基于單細胞轉錄組學測序的巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中的功能研究

任凌萱 盧子琪 齊威 馮志杰

基金項目：河北省自然科學基金資助項目（H2021206314）；河北省省級科技計劃資助項目（22377703D）

引用本文：任凌萱，盧子琪，齊威，等. 基于單細胞轉錄組學測序的巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中的功能研究［J］. 中國全科醫學，2024，27（29）：3654-3663. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0596. ［www.chinagp.net］

REN L X，LU Z Q，QI W，et al. Functional analysis of macrophages in the progression of liver cirrhosis and liver cancer［J］. Chinese General Practice，2024，27（29）：3654-3663.

? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.

【摘要】 背景 肝臟巨噬細胞在構建宿主防御機制及維持機體內環境穩定中發揮重要作用，也是參與肝臟損傷和修復的重要細胞成分。單核細胞來源的巨噬細胞在基因調控以及具體功能方面與肝臟固有巨噬細胞不盡相同。90%以上的原發性肝癌發生在肝硬化的基礎上，巨噬細胞在肝硬化及肝癌疾病進展中的動態變化規律值得探討。目的 解析不同來源肝臟巨噬細胞的轉錄組學差異，分析巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中的動態變化規律，探索預防肝硬化進展為肝癌的潛在策略。方法 本研究通過從GEO數據庫獲取健康、肝硬化及肝癌組織的單細胞轉錄組學數據。健康及肝硬化數據來自GEO數據庫GSE136103數據集，取自5例健康肝臟以及5例肝硬化肝臟的數據。肝癌數據來自GEO數據庫GSE149614數據集，取自10例肝癌患者的數據。通過Seurat軟件包分別對肝硬化及肝癌樣本的數據進行聚類，鑒定各個細胞類型。將肝硬化樣本中的3簇巨噬細胞亞群提取后，分析各個亞群前200個特異性表達基因，應用Metascape在線分析軟件對各亞簇特異性表達基因進行功能分析。提取巨噬細胞亞群肝硬化特異性表達基因，通過KEGG功能分析探究巨噬細胞在肝硬化中的功能。將肝硬化以及肝癌單細胞轉錄組數據通過CellChat軟件包進行細胞間相互作用分析，對比肝硬化與肝癌樣本巨噬細胞的細胞通訊的差異。將健康對照、肝硬化以及肝癌三者不同來源的巨噬細胞通過Harmony軟件包去批次效應，之后導入Monocle軟件包進行偽時序分析，構建健康肝臟-肝硬化肝臟-肝癌巨噬細胞的演變軌跡。利用limma軟件包找尋在健康肝臟-肝硬化肝臟-肝癌巨噬細胞的演變過程中連續上調以及下調的基因，并進行功能富集分析。結果 對所有細胞進行無監督聚類，根據標記基因表達情況，共提取出3個巨噬細胞亞簇（分別為Mac1，Mac2和Mac3）。其中Mac1起源于組織駐留巨噬細胞（Kupffer細胞），Mac2以及Mac3起源于血液單核細胞，并且其數量在肝硬化組織中明顯增多。在肝硬化組織中的Mac1表現了適應性免疫系統相關功能的上調，Mac2以及Mac3亞群均表現出吞噬體相關功能以及抗原提呈功能的下調。肝硬化與肝癌樣本中巨噬細胞與其他類型細胞的通訊存在巨大的差異。某些細胞間通訊僅發生于肝硬化巨噬細胞中，這包括干擾素Ⅱ（IFN-Ⅱ）以及CD40等信號通路的細胞通訊。經過去批次效應的處理后，對健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌巨噬細胞進行偽時序分析，結果提示三組數據存在特定的時序關系。本研究發現81個在該過程中連續下調的基因，然而未發現在健康肝臟-肝硬化肝臟-肝癌巨噬細胞演變過程中連續上調的基因。功能分析提示連續下調基因存在對細菌免疫反應的功能富集。結論 肝硬化巨噬細胞可以分為3個亞群，其中Mac1來自肝臟固有Kupffer細胞，Mac2、Mac3來自血液單核細胞。肝硬化中諸多免疫相關細胞通訊例如IFN-Ⅱ以及CD40通路在肝癌中消失。健康肝臟-肝硬化肝臟-肝癌巨噬細胞演變過程存在對細菌免疫反應的持續下調，這可能加重了門脈高壓造成的腸道菌群位移的危害。對于肝硬化患者，盡早地治療門脈高壓造成的腸漏，可能是重要的治療策略。

【關鍵詞】 巨噬細胞；肝硬化；肝纖維化；肝腫瘤；單細胞轉錄組學測序；細胞間相互作用

【中圖分類號】 R 329.24 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0596

Functional Analysis of Macrophages in the Progression of Liver Cirrhosis and Liver Cancer

REN Lingxuan，LU Ziqi，QI Wei*，FENG Zhijie*

Department of Gastroenterology，the Second Hospital of Hebei Medical University/Hebei Key Laboratory of Gastroenterology/Hebei Institute of Gastroenterology/Hebei Clinical Research Center for Digestive Diseases，Shijiazhuang 050000，China

*Corresponding authors：FENG Zhijie，Chief physician/Professor；E-mail：26300056@hebmu.edu.cn

QI Wei，Associate chief physician；E-mail：28502620@hebmu.edu.cn

REN Lingxuan and LU Ziqi are co-first authors

【Abstract】 Background Hepatic macrophages play a vital role in the defense mechanisms and maintaining the internal environment stability of body，and are also major cellular components involved in liver injury and repair. Macrophages derived from hematopoietic stem cells exhibit distinct gene regulation patterns compared to resident macrophages in the liver. More than 90% of primary liver cancer occurs on the basis of cirrhosis，and the dynamic changes of macrophages in the progression of cirrhosis to hepatocellular carcinoma are worth exploring. Objective To analyze the transcriptomic differences of hepatic macrophages originating from diverse sources，analyze the dynamic pattern of macrophage changes in liver cirrhosis and liver cancer progression，and explore potential strategies for preventing the progression of liver cancer. Methods In this study，single-cell transcriptomics data of healthy，cirrhotic and hepatocellular carcinoma（HCC）tissues were obtained from the Gene Expression Omnibus（GEO）database. The healthy and liver fibrosis data were obtained from the GSE136103 dataset of the GEO database，which included samples from five healthy liver tissues and five liver cirrhosis tissues. The HCC data were obtained from the GSE149614 dataset of the GEO database，which consisted of 21 samples from ten HCC patients. Utilizing the Seurat package，a clustering analysis was conducted on the transcriptomic data derived from liver fibrosis and HCC samples to identify distinct cell types. Notably，three distinctive clusters of macrophage subtypes were identified within the fibrosis samples，from which the top 200 marker genes were extracted. Metascape online analysis software was applied to functionally analyze each subcluster-specific expressed gene. Subgroup-specific expressed genes in liver fibrosis were extracted，and the function of macrophages in cirrhosis was explored by KEGG functional analysis. The CellChat software package was utilized to analyze intercellular interactions within liver fibrosis and HCC single-cell transcriptome data，differences in macrophage communication between cirrhosis and HCC samples were compared. Additionally，normal，fibrotic and cancerous macrophages were extracted，and batch effect correction was performed using the Harmony package. Subsequently，the Monocle package was employed for pseudo-time analysis to construct the developmental trajectory of macrophages spanning from a healthy state to fibrosis and eventually to the HCC microenvironment. The limma package was utilized to find genes that are continuously up-regulated and down-regulated during the evolution of macrophages from healthy state to cirrhotic state and finally to HCC，and functional enrichment analysis was performed. Results Unsupervised clustering was performed，and a total of three macrophage subclusters（designated as Mac1，Mac2，Mac3）were identified based on the expression patterns of marker genes. Mac1 originates from tissue-resident macrophages（Kupffer cells）. Mac2 and Mac3 derived from blood monocytes and their numbers were significantly increased in cirrhotic tissue. Mac1 in cirrhotic tissue showed up-regulation of adaptive immune system-related functions. Mac2 and Mac3 subgroups show down-regulation of phagosome-related functions and antigen presentation functions. There were significant differences in communication between macrophages and other cell types in cirrhotic tissue and HCC tissue. Certain intercellular communication occurs only in cirrhotic macrophages，including cell communication of signaling pathways such as IFN-Ⅱ and CD40. After batch effect correction，pseudo-time series analysis was performed on macrophages from healthy liver，liver cirrhosis and HCC，the results suggest that there is a specific temporal relationship between the three groups of macrophages. This study identified 81 genes that were continuously down-regulated during the process，however，no genes were identified that were continuously up-regulated during the evolution of healthy-cirrhotic-HCC macrophage. Functional analysis suggested that the continuously down-regulated genes are functionally enriched for immune responses to bacteria. Conclusion Cirrhotic macrophages can be divided into three subgroups，of which Mac1 derived from liver-resident Kupffer cells and Mac2 and Mac3 derive from blood monocytes. Many immune-related cell communications in liver cirrhosis，such as IFN-Ⅱ and CD40 pathways，disappear in HCC. There is a continuous down-regulation of immune responses to bacteria in the evolution of healthy -cirrhotic-HCC macrophages，which may exacerbate the destructive effect of portal hypertension-induced gut microbiota displacement. For patients with liver cirrhosis，early treatment of portal hypertension-induced intestinal leakage（leaky gut） may be an important treatment strategy.

【Key words】 Macrophages；Liver cirrhosis；Liver fibrosis；Liver neoplasms；Single-cell transcriptomic sequencing；Intercellular interactions

肝硬化是常見的消化系統疾病之一，以肝臟廣泛的纖維化為特征。最近的研究表明，全世界有8.44億人患有慢性肝病，每年有200萬人死亡，發病率不斷上升，但是目前還沒有有效的抗纖維化的療法［1］。更為重要的是，90%以上的原發性肝癌發生在肝硬化的基礎上［2］。相較于其他實質臟器，肝臟中的巨噬細胞占肝內總免疫細胞比例最高，并且肝臟巨噬細胞在維持肝臟組織本身乃至整個機體的穩態方面具有關鍵作用。越來越多的證據表明，除免疫作用外，巨噬細胞還有其他作用，包括調節造血微環境、影響新陳代謝、介導組織修復和調控胚胎組織的成熟等功能［3］。已有研究表明，在硬化的肝臟中，與成纖維相關的巨噬細胞起源于血液單核細胞的募集分化，聚集于肝纖維化憩室（fibrotic niche），這些巨噬細胞被稱為肝纖維化憩室相關巨噬細胞。肝纖維化憩室相關巨噬細胞高表達的基因包括SPP1、LGALS3、CCL2、CXCL8、PDGFB和VEGFA等［4-7］。單細胞轉錄組學測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）為臨床對疾病發病機制的研究提供了一種新方法，允許應用新的分辨率對單個細胞群進行分析［8］。本研究使用scRNA-seq研究肝硬化中各個巨噬細胞亞群的轉錄組差異，并探討肝硬化進展為肝癌的過程中巨噬細胞相關基因及通路的動態變化。

1 材料與方法

1.1 單細胞數據的獲取

從GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫獲取健康、肝硬化及肝癌組織的單細胞數據，健康及肝硬化數據來自GEO數據庫GSE136103數據集，包括5例健康肝臟、5例肝硬化肝臟樣本；肝癌數據來自GEO數據庫GSE149614數據集，包括10例肝癌患者的數據。

1.2 對單細胞數據進行預處理：質控和標準化

將下載的健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌的單細胞轉錄組數據，分別導入Seurat軟件包，進行細胞類型的鑒定。首先對單細胞數據進行質控，使用PercentageFeatureSet函數計算線粒體比例，過濾掉線粒體比例超過20%的細胞。然后用NormalizeDate函數對數據進行標準化，使用全局縮放歸一化方法“LogNormalize”，用總表達量對每個細胞的基因表達式進行歸一化，再乘以一個縮放因子（默認為10 000），然后對結果進行log轉換。接下來，計算數據集中表現出細胞間變異的特征基因。用FindVariableFeatures函數實現，每個數據集返回2 000個高變基因，這些將用于下游主成分分析（PCA）。ScaleData函數實現線性變換，是在PCA降維之前的一個標準預處理步驟。接下來，對縮放的數據執行PCA。使用JackStraw和Elbow plot命令確定數據的維度。應用KNN算法進行聚類，然后進行非線性降維（t-distributed stochastic neighbor embedding，tSNE），利用FindMarkers命令，可以找到各個細胞類型中與其他類別的差異表達基因，作為該細胞類型的生物學標志基因。對比CellMakers網站各細胞標記基因進行細胞注釋。應用Subset函數提取出后續要進行分析的巨噬細胞。

1.3 差異基因的功能分析

在肝硬化巨噬細胞中特異性上調以及下調的基因在應用org.Hs.eg.db進行基因ID轉換后，應用clusterProfiler進行KEGG功能富集分析。應用limma軟件包分析肝硬化-肝癌疾病進展特異性上調以及下調的基因。

1.4 肝硬化、肝癌巨噬細胞與其他細胞間的通訊分析

CellChat是一個能夠從單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據中定量推斷和分析細胞間通信網絡的R包，其需要細胞的基因表達數據作為輸入，并通過整合基因表達與信號配體、受體及其輔助因子之間的相互作用的先驗知識來建立細胞-細胞交流的概率，進而對細胞間通訊做出預測，并提供多種可視化方法。分別對肝硬化組織中Mac1、Mac2、Mac3以及肝癌組織巨噬細胞與其他細胞進行細胞間通訊分析，得到巨噬細胞在肝硬化與肝癌組織和各種細胞通訊的通路，對比肝硬化以及肝癌組織的特異性通路。

1.5 健康、肝硬化、肝癌組織巨噬細胞的偽時序分析

將健康、肝硬化、肝癌組織巨噬細胞數據整合，經Harmony包去批次效應后，將整合數據導入Monocle包，應用DDRTree函數進行降維，得出細胞轉化順序。并用differentialGeneTest函數尋找各組隨偽時間變化的

基因。

1.6 基于在線分析軟件的功能富集分析

Metascape是一個功能強大的基因功能注釋分析工具，可進行批量基因和蛋白質的分析并實現對基因功能分析。本研究應用Metascape在線分析軟件對特異性富集基因進行功能分析。

2 結果

2.1 巨噬細胞亞聚類及其功能分析

提取單核巨噬細胞數據，分為10個細胞簇，分別為單核細胞（Mono1，Mono2，Mono3），巨噬細胞（Mac1，Mac2，Mac3），樹突狀細胞（cDC1，cDC2，pDC）（圖1A），并使用dittoSeq函數顯示各個亞簇在健康組及肝硬化組所占的比例（圖1B），其中Mac1在健康組織中比例較高，Mac2、Mac3在肝硬化組織中所占比例較高。提取3簇巨噬細胞（圖1C、1D），并顯示各個亞簇top5標記基因（圖1E）。在3簇巨噬細胞中，Mac1高表達基因CD163和MARCO，傾向于組織駐留巨噬細胞（Kupffer細胞），Mac2以及Mac3高表達TREM2，CD9和MNDA，傾向于單核細胞起源的巨噬細胞（圖1F）。

提取的Mac1、Mac2以及Mac3亞群各自top200標記基因，導入網頁分析工具Metascape中做功能富集分析探究各簇巨噬細胞功能（圖2）。Mac1的功能主要為“固有免疫反應”“免疫反應調節”以及“炎癥反應”。Mac2的功能主要為“核糖體，細胞質”“含有TRBP的復合物（DICER、RPL7A、EIF6、MOV10和60S核糖體顆粒的亞基）”以及“核糖體組裝”。Mac3的功能主要為“血管生成”“傷口反應”以及“細胞運動的正向調節”。

將Mac1、Mac2以及Mac3亞群中肝硬化組織特異性上調以及下調的基因進行分析。結果發現Mac1亞群的差異基因主要為上調基因，Mac2以及Mac3亞群的差異基因主要是下調基因。后續對Mac1中的上調基因，以及Mac2和Mac3亞群的下調基因進行KEGG功能富集分析（圖3）。根據KEGG的結果，在肝硬化組織中的Mac1表現了適應性免疫系統（adaptive immune system）的相關功能的上調。Mac2以及Mac3亞群均表現出吞噬體（phagosome）相關功能以及抗原提呈功能的下調。提示肝硬化中Mac2以及Mac3亞群巨噬細胞可能存在免疫功能的衰退。

2.2 肝硬化以及肝癌中巨噬細胞亞群細胞通訊分析

肝硬化與肝癌樣本中巨噬細胞與其他類型細胞的通訊存在巨大的差異（圖4A、4B）。某些細胞間通訊僅發生于肝硬化巨噬細胞中，這包括干擾素（IFN）-Ⅱ以及CD40等信號通路的細胞通訊（圖4C、4D）。在肝硬化樣品中，IFN-Ⅱ信號從T細胞以及自然殺傷細胞（NK細胞）發出，并且Mac1、Mac2以及Mac3通過IFNGR1以及IFNGR2接收相關信號。而CD40信號的通訊僅存在于單核細胞起源的Mac2以及Mac3，信號由T細胞發出，由ITGA5、ITGB1、ITGAM以及ITGB2接收。而上述信號通信均沒有出現在肝癌的樣品中，這反映了從肝硬化到肝癌巨噬細胞亞群細胞通訊存在劇烈的變化，IFN-Ⅱ以及CD40等免疫相關信號通路減弱，這同樣也是巨噬細胞存在免疫功能衰退的又一個證據。

2.3 巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中的偽時序分析

肝硬化-肝癌疾病進展常經過數年的時間，本研究充分利用偽時序分析的技術對上述動態過程進行了分析。經過去批次效應后，健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌巨噬細胞單細胞轉錄組學數據進行了聯合分析（圖5A）。通過基因表達的梯度構建了健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌巨噬細胞的偽時序分析（圖5B、5C）。整體上說，健康肝臟、肝硬化肝臟巨噬細胞的時序較為接近，而肝癌巨噬細胞距離前兩個較遙遠。

2.4 肝硬化-肝癌疾病進展中巨噬細胞的功能分析

健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌巨噬細胞的變化可以考慮為同一個病理生理過程，將健康肝臟與肝硬化肝臟巨噬細胞的差異基因，肝硬化肝臟與肝癌巨噬細胞的差異基因分別提取并取交集（圖6A、6B）。結果未發現任何連續上調的基因。連續下調的基因有81個（圖6C），其功能富集分析提示與細菌的免疫反應高度相關（圖6D）。由于肝硬化患者門脈壓力上升造成腸道菌群移位，通過門靜脈進入肝臟的細菌以及毒素的增加，進一步加重了肝臟的慢性炎癥以及肝硬化的進程。而本研究分析發現一系列巨噬細胞存在免疫功能衰退的現象，可能會進一步加重上述過程。

3 討論

早期階段的肝硬化常伴隨炎癥反應，這時的巨噬細胞主要扮演著清除細菌和細胞垃圾的角色。此外，研究還發現巨噬細胞能夠分泌多種細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素（IL）-6等，這些細胞因子可以促進肝細胞的生長和修復［9］。肝硬化的中期階段，隨著炎癥反應的加劇，巨噬細胞逐漸轉化為促炎細胞，釋放大量的炎癥因子和細胞因子，如IL-1β和IL-18等。這些因子能夠引起肝臟細胞的凋亡和纖維化，從而加速肝硬化的發展［10］。在肝硬化晚期階段，巨噬細胞成為肝臟內纖維化細胞的主要來源之一。巨噬細胞可以通過分泌轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子，促進肝臟中成纖維細胞的增生和轉化，從而形成肝臟內的纖維化病變［11-13］。

有文獻證實具有血管生成潛力的單核細胞在肝再生部位積累［14］。并且有研究發現在慢性肝病期間，巨噬細胞通過分泌促血管生成生長因子協助形成復雜的血管網絡［15］。本研究結果印證了上述觀點，Mac2以及Mac3巨噬細胞亞群作為單核細胞來源的巨噬細胞，在功能富集分析中提示了血管生成（angiogenesis）相關的功能富集。Mac2亞群富集了VEGFA-VEGFR2的信號，而Mac3亞群功能富集分析中排名第一位的即為血管生成。而Mac1亞群作為肝臟固有的Kupffer細胞，主要發揮了固有免疫（innate immune）的相關功能。

肝硬化伴隨著腸肝軸功能的異常，門脈壓力上升造成的腸道水腫導致了腸道菌群失調、腸道屏障受損和細菌轉位增加［16］。巨噬細胞作為一種具備抗原提呈功能的細胞［17］，增加的細菌轉位可能會導致肝硬化組織中巨噬細胞抗原提呈功能的變化。本研究中發現，肝硬化中的巨噬細胞確實表現出抗原提呈功能的富集，但是單核細胞起源的Mac2以及Mac3巨噬細胞亞群中出現了抗原提呈功能的下調。

肝硬化-肝癌疾病進展中巨噬細胞偽時序以及后續的功能分析提示了門脈壓力上升造成的腸漏（leaky gut）與巨噬細胞功能的改變可能具有協同的效應。巨噬細胞中連續下調的基因有81個，其功能富集分析提示與細菌的免疫反應高度相關。目前已經有研究提示了肝硬化患者門脈壓力上升造成了腸道菌群移位［18-19］。肝硬化患者腸道菌群的改變與患者的死亡率相關，并且經頸靜脈肝內門體分流術降低門脈壓力后，腸道菌群可以被重構［20-21］。巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中免疫功能逐漸消退，“守門員”功能失守，可能是肝硬化形成以及進一步進展為肝癌的一個標志性事件。

在肝硬化進展至肝癌過程通常需要數年的時間，由于巨噬細胞存在眾多持續表達下調的基因，這可能提示肝癌中巨噬細胞表型可能在數年前的肝硬化階段已經存在。并且這種早期出現衰退的巨噬細胞表型，由于顯著地富集了針對細菌免疫反應的功能，可能與門脈高壓之下腸肝軸的異常狀態有關。經頸靜脈肝內門體分流術是一種潛在的可以通過降低門脈壓力從而減輕腸漏的技術手段，但是該技術是否可以通過早期干預腸道菌群移位減緩肝硬化進展至肝癌仍需要更多的研究以及探討。

綜上所述，本研究通過生物信息學的技術手段，對公共數據庫中健康肝臟、肝硬化肝臟以及肝癌樣本數據的分析，探討了巨噬細胞在肝硬化-肝癌疾病進展中的功能。通過細胞通訊，偽時序分析等技術充分挖掘了肝硬化-肝癌疾病進展中巨噬細胞表型的變化，為以肝臟巨噬細胞為靶點預防肝硬化進展為肝癌的潛在策略提供了思路。健康肝臟-肝硬化肝臟-肝癌巨噬細胞演變過程存在對細菌免疫反應的持續下調，這可能與門脈高壓造成的腸道菌群位移不斷通過門靜脈進入肝臟具有協同作用，促進了肝臟的慢性炎癥以及肝硬化的進展。對于肝硬化患者，盡早地治療門脈高壓造成的腸漏并切斷其與巨噬細胞免疫功能衰退的協同作用可能是重要的治療策略。

作者貢獻：任凌萱提出研究思路，設計研究方案，進行數據分析，繪圖，撰寫初稿；盧子琪負責數據收集、篩選，共同進行研究命題的提出、設計及論文書寫；齊威提出研究思路，設計研究方案，負責論文起草；馮志杰提出研究思路，設計研究方案，負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。

參考文獻

CHUNG B K，?GAARD J，REIMS H M，et al. Spatial transcriptomics identifies enriched gene expression and cell types in human liver fibrosis［J］. Hepatol Commun，2022，6（9）：2538-2550. DOI：10.1002/hep4.2001.

KIM E，VIATOUR P. Hepatocellular carcinoma：old friends and new tricks［J］. Exp Mol Med，2020，52（12）：1898-1907. DOI：10.1038/s12276-020-00527-1.

TACKE F，ZIMMERMANN H W. Macrophage heterogeneity in liver injury and fibrosis［J］. J Hepatol，2014，60（5）：1090-1096. DOI：10.1016/j.jhep.2013.12.025.

RAMACHANDRAN P，DOBIE R，WILSON-KANAMORI J R，et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level［J］. Nature，2019，575（7783）：512-518. DOI：10.1038/s41586-019-1631-3.

MARCELLIN P，KUTALA B K. Liver diseases：a major，neglected global public health problem requiring urgent actions and large-scale screening［J］. Liver Int，2018，38（Suppl 1）：2-6. DOI：10.1111/liv.13682.

ANGULO P，KLEINER D E，DAM-LARSEN S，et al. Liver fibrosis，but no other histologic features，is associated with long-term outcomes of patients with nonalcoholic fatty liver disease［J］. Gastroenterology，2015，149（2）：389-397.e10. DOI：10.1053/j.gastro.2015.04.043.

RAMACHANDRAN P，HENDERSON N C. Antifibrotics in chronic liver disease：tractable targets and translational challenges［J］. Lancet Gastroenterol Hepatol，2016，1（4）：328-340. DOI：10.1016/S2468-1253（16）30110-8.

LIANG W C，FENG Z J，RAO S T，et al. Diarrhoea may be underestimated：a missing link in 2019 novel coronavirus［J］. Gut，2020，69（6）：1141-1143. DOI：10.1136/gutjnl-2020-320832.

DICK S A，WONG A，HAMIDZADA H，et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles［J］. Sci Immunol，2022，7（67）：eabf7777. DOI：10.1126/sciimmunol.abf7777.

YAN J，ZHANG Y M，YU H R，et al. GPSM1 impairs metabolic homeostasis by controlling a pro-inflammatory pathway in macrophages［J］. Nat Commun，2022，13（1）：7260. DOI：10.1038/s41467-022-34998-9.

GUILLIAMS M，BONNARDEL J，HAEST B，et al. Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches［J］. Cell，2022，185（2）：379-396.e38. DOI：10.1016/j.cell.2021.12.018.

AIZARANI N，SAVIANO A，SAGAR，et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors［J］. Nature，2019，572（7768）：199-204. DOI：10.1038/s41586-019-1373-2.

ASHBURNER M，BALL C A，BLAKE J A，et al. Gene ontology：tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium［J］. Nat Genet，2000，25（1）：25-29. DOI：10.1038/75556.

SCHAUER D，STARLINGER P，ZAJC P，et al. Monocytes with angiogenic potential are selectively induced by liver resection and accumulate near the site of liver regeneration［J］. BMC Immunol，2014，15：50. DOI：10.1186/s12865-014-0050-3.

RAMIREZ-PEDRAZA M，FERN?NDEZ M. Interplay between macrophages and angiogenesis：a double-edged sword in liver disease［J］. Front Immunol，2019，10：2882. DOI：10.3389/fimmu.2019.02882.

ALBILLOS A，MARTIN-MATEOS R，VAN DER MERWE S，et al. Cirrhosis-associated immune dysfunction［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2022，19（2）：112-134. DOI：10.1038/s41575-021-00520-7.

UNANUE E R. Antigen-presenting function of the macrophage［J］. Annu Rev Immunol，1984，2：395-428. DOI：10.1146/annurev.iy.02.040184.002143.

GEDGAUDAS R，BAJAJ J S，SKIECEVICIENE J，et al. Circulating microbiome in patients with portal hypertension［J］. Gut Microbes，2022，14（1）：2029674. DOI：10.1080/19490976.2022.2029674.

SCHIERWAGEN R，ALVAREZ-SILVA C，MADSEN M S A，et al. Circulating microbiome in blood of different circulatory compartments［J］. Gut，2019，68（3）：578-580. DOI：10.1136/gutjnl-2018-316227.

LI M H，LI K，TANG S H，et al. Restoration of the gut microbiota is associated with a decreased risk of hepatic encephalopathy after TIPS［J］. JHEP Rep，2022，4（5）：100448. DOI：10.1016/j.jhepr.2022.100448.

GITTO S，VIZZUTTI F，BALDI S，et al. Transjugular intrahepatic Porto-systemic shunt positively influences the composition and metabolic functions of the gut microbiota in cirrhotic patients［J］. Dig Liver Dis，2023，55（5）：622-628. DOI：10.1016/j.dld.2022.11.017.

（收稿日期：2023-10-13；修回日期：2024-01-03）

（本文編輯：賈萌萌）