貝萊斯芽孢桿菌YJK1鑒定及其對茶炭疽病的拮抗效果

唐朝陽 孔麗婭 胡騫 宋秋瑾 何魯錢 樓駿 王占旗 何艷 張立欽 閔莉靜

摘要：茶樹炭疽病的發(fā)生嚴重威脅著茶產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，傳統的化學農藥防治方法存在農藥殘留和環(huán)境污染等問題。以篩選到的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）YJK1生防新菌株為研究對象，探究了YJK1菌株對茶樹病害的生物防治效果。平板拮抗試驗發(fā)現YJK1菌株對茶樹炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）、藤黑鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）等多種茶樹真菌病害具有明顯的抑制效果。YJK1發(fā)酵稀釋液對茶樹炭疽菌和果生炭疽菌孢子具有明顯的抑制作用。噴施貝萊斯芽孢桿菌YJK1發(fā)酵液對白葉1號和黃金芽離體葉片的炭疽病病菌生長抑制效果明顯，先噴施YJK1菌株發(fā)酵液再接種茶樹炭疽菌，病菌生長抑制率為78.1%，同時噴施發(fā)酵液和接種炭疽菌，抑制率為61.8%。結果表明，YJK1菌株對茶樹炭疽病“防”和“治”效果均顯著。YJK1發(fā)酵液對多種真菌具有廣譜性，穩(wěn)定性測試結果說明發(fā)酵液中活性物質在80 ℃以下保持穩(wěn)定；紫外處理60 min后抑制率仍高于50%；經不同pH處理后，當pH為5～11時，抑制率無顯著區(qū)別。綜上，貝萊斯芽孢桿菌YJK1在茶樹綠色農業(yè)生產領域具有較好的應用潛力。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；茶炭疽病；拮抗菌；生物防治；穩(wěn)定性

中圖分類號：S571.1；S435.711?????????? 文獻標識碼：A??????????? 文章編號：1000-369X（2024）03-443-10

Antagonistic Activity and Utilization of Bacillus velezensis Strain YJK1 as A Biocontrol Agent Against Anthracnose on Camellia sinensis

TANG Zhaoyang1， KONG Liya1， HU Qian1， SONG Qiujin2， HE Luqian1， LOU Jun1， WANG Zhanqi1， HE Yan3， ZHANG Liqin1*， MIN Lijing1*

1. Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province， College of Life Sciences， Huzhou University， Huzhou 313000， China; 2. Zhejiang Zhongyi Testing Institute Co.， Ltd.， Hangzhou 310000， China; 3. Institute of Soil and Water Resources and Environmental Science， College of Environmental and Resource Sciences， Zhejiang University， Hangzhou 310000， China

Abstract： The tea industry is one of China's important agricultural economic resources. However， widespread outbreaks of anthracnose on Camellia sinensis pose a significant threat to the sustainability of the tea industry. Conventional approaches based on chemical pesticides face inherent challenges， including pesticide residue accumulation and environmental pollution. In this study， the biological control effect of Bacillus velezensis YJK1 on tea tree diseases was evaluated. The results demonstrat that the YJK1 isolate exhibited robust antagonistic activity against fungal diseases affecting tea trees， particularly against pathogens such as Colletotrichum camelliae， Colletotrichum fructicola and Fusarium fujikuroi. YJK1 fermentation diluent has a significant inhibitory effect on the spores of C. camelliae and C. fructicola. The inhibitory effects of YJK1 fermented liquid on the diameter of C. camelliae were evaluated with the detached tea leaves. YJK1 fermented liquid effectively prevented tea tree anthracnose with 78.1% control when applied 24 h before C. camelliae inoculation and 61.8% during simultaneous inoculation. However， its efficacy was limited （post-inoculation）. The YJK1 fermentation broth has a broad-spectrum of activity against various fungi. The antagonistic activity of the fermented liquid was stable below 80 ℃. After 60 min of UV treatment， the inhibition rate was still above 50%. And after treatment with different pH values， there was no significant difference in the inhibition rate within the pH range of 5-11. These findings suggest that B. velezensis YJK1 is a promising biocontrol agent for the management of tea plant diseases.

Keywords： Bacillus velezensis， tea anthracnose， antagonistic bacteria， biological control， stability

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的經濟作物，茶產業(yè)已成為我國脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興的支柱產業(yè)[1-2]。然而茶樹因喜濕喜溫的生活習性，加上栽培技術的局限以及抗病品種的匱乏等因素，使得茶樹真菌病害頻繁發(fā)生[3]。其中以茶樹炭疽病的發(fā)生最為普遍，據報道該病害的主要致病菌為茶樹炭疽菌（Colletotrichum camelliae）和果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）[3]。這兩種炭疽菌侵染茶樹后，會干擾茶樹的生理代謝過程，導致茶葉產量與品質下降[4-5]。

在炭疽病防治方面，生物防治因能夠克服化學農藥的缺陷，更符合綠色低碳的現代工農業(yè)發(fā)展理念，因此在農業(yè)生產中具有較高的經濟價值和環(huán)境效益。貝萊斯芽孢桿菌在自然界中廣泛分布，具有產酶能力強、次生代謝產物豐富、抗逆性強、抗菌活性高、抗菌譜廣等特點[6-9]，被用于多種植物病原菌例如煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等防治[7-10]。但是，目前關于貝萊斯芽孢桿菌防治茶樹病害的研究還未見報道。因此，從多種來源篩選新的貝萊斯芽孢桿菌菌株，發(fā)掘其抗茶樹炭疽病等植物病原菌，并將其開發(fā)為生物防治劑是一個極具應用意義的研究方向[11-12]。本研究前期在植物葉片分離得到一株具有生防功能的細菌，經形態(tài)學觀察和基因序列發(fā)育樹進化分析確定該細菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），并將其命名為YJK1。接著通過對該菌株與茶樹炭疽菌等多種病原菌的拮抗作用來明確其抗菌譜，進一步探究該菌株發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的影響，測試該菌株發(fā)酵液的抑菌活性物質的穩(wěn)定性，最后對茶樹葉片進行了離體葉片防治試驗，通過不同時間點接種病原菌來檢測YJK1菌株對茶樹葉片病變的“防”和“治”的效果。旨在明確貝萊斯芽孢桿菌YJK1的特性，探索茶樹炭疽病的生物防治，為保障我國的茶產業(yè)健康發(fā)展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

本試驗供試茶樹炭疽菌（C. camelliae）、果生炭疽菌（C. fructicola）、藤黑鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、Cytospora myrtagena、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和禾谷鐮孢（Fusarium graminearum），菌株保存于﹣80 ℃冰箱50%甘油溶液中。大豆疫霉（Phytophthora sojae）和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）存放于V8固體斜面培養(yǎng)基。YJK1是從浙江臺州采集的健康櫻桃葉片中分離得到的內生細菌，通過平板對峙法篩選獲得。

1.2 供試培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g，定容至1 000 mL。PDA培養(yǎng)基（貨號CM0139）購置于Oxoid公司。PDB液體培養(yǎng)基（貨號P9240）購置于北京索萊寶科技有限公司。V8培養(yǎng)基：進口V8蔬菜汁加入1%（m/V）碳酸鈣，充分攪拌，稀釋10倍后分裝于錐形瓶，固體V8培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min。

1.3 細菌形態(tài)學鑒定和細菌保守基因序列測定

按照《常見細菌系統鑒定手冊》[13]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[14]的方法對拮抗菌的形態(tài)進行鑒定。提取待測菌株的基因組，用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTTT-3′）擴增16 S rRNA基因序列；gyrA_F（42F：5′-CA

GTCAGGAAATGCGTACGTCTT-3′）和gyrA_R（1066R：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATT

GCT-3′）擴增gyrＡ基因序列。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶所在膠塊切割并送至生物工程（上海）有限公司進行測序。利用NCBI網站的BLAST功能對所測的16 S rRNA基因和gyrＡ基因序列進行同源性分析，確定親緣關系，使用MEGA 11軟件[15]的Neighbor-Joining（NJ）法[16]構建系統發(fā)育樹。

1.4 YJK1抗菌譜的測定

1.4.1 平板對峙試驗

將待測病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中央，25 ℃培養(yǎng)2～7 d備用。挑取YJK1菌株單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。使用打孔器（d=5 mm）在病原菌平板外周打孔，將其接種于平板中心，在距病原菌2.5 cm處接種10 μL YJK1菌夜作為處理組；同時以接種10 μL LB液體培養(yǎng)基作為空白對照組，置于28 ℃培養(yǎng)，每組3個重復。觀察測量病原菌菌絲生長直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌絲直徑－處理菌絲直徑）/對照菌絲直徑×100%

1.4.2 YJK1發(fā)酵液抑菌率測定

將YJK1菌株單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床180 r·min-1培養(yǎng)18 h，得到種子液。將種子液以2%的接種量接種于LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃搖床180 r·min-1條件培養(yǎng)72 h，得到YJK1發(fā)酵液。分裝于50 mL離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，上清液用0.22 μm無菌過濾器過濾，制得YJK1無菌發(fā)酵液。

將YJK1無菌發(fā)酵液與PDA固體培養(yǎng)基按照10%（V/V）混合均勻后倒板作為處理組；同時以含10%（V/V）LB液體培養(yǎng)的PDA固體培養(yǎng)基作為空白對照組，分別將病原菌接種于上述兩組PDA固體培養(yǎng)基的中央，每組設置3個重復，置于28 ℃觀察測量病原菌生長直徑，計算抑制率。

1.5 YJK1對炭疽菌分生孢子萌發(fā)率抑制測定

制備炭疽菌孢子懸浮液：將茶樹炭疽菌與果生炭疽菌菌株置于PDA固體培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)6 d，將菌絲塊轉移至PDB液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床180 r·min-1，培養(yǎng)3 d。之后用兩層紗布過濾菌液，液體部分經8 000 r·min-1離心10 min后，棄上清液，沉淀用滅菌超純水重懸，最后用血球計數板將分生孢子濃度調節(jié)至每毫升1×108個。

將YJK1發(fā)酵液分別稀釋5倍和10倍后與炭疽菌分生孢子混合作為處理組；同時以LB液體培養(yǎng)基與炭疽菌分生孢子混合作為空白對照組。25 ℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 h，顯微鏡觀察孢子萌發(fā)狀態(tài)，測量孢子萌發(fā)長度，每組處理重復3次。

1.6 YJK1發(fā)酵液抑菌活性物質穩(wěn)定性測定

1.6.1 熱穩(wěn)定性

將YJK1無菌發(fā)酵液分別于40、80、100 ℃的水浴鍋熱處理60 min，自然冷卻備用，以在25 ℃室溫中未處理的發(fā)酵液為對照，測定不同溫度對其發(fā)酵液抑菌率的影響。

1.6.2 紫外穩(wěn)定性

將YJK1無菌發(fā)酵液置于距30 W紫外燈20 cm處，分別照射30、45、60 min，以未照射紫外燈發(fā)酵液為對照（0 min），測定不同紫外時間處理對其發(fā)酵液抑菌活性的影響。

1.6.3 酸堿穩(wěn)定性

將YJK1無菌發(fā)酵液pH=8.65作為對照，分別用1 mol·L-1 HCl和1 mol·L-1 NaOH分別調至pH為3、5、7、9、11，靜置6 h后，調回原始pH，測定發(fā)酵液經酸堿處理后的抑菌率的變化。

最后將上述3種處理后的發(fā)酵液按20%的比例混入PDA培養(yǎng)基，每組3個重復，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔48 h，十字交叉法測量真菌生長直徑，拍照記錄。

1.7 YJK1菌株對離體茶樹葉片病斑抑制測定

分別取白葉1號和黃金芽茶樹品種新鮮健康葉片，以無菌牙簽制造傷口，將YJK1發(fā)酵液均勻噴灑，設置3個噴施處理：分別為接

種茶樹炭疽菌前24 h（“防”，用YJK1-Cc表示）、接種茶樹炭疽菌時（同時處理，用Cc&YJK1表示）和接種茶樹炭疽菌后24 h（“治”，用Cc-YJK1表示），以噴施LB液體培養(yǎng)基作為對照。置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h拍照觀察記錄病斑大小變化。每組重復3次。

茶樹病斑防治效果=（對照病斑直徑－處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%

2 結果與分析

2.1 YJK1菌株的鑒定

對生防菌YJK1菌落形態(tài)特征進行觀察，發(fā)現YJK1菌落初期呈淡乳白色、膿狀、圓形、邊緣整齊、隆起成饅頭狀；后期菌落呈淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺（圖1）。與《常

見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致。

將YJK1的16 S rRNA和gyrA基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對分析，結果顯示YJK1菌株序列與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis的序列同源性達到100%。同時利用MAGA 11軟件基于16 S rRNA和gyrA基因構建的NJ系統發(fā)育樹發(fā)現YJK1菌株與貝萊斯芽孢桿菌聚為一支（圖1B和圖1C）。結合菌落形態(tài)特征，將YJK1菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.2 YJK1對茶炭疽病防效

2.2.1 YJK1抗菌譜的探究

YJK1菌株與多種病原菌的平板對峙試驗結果如圖2所示，該菌株對茶樹炭疽菌、果生炭疽菌和藤黑鐮刀菌的抑菌率分別為70.7%、75.0%和72.5%，對大豆疫霉的抑菌率達77.3%，但對瓜果腐霉的抑菌率為0。因此，貝萊斯芽孢桿菌YJK1對腐霉無抑制作用，但對多種真菌和疫霉菌具有較好的抑制效果，YJK1對真菌具有廣泛的抗菌作用。

2.2.2 YJK1發(fā)酵液對炭疽菌分生孢子的抑制作用

YJK1發(fā)酵液對分生孢子萌發(fā)的抑制結果

如圖3所示，與對照組相比，YJK1菌株發(fā)酵液稀釋5倍對茶樹炭疽菌萌發(fā)長度抑制率為71.0%，對果生炭疽菌萌發(fā)長度抑制率為80.7%；發(fā)酵液稀釋10倍對茶樹炭疽菌萌發(fā)長度抑制率為28.9%；對果生炭疽菌萌發(fā)長度抑制率為82.5%。說明YJK1發(fā)酵液對炭疽菌分生孢子存在抑制作用。

2.2.3 YJK1發(fā)酵液對茶樹炭疽病的防治效果

利用離體白葉1號葉片測定貝萊斯芽孢桿菌YJK1發(fā)酵液對茶樹炭疽病防治效果，結果如圖4所示。與對照組相比，先接種茶樹炭疽菌24 h后噴灑YJK1菌株發(fā)酵液（Cc-YJK1），茶樹病斑無明顯變化，抑制效果不明顯；而先噴灑YJK1菌株發(fā)酵液24 h后接種茶樹炭疽菌時（YJK1-Cc）抑菌效果明顯，防效達到78.1%；接種茶樹炭疽菌與噴灑YJK1菌株發(fā)酵液同時進行時（Cc&YJK1）防效為61.8%。

利用離體黃金芽葉片測定貝萊斯芽孢桿菌YJK1發(fā)酵液對茶樹炭疽病防治效果，結果表明，與對照組相比，先接種茶樹炭疽菌再噴灑YJK1菌株發(fā)酵液時，抑制效果不明顯；而無論是先噴灑YJK1菌株發(fā)酵液后接種茶樹炭疽菌，還是同時接種，均表現為病斑直徑顯著減小，其防效分別為48.1%和34.2%。

2.3 YJK1發(fā)酵液的抑菌廣譜性與穩(wěn)定性

2.3.1 抑菌廣譜性

YJK1菌株發(fā)酵液抑制試驗結果（圖5）顯示，YJK1菌株發(fā)酵液對瓜果腐霉無明顯抑制作用，抑制率僅為6.1%；對藤黑鐮刀菌、茄病鐮刀菌和禾谷鐮孢菌均表現出較好的抑制效果，抑制率分別為51.8%、62.8%和64.8%；對茶樹炭疽菌、果生炭疽菌和C. myrtagena表現出抑制作用，抑制率分別為79.7%、84.2%和94.1%；對尖孢鐮刀菌的抑制率較差，為23.4%。由此可見，YJK1發(fā)酵液具有抑菌廣譜性。

2.3.2 穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：發(fā)酵液熱處理結果表明，經40 ℃、80 ℃處理后的抑制率與25 ℃室溫處理的相比差異不顯著，100 ℃處理后菌絲生長抑制作用雖然有所下降，但抑制率仍有41.9%（圖6D）。綜上，YJK1菌株發(fā)酵液中的活性物質具有較強的熱穩(wěn)定性。

紫外穩(wěn)定性：紫外穩(wěn)定性試驗結果顯示，雖然紫外照射后的抑制率與不照射的相比在統計學上顯著降低，但紫外照射處理間抑制率不顯著，且照射后對茶樹炭疽菌菌絲生長抑制率仍能保持在50%以上。可見，經紫外線處理YJK1菌株發(fā)酵液后，對茶樹炭疽菌菌絲生長

抑制活性影響較小，對紫外條件不敏感，紫外穩(wěn)定性較好。

酸堿穩(wěn)定性：酸堿穩(wěn)定性結果顯示，YJK1菌株發(fā)酵液經酸、堿性處理后，對茶樹炭疽菌的抑制率均高于50%；在pH處于5～11，發(fā)酵液抑制率無顯著區(qū)別，顯著高于pH3的抑制率（圖6F）。可見，YJK1菌株發(fā)酵液pH最適范圍為5～11。

3 討論

使用傳統的化學農藥不僅存在殘留問題，還會對作物產生藥害等影響，生物防治很大程度不僅能避免這些問題的發(fā)生，而且在防效上也表現突出。本研究中YJK1菌株發(fā)酵液對茶樹炭疽病病防效可達78.1%。此外藤黑鐮刀菌是鑒定到的茶樹根腐病新病原，可以造成茶樹死亡[17]，YJK1對藤黑鐮刀菌對峙抑制率達72.5%，發(fā)酵液抑制率達51.8%，說明YJK1不僅可用于葉部病害的防治，也可用于茶樹根部病害的防治。病原菌分生孢子萌發(fā)能力在病害循環(huán)周期中十分重要，本研究表面YJK1發(fā)酵液對于茶樹炭疽菌和果生炭疽菌的分生孢子萌發(fā)都具有明顯的抑制作用，在同樣發(fā)酵液濃度下，果生炭疽菌的抑制效果更為明顯。其他研究表明，貝萊斯芽孢桿菌稀釋5倍和10倍的發(fā)酵液噴灑到櫻桃樹上，其對櫻桃穿孔病的防治效果分別達78.4%和70.0%[17]。

芽孢桿菌對病原微生物的拮抗作用主要是通過分泌抑制活性的次生代謝物起作用[18]。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌主要通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物和抗菌蛋白等產生抑菌作用[19]，Trinh等[21]從黑胡椒根際中分離出的RB.DS29菌株能產生具有蛋白酶、幾丁質酶和β-葡聚糖酶活性的抑菌物質，能破壞疫霉菌等真菌的細胞壁，從而對病原真菌具有良好的拮抗效果。除了貝萊斯芽孢桿菌可以產生抑菌物質，Chowdhury等[22]明確代謝產物脂肽類和聚酮類物質如Surfactin、Fengycin和Bacillomycin D還能夠介導萵苣的防御性免疫反應。本研究中的YJK1菌株發(fā)酵液抑菌效果明顯，但菌株發(fā)酵液中成分復雜，目前尚未明確具體是哪些代謝產物對茶樹炭疽菌有拮抗效果，還需要更深入分析其抗菌物質以及相關抑菌機制。本研究還表明YJK1菌株的抑菌活性物質具有較強的穩(wěn)定性，在高溫、紫外線、酸堿條件處理后對炭疽菌菌絲的抑制率無明顯影響。這些特征為其有效成分的分離奠定了基礎。

本研究的離體葉片試驗結果表明，YJK1菌株發(fā)酵液能夠降低茶樹炭疽病的發(fā)病率，在預防茶樹病害方面有顯著效果，且與黃金芽相比，其對白葉1號病斑的抑制效果更顯著。而在白葉1號接種病原菌24 h后再噴施YJK1菌株發(fā)酵液，病斑直徑稍有增大，說明菌株對離體茶樹炭疽病的治療效果較差，還需進行田間試驗進一步驗證。未來仍需要深入研究該菌株的拮抗機理及最佳發(fā)酵條件，對其發(fā)酵液中抑菌活性物質進行分離純化、結構鑒定來提高生防制劑的實效性，并通過田間試驗檢驗其生防效果，使其能進一步開發(fā)為生物農藥，為生態(tài)友好型茶業(yè)實踐提供可行范本。

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