臨床研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2023， 31（3）： 566-571.

Chen A L， Shen H Y， Shu W. Neoadjuvant therapy for triple negative breast cancer： clinical progress [J]. Modern Oncology， 2023， 31（3）： 566-571.

[138]Xie J， Yu H S， Song S， et al. Pu-erh tea water extract mediates cell cycle arrest and apoptosis in MDA-MB-231 human breast cancer cells [J]. Frontiers in Pharmacology， 2017， 8： 190. doi： 10.3389/fphar.2017.00190.

[139]楊瀟， 龍漢安， 肖秀麗. 不同分子亞型乳腺癌臨床特征及治療策略研究進(jìn)展[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2013， 34（2）： 76-78.

Yang X， Long H A， Xiao X L. Research progress on clinical characteristics and treatment strategies of different molecular subtypes of breast cancer [J]. Journal of Mudanjing Medical University， 2013， 34（2）： 76-78.

[140]王烈， 黎成金. 乳腺癌治療方法的變遷[J]. 中國(guó)臨床醫(yī)生， 2011， 39（7）： 12-14.

Wang L， Li C J. Changes of treatment methods for breast cancer [J]. Chinese Journal for Clinicians， 2011， 39（7）： 12-14.

[141]Zhao L J， Jia S T， Tang W R， et al. Pu-erh tea inhibits tumor cell growth by down-regulating mutant p53 [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2011， 12（11）： 7581-7593.

[142]Zhao H， Zhang M， Zhao L， et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2011， 12（3）： 1862-1875.

[143]韓莎莎， 高雄， 林曉蓉， 等. 普洱茶揮發(fā)性組分的抗癌、抗炎功能特性[J]. 食品工業(yè)科技， 2019， 40（3）： 97-105.

Han S S， Gao X， Lin X R， et al. Anti-cancer and anti-inflammatory activities of volatile components from pu-erh tea [J]. Science and Technology of Food Industry. 2019， 40（3）： 97-105.

260趙航， 盛婧雪， 李洪廣， 等. 普洱茶提取物對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2011， 24（2）： 137-140.

Zhao H， Sheng J X， Li H G， et al. Induction of apoptosis of hela cells with pu-erh tea extracts [J]. Chinese Journal of Biologicals， 2011， 24（2）： 137-140.

261Zhao X， Qian Y， Zou Y L， et al. Pu-erh tea has in vitro anticancer activity in TCA8113 cells and preventive effects on buccal mucosa cancer in U14 cells injected mice in vivo [J]. Nutrition and Cancer， 2014， 66（6）： 1059-1069.