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紫外及電子束輻照對遠志中黃曲霉毒素及有效成分的影響

2024-07-22 00:00:00趙志磊陳萌崔炎李迅馬力輝
安徽農業科學 2024年13期

摘要 [目的]探究電子束及紫外輻照對遠志中黃曲霉毒素的降解率及有效成分的影響。[方法]利用高效液相色譜法研究不同輻照劑量的電子束、不同含水量、不同時間的紫外輻照對遠志中黃曲霉毒素的降解率及有效成分的影響。[結果]電子束輻照劑量越大,遠志中黃曲霉毒素的降解率越高。經10 kGy電子束輻照處理,遠志中黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率分別為19.27%、19.64%、15.62%、15.14%;6 kGy輻照處理含水量28%的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率均最高;紫外輻照時間越長,遠志中黃曲霉毒素的降解率越高。黃曲霉毒素的降解率隨著輻照距離的增加而減小。經不同輻照處理后遠志中細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量變化不顯著。[結論]采用電子束輻照結合調整遠志含水量及紫外輻照處理均能對遠志中黃曲霉毒素進行有效降解,且對有效成分影響不大。

關鍵詞 遠志;黃曲霉毒素;紫外;電子束;輻照;高效液相色譜法;有效成分

中圖分類號 S124.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611(2024)13-0144-05

doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2024.13.036

開放科學(資源服務)標識碼(OSID):

Effects of Ultraviolet and Electron Beam Irradiation on Aflatoxins and Active Components in Polygala

ZHAO Zhi-lei1,2,3,4,CHEN Meng1,CUI Yan1 et al

(1.College of Quality and Technology Supervision, Hebei University, Baoding,Hebei 071002;2.National and Local Joint Engineering Research Center for Metrology Instruments and Systems, Baoding,Hebei 071002;3.Key Laboratory of Energy Metering and Safety Testing Technology of Hebei Province, Baoding,Hebei 071002;4. Institute of Geographical Indications, Hebei University, Baoding,Hebei 071002)

Abstract [Objective]To investigate the effect of electron beam and ultraviolet irradiation on the degradation rate and active components of aflatoxin in Polygala tenuifolia.[Method] High performance liquid chromatography was used to study the effects of different irradiation doses of electron beams, different water contents and different durations of ultraviolet radiation on the degradation rate and active components of aflatoxin in Polygala.[Result]The higher the electron beam irradiation dose, the higher the degradation rate of aflatoxin in Polygala.After 10 kGy electron beam irradiation, the degradation rates of aflatoxins AFB1, AFB2, AFG1, and AFG2 in Polygala tenuifolia were 19.27%, 19.64%, 15.62%, and 15.14%, respectively. The degradation rates of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 were the highest in polygala with 28% water content treated with 6 kGy irradiation. The longer the UV irradiation time, the higher the degradation rate of aflatoxin in polygala. The degradation rate of aflatoxins decreased with the increase of irradiation distance. There was no significant change in the contents of tenuifolin, polygaltrione and 3,6′-sinaloyl sucrose after different irradiation treatments.[Conclusion]Electron beam irradiation combined with water content treated and ultraviolet irradiation can effectively degrade aflatoxins in polygala, and has little effect on active components.

Key words Polygala;Aflatoxins;Ultraviolet;Electron beam;Irradiation;HPLC;Active components

基金項目 河北省重點研發計劃項目(21344801D)。

作者簡介 趙志磊(1977—),男,河北辛集人,教授,博士,從事食品質量檢測技術研究。

*通信作者,教授,博士,碩士生導師,從事食品質量檢測技術研究。

收稿日期 2023-09-18

遠志又名細葉遠志,是遠志科植物遠志或卵葉遠志的干燥根[1],主要分布于西南和華南地區[2],具有寧心安神、化痰消腫、益智的功效[3],主要用于治療心腎不交所致的失眠多夢、健忘驚悸等癥狀[4]。現代藥理研究表明,遠志具有抗抑郁、抗癡呆、腦保護活性、抗腫瘤等作用[5],遠志中的主要功能成分為三萜皂苷類、糖和糖酯苷類、黃酮類、生物堿類等[6]。黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的次生代謝產物[7],屬于Ⅰ類致癌物,對人體危害極大,是當今自然界毒性最強的天然物質,通常存在于玉米、大米、花生、干果等主糧作物中[8]。目前常見的黃曲霉毒素主要有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等[9]。藥典中規定,遠志中黃曲霉毒素B1的含量不得超過5 μg/kg,總量不得超過10 μg/kg[10],而遠志藥材中黃曲霉毒素超標率達到7.1%。黃曲霉毒素污染已經成為制約遠志藥品安全和產業可持續發展的瓶頸問題。

當前,用于去除或減少黃曲霉毒素的技術可以概括為物理、化學和生物3類方法[11]。輻照技術是一種保存和提高食品安全性的技術,目前采用的輻射法主要有紫外輻射法、60Co、137Cs產生的γ射線法、電子束法[12]。電子束輻照技術具有耗能少、加工時間短、適合大規模普及的優點,《中藥輻照滅菌技術指導原則》已將高能電子束作為降低藥品微生物含量的滅菌方式之一[13]。Khalil等[14]研究發現輻照可以有效降低玉米中的黃曲霉毒素含量。王守經等[15]研究發現電子束和γ射線均可以對溶液和小麥中的黃曲霉毒素進行降解,電子束降解效果優于γ射線。我國的食品安全國家標準《食品輻照加工衛生規范》規定,中藥材的輻照劑量不允許超過10 kGy[16]。紫外線照射因其光敏性而被認為是破壞黃曲霉毒素的有效物理方法,作為一種非熱食品凈化技術,具有實用、成本低、環保的優點[8],在農藥和獸藥殘留、藻毒素消減等領域均有應用,對于面粉、花生、玉米中的AFB1均有明顯的降解效果。目前關于紫外及電子束輻照降解中藥材遠志中黃曲霉毒素的研究鮮見報道。

該研究以遠志為研究對象,利用高效液相色譜法研究了不同輻照劑量的電子束、不同含水量、不同時間的紫外輻照對遠志中黃曲霉毒素的降解率及有效成分的影響,旨在應用輻照技術降解遠志中的黃曲霉毒素,為保障遠志的質量安全提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材與試劑。

遠志,安國藥材市場;黃曲霉毒素標準品,上海安譜璀世標準技術服務有限公司;細葉遠志皂苷(純度≥98.8%)、3,6′-二芥子酰基蔗糖(純度≥99.4%)、遠志口三酮(純度≥99.8%),上海詩丹德標準技術服務有限公司;甲醇、乙腈、磷酸、石油醚,色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;吐溫-20(Tween-20),北京Solarbio公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉,分析純,天津市北聯精細化學品開發有限公司;Molantom18100d摩爾原子型純水機,上海摩勒科學儀器有限公司。

1.1.2 儀器與設備。

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀,美國Agilent 公司;Athena C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),上海安譜實驗科技股份有限公司;PX222DZH電子天平,美國奧豪斯儀器有限公司;超聲振蕩器,深圳市超藝達科技有限公司;離心機,德國Ohaus公司;移液槍,上海寶子德科學儀器有限公司;渦旋振蕩器、免疫親和柱,涿州凱斯科生物技術有限公司;水浴鍋,上海葉招科技有限公司;旋轉蒸發儀,上海葉招科技有限公司。

1.1.3 輻照裝置。

使用河北速能輻照加工有限公司的電子束作為輻照源對遠志進行輻照處理。

實驗室自購紫外消毒燈作為輻照源,在室溫條件下進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理。用70%甲醇水配制200 ng/mL AFB1、200 ng/mL AFG1、100 ng/mL AFB2、100 ng/mL AFG2混合溶液,取5.00 g藥材浸泡10 s,在通風櫥中揮發甲醇水溶劑至干,然后進行輻照處理。

1.2.2 輻照方法。該試驗設定電子束不同輻照劑量為2、4、6、8、10 kGy,輻照0 kGy的處理為對照;不同含水量為20%、24%、28%,輻照劑量為6 kGy,以未添加水分的遠志(含水量12%)為對照;

設定紫外輻照時間分別為10、20、30、40、50 min,輻射0 min的處理為對照;紫外輻照距離為2、12、22、32 cm,輻照時間為30 min;分析對比輻照前后遠志中黃曲霉毒素以及有效成分的含量變化。

1.2.3 標準溶液制備。吸取50 μL黃曲霉毒素母液(1.0 μg/mL AFB1、1.0 μg/mL AFG1、0.5 μg/mL AFB2、0.5 μg/mL AFG2)置于2 mL 容量瓶中,用甲醇定容至2 mL,混勻稀釋后,制成對照品儲備液(50 ng/mL)。分別吸取對照品儲備液 100、200、400 μL至2 mL 容量瓶中,添加甲醇定容至1 mL,配制 5、10、20、50 ng/mL AFB1、AFG1以及2.5、5.0、10.0、25.0 ng/mL AFB2、AFG2標準混合溶液,4 ℃低溫避光保存。

分別準確稱取1.00 mg細葉遠志皂苷、3,6′-二芥子酰基蔗糖、遠志口三酮標準品,用甲醇配制成1 mg/mL標準儲備液,稀釋配制成25、50、75、100、150、200、500 μg/mL標準溶液,4 ℃低溫避光保存。

1.2.4 遠志中黃曲霉毒素及有效成分的提取。

1.2.4.1

遠志中4種黃曲霉毒素的提取。稱取遠志粉末5.00 g,置于100 mL容量瓶中,加入1.00 g氯化鈉,并加入體積分數84%乙腈-水溶液定容至100 mL,渦旋振蕩3 min,超聲振蕩30 min,冷卻至室溫,使用84%乙腈-水溶液再次定容到l00 mL,搖勻靜置。待溶液均勻后,提取30 mL至50 mL離心管中,離心5 min(4 000 r/min)。取20 mL上清液至50 mL離心管中,再加入20 mL體積分數1% Tween-20-水溶液混勻,過濾。取上清液25 mL,過免疫親和柱,依次用10 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、10 mL超純水洗脫免疫親和柱各1次,至空氣進入親和柱中,棄去全部流出液,抽干小柱準確加入l mL甲醇洗脫,收集全部洗脫液于干凈的試管中,過0.22 μm微孔濾膜。

1.2.4.2 遠志中細葉遠志皂苷的提取。取本品粉末(過3號篩)約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)1 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液25 mL,置圓底燒瓶中,蒸干,殘渣加10%氫氧化鈉溶液50 mL,加熱回流2 h,放冷,用鹽酸調節pH為4~5,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次50 mL,合并正丁醇液,回收溶劑至干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉移至25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液上機分析。

1.2.4.3

遠志中3,6′-二芥子酰基蔗糖、遠志口三酮的提取。取本品粉末(過3號篩)約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定重量,加熱回流1.5 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液上機分析。

1.2.5 檢測條件。

1.2.5.1

黃曲霉毒素檢測條件。Agilent 1260液相系統;Athena C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速1 mL/min;流動相為甲醇-乙腈-水溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水=22∶22∶56);進樣體積為20 μL;柱溫40 ℃;熒光檢測器:激發波長360 nm,發射波長440 nm。

1.2.5.2

有效成分檢測條件。Agilent 1260液相系統;色譜柱為Athena C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速1 mL/min;進樣體積20 μL;柱溫30 ℃;紫外檢測器;流動相與檢測波長如表1所示。

1.3 數據分析

試驗用Microsoft Excel 2016軟件進行初步處理和分析,用SPSS 24.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性范圍

吸取配制好的AFB1、AFG1、AFB2、AFG2系列標準混合溶液進樣分析,獲得黃曲霉毒素標準曲線的線性方程和線性范圍如表2所示。

吸取25~500 μg/mL細葉遠志皂苷、3,6′-二芥子酰基蔗糖、遠志口三酮標準溶液進樣分析并繪制標準曲線,標準曲線的線性方程和線性范圍如表3所示。

2.2 精密度試驗

吸取2、5、10、20、50 ng/mL 5種濃度的黃曲霉毒素溶液和25、50、100、250、500 μg/mL 5種濃度的細葉遠志皂苷標準溶液,1 d內連續進樣3次,計算3次峰面積平均值,測定日內精密度。

測試不同濃度AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、細葉遠志皂苷溶液后,儀器1 d內連續進樣的RSD分別為1%~4%、1%~5%、1%~5%、1%~5%、0.5%~3.0%,儀器進樣相對誤差均在5%以內,說明測定方法具有良好的重復性和穩定性。

2.3 添加回收率

吸取10、20、30 ng/mL AFB1、AFG1,5、10、15 ng/mL AFB2、AFG2標準混合溶液,采用HPLC分析檢測。添加回收試驗結果顯示,不同濃度AFB1、AFB2、AFG1、AFG2回收率均在80%~120%,說明黃曲霉毒素回收率良好。

2.4 不同輻照劑量的電子束處理對遠志中黃曲霉毒素降解率的影響

由圖1可知,遠志中不同類型的黃曲霉毒素的降解率總體上隨輻照劑量的增加而增大,經10 kGy 電子束輻照處理,遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率分別為19.27%、19.64%、15.62%、15.14%,比8 kGy電子束輻照處理的黃曲霉毒素的降解率分別高4.81百分點、5.90百分點、0.75百分點、0.76百分點。其中,10 kGy輻照處理的AFB1、AFB2降解率為8 kGy 處理的1.3和1.4倍,是4 kGy輻照處理降解率的4.6和2.6倍。其中2 kGy處理的AFB2降解率明顯高于其他3種黃曲霉毒素的降解率,但與4和 6 kGy處理的AFB2間差異不顯著(P>0.05)。6、8和 10 kGy處理的AFG1、AFG2的降解率差異不顯著(P>0.05)。

2.5 電子束輻照處理下不同含水量對遠志中黃曲霉毒素降解率的影響

由圖2可知,遠志中4種黃曲霉毒素的降解率隨含水量的增加而增大,經6 kGy輻照處理,含水量28%的遠志所含AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率最高,分別為29.75%、33.40%、26.38%、37.54%,比含水量24%的遠志所含黃曲霉毒素的降解率分別提高8.39百分點、14.96百分點、9.25百分點、14.49百分點;2種含水量下4種黃曲霉毒素降解率差異達到顯著水平(P<0.05)。其中含水量28%的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率分別是含水量12%遠志的降解率的3.08、4.27、1.87和2.76倍。因此,提高水分含量對電子束輻照遠志中的黃曲霉毒素有促進作用。

2.6 不同紫外輻照時間對遠志中黃曲霉毒素降解率的影響

由圖3可知,遠志中黃曲霉毒素的降解率隨輻照時間的增加而增大。經輻照50 min處理,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率分別為42.22%、43.81%、61.73%、60.96%,比輻照40 min處理的黃曲霉毒素降解率分別提高4.07百分點、3.45百分點、13.36百分點、9.38百分點,AFB1、AFG1、AFG2的降解率顯著高于40 min的處理(P<0.05)。其中,經40 min處理的AFG1、AFG2降解率比30 min處理的降解率分別高1.01、1.23倍。經輻照40和50 min處理的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率與30 min的降解率差異均達到顯著水平(P<0.05)。

2.7 不同紫外輻照距離對遠志中黃曲霉毒素降解率的影響

由圖4可知,遠志中黃曲霉毒素的降解率隨輻照距離的增大而減小,2、12、22 cm的處理之間降解率差異達到顯著性水平(P<0.05)。輻照距離為2 cm的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率最高,分別為30.48%、25.10%、24.01%、13.05%,比輻照距離12 cm時AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率分別高5.98百分點、10.54百分點、8.98百分點、11.24百分點。

2.8 不同輻照劑量的電子束對遠志中有效成分的影響

由圖5可知,遠志經不同輻照劑量的電子束輻照處理后細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量變化不大,細葉遠志皂苷含量為0.50~0.51 mg/g,遠志口三酮含量為1.57~2.17 mg/g;3,6′-二芥子酰基蔗糖含量為12.53~12.80 mg/g。3種有效成分含量經不同劑量的電子束輻照處理均無顯著差異(P>0.05)。因此,10 kGy以內的電子束輻照處理對遠志中有效成分含量無顯著影響。

2.9 不同含水量對電子束輻照遠志中有效成分的影響

由圖6可知,不同含水量處理的遠志經6 kGy電子束輻照處理,細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量總體上均低于對照組(含水量12%),其中,含水量28%的遠志樣品經6 kGy 電子束輻照處理與對照相比,細葉遠志皂苷含量下降了5.88%,遠志口三酮含量下降了8.53%,3,6′-二芥子酰基蔗糖含量下降了1.89%。但同一有效成分不同含水量間差異不顯著(P>0.05),因此,不同含水量對電子束輻照遠志中有效成分含量沒有顯著影響。

2.10 不同紫外輻照時間對遠志中有效成分的影響

由圖7可知,遠志經不同時間紫外輻照處理后細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量變化不大,經50 min 紫外輻照處理樣品與未輻照樣品比較,細葉遠志皂苷含量上升了0.1%,遠志口三酮含量上升了3.8%,3,6′-二芥子酰基蔗糖含量下降了0.7%。與對照組相比,經50 min 紫外輻照處理樣品的3種有效成分含量雖然出現了一定變化,但均沒有顯著差異(P>0.05),因此紫外輻照時間對遠志中有效成分含量沒有顯著影響。

2.11 不同紫外輻照距離對遠志中有效成分的影響

由圖8可知,經不同距離的紫外輻照后,遠志中細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量變化不大,細葉遠志皂苷含量為0.48~0.50 mg/g,遠志口三酮含量為2.12~2.23 mg/g,3,6′-二芥子酰基蔗糖含量為12.39~12.59 mg/g。3種有效成分經不同距離的紫外輻照處理后,有效成分含量均出現上升趨勢,這可能與輻照使水分蒸發所致。不同處理間有效成分含量差異不顯著(P>0.05)。因此,不同距離的紫外輻照不會對遠志的有效成分含量造成顯著影響。

3 結論與討論

輻照滅菌法被稱為“冷滅菌”,不會引起被輻照物明顯的溫度升高,對揮發性、熱敏性中藥的殺菌具有一定的優越性。該試驗采用2、4、6、8、10 kGy的電子束輻照處理遠志中黃曲霉毒素,結果表明,電子束輻照劑量越大,遠志中黃曲霉毒素的降解率越高。增加遠志的水分含量對黃曲霉毒素的降解起到促進作用,其中含水量28%的遠志中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的降解率顯著高于含水量12%的遠志的降解率。

紫外輻照可用于降解有機污染物。該試驗表明,經紫外輻照處理,遠志中黃曲霉毒素有著明顯的降解,降解率隨著時間的增加而增大。隨著紫外輻照距離的增加,黃曲霉毒素的降解率減小。經40和50 min紫外輻射處理的遠志中G族黃曲霉毒素的降解效果優于B族黃曲霉毒素,這可能與不同類型的黃曲霉毒素分子結構性有關。

經不同劑量的電子束輻照處理后,遠志中細葉遠志皂苷、遠志口三酮、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量變化不顯著。隨著紫外輻照時間和輻照距離的增加,3種有效成分含量與對照組相比均沒有顯著差異。因此,采用電子束輻照結合調整遠志含水量以及紫外輻照結合適當的輻照距離的處理方式可以對遠志中的黃曲霉毒素進行有效降解,同時不會影響其有效成分含量。該研究為應用紫外及電子束輻照技術降解遠志中的黃曲霉毒素提供了技術支持和參考。

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