三氧化二砷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系表達(dá)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用

[摘要]目的探討三氧化二砷（As2O3）對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）（DNMT1、DNMT3A及DNMT3B）表達(dá)水平的影響。方法應(yīng)用8μmol/LAs2O3與鼻咽癌細(xì)胞系C666-1、CNE1、CNE2和鼻咽上皮永生細(xì)胞系NP69細(xì)胞分別共同孵育48h，基于細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8測定鼻咽癌細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡檢測藥物處理前后鼻咽癌細(xì)胞及NP69細(xì)胞中DNMTmRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果NP69細(xì)胞相對(duì)鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)DNMT1和DNMT3A水平最低。經(jīng)As2O3作用后，鼻咽癌細(xì)胞活力下降，形態(tài)改變明顯；各種細(xì)胞表達(dá)DNMT的水平變化不完全一致，其中C666-1細(xì)胞對(duì)3種DNMT的表達(dá)水平均顯著降低；而CNE1和CNE2細(xì)胞中DNMT1及DNMT3B表達(dá)下調(diào)，CNE1細(xì)胞中DNMT3A的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)論As2O3可抑制鼻咽癌細(xì)胞中DNMT的表達(dá)，表明其在一定程度上對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有去甲基化作用，存在治療鼻咽癌的潛在價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]鼻咽癌；三氧化二砷；甲基化；甲基轉(zhuǎn)移酶

[中圖分類號(hào)]R739.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.010

EffectsofarsenictrioxideonDNAmethyltransferasesexpressionofnasopharyngealcarcinomacelllines

GAOQianwen1，LIUTaowen2

1.IntensiveCareUnit，ChangzhouThirdPeople’sHospital，Changzhou213000，Jiangsu，China; 2.OncologyDepartment，NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，theSecondPeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Guilin541002，Guangxi，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofarsenictrioxide（As2O3）ontheexpressionlevelsofDNAmethyltransferases（DNMT）（DNMT1，DNMT3AandDNMT3B）innasopharyngealcarcinomacelllines.MethodsIncubationof8μmol/LAs2O3withnasopharyngealcarcinomacelllineC666-1，CNE1，CNE2andnasopharyngealepithelialimmortalcelllineNP69cellsfor48h，cellcountingkit-8wasmeasuredtheproliferationofnasopharyngealcarcinomacells.Moreover，quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreactionandWesternblotwereusedtodeterminethelevelsofDNMTmRNAandproteinexpressioninnasopharyngealcarcinomacellsandNP69cellsbeforeandafterAs2O3treatment.ResultsComparedwithnasopharyngealcarcinomacells，theexpressionofDNMT1andDNMT3AinNP69cellswerethelowest.AfterbeingincabationwiththeAs2O3，NPCcellviabilitydecreasedwithobviousmorphologicalchanges.ItisobservedthatlevelsofDNMTexpressedinvariouscellswerenotcompletelyconsistent，withC666-1cellsshowingsignificantlylowerexpressionlevelsforallthreeDNMT.However，DNMT1andDNMT3BweredownregulatedinCNE1andCNE2cells，DNMT3AexpressionwassignificantlyupregulatedinCNE1cells.ConclusionItissuggestedthatAs2O3haspotentialtherapeuticvaluefornasopharyngealcarcinomathroughwhichcouldinhibitetheexpressionofDNMT.

[Keywords]Arsenictrioxide;Nasopharyngealcarcinoma;Methylation;Methyltransferase

鼻咽癌高發(fā)于東南亞及我國南方地區(qū)，單獨(dú)放療或放療聯(lián)合化療可使該病達(dá)到較高的局部控制率，但鼻咽癌比其他頭頸部惡性腫瘤更容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[1]。已證實(shí)，DNA甲基化在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferases，DNMT）可使沉默的抑癌基因恢復(fù)表達(dá)并在一定程度上遏制惡性腫瘤生長[2-3]。目前，DNMT抑制劑治療惡性腫瘤受到高度關(guān)注，鑒于鼻咽癌存在高概率的DNA高度甲基化，故通過逆轉(zhuǎn)DNA甲基化有望治療鼻咽癌[4]。

三氧化二砷（As2O3）通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡而成為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的重要藥物。雖然As2O3可抑制某些癌細(xì)胞表達(dá)DNMT，但該藥對(duì)鼻咽癌細(xì)胞DNMT的影響罕見報(bào)道[5]。本研究顯示As2O3對(duì)不同分化程度、EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染相關(guān)的鼻咽癌細(xì)胞系中DNMT表達(dá)具有抑制作用，此可為通過去甲基化治療鼻咽癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)G4wMzdrw+1p2g8rthIgm2g4oS0bcQY54DgEs9fvOSmY=材料

1.1.1細(xì)胞系人未分化鼻咽癌細(xì)胞系C666-1（EBV陽性）和人類正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司；高分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE1（EBV陰性）及低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE2（EBV陰性）由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑兔抗人DNMT1、DNMT3A、DNMT3B單克隆抗體和山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）消化液、磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）、青鏈霉素混合液（100倍）、二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）及放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radioimmunoprecipitationassaylysisbuffer，RIPA裂解液）購自索萊寶公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國天根生化公司；As2O3凍干粉注射劑（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20080665，生產(chǎn)單位：北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，規(guī)格：10mg）；SYBRGreenmix購自美國ABI公司。委托上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成DNMT基因的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreaction，qRT-PCR）引物序列如下：DNMT3A上游引物5’-AGCCTCAAGAGCAGTGGAAAA-3’；DNMT3A下游引物5’-CACGACCCAGACCATCCTTC-3’；DNMT3B上游引物5’-AGGTGGAGGCAGACAGTGGA-3’；DNMT3B下游引物5’-CTTTTCGATAGGAGACGAGCTTAT-3’；DNMT1上游引物5’-GATGATTCCTCAAAACCGCTGTA-3’；DNMT1下游引物5’-GTAGGTCTTCCCGTCGTCCC-3’[6]。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

分別應(yīng)用完全培養(yǎng)基RPMI1640和DMEM培養(yǎng)細(xì)胞系（C666-1、NP69、CNE1及CNE2細(xì)胞），正常傳代及凍存。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前檢測C666-1及CNE2細(xì)胞的半抑制濃度（50%inhibitingconcentration，IC50）確定本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用As2O3的工作濃度為8μmol/L[7]。在8μmol/LAs2O3濃度下孵育上述細(xì)胞48h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8檢測處理前后細(xì)胞的增殖情況

將細(xì)胞消化后接種于96孔板，濃度為4000/孔，設(shè)置多個(gè)藥物濃度梯度，留置復(fù)孔。培養(yǎng)48h后棄去上清液，每孔加入培養(yǎng)基及細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cellcountingkit-8，CCK8）溶液，避光孵育后于酶標(biāo)儀450nm處測定吸光度（A值），取1.0附近的A值作為測定值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=1–（實(shí)驗(yàn)組A值–空白組A值）/（對(duì)照組A值–空白組A值）%。

1.4qRT-PCR檢測細(xì)胞表達(dá)DNMTmRNA水平的變化

參照試劑盒說明書進(jìn)行操作：應(yīng)用RNA提取試劑盒提取經(jīng)As2O3處理前后的細(xì)胞總RNA，測定其濃度及A值（A260/280=1.8～2.0）。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，將cDNA用ddH2O稀釋5倍，配制qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBRGreenMix（2×）10μl，引物探針2μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。以磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參照，運(yùn)行PCR程序：50℃2min，95℃20s，95℃3s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。收集溶解曲線數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析[6]。

1.5蛋白質(zhì)印跡檢測細(xì)胞表達(dá)DNMT蛋白水平的變化

收集待測細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取經(jīng)As2O3處理前后上述細(xì)胞的總蛋白。應(yīng)用二喹啉甲酸法定量蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜及封閉后，加入兔抗人單克隆抗體DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，濃度分別為1∶1000、1∶2000、1∶3000，4℃過夜后二抗（1∶25000）孵育；洗膜后化學(xué)發(fā)光、顯影定影、掃描膠片、分析數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；使用GaphpadPrism6.0作圖及分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1As2O3處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)及增值變化

應(yīng)用8μmol/LAs2O3作用于鼻咽癌細(xì)胞系48h后，各細(xì)胞數(shù)目明顯減少；其中CNE1和CNE2細(xì)胞的形態(tài)改變較大，輪廓模糊不清，培養(yǎng)液中死亡細(xì)胞數(shù)量較多，見圖1。通過CCK8檢測，As2O3作用后3種細(xì)胞的活力受影響，隨著藥物濃度的增加，增值率下降（P<0.0001），見表1。

2.2As2O3處理前后各細(xì)胞系中DNMTmRNA的表達(dá)

As2O3處理前，DNMT1mRNA在4種細(xì)胞系中的表達(dá)從低到高為NP69、CNE1、CNE2、C666-1。經(jīng)As2O3處理48h后，各種細(xì)胞表達(dá)DNMTmRNA的水平均有所變化，但其變化趨勢不完全一致，其中C666-1細(xì)胞對(duì)3種基因的表達(dá)均顯著降低（P<0.01）。DNMT1mRNA和DNMT3BmRNA在CNE1及CNE2細(xì)胞中表達(dá)均降低（P<0.01），但這兩種細(xì)胞系中DNMT3AmRNA的表達(dá)呈上升趨勢，尤其是CNE1細(xì)胞中DNMT3AmRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。在NP69細(xì)胞中，DNMT1mRNA和DNMT3AmRNA表達(dá)升高，而DNMT3BmRNA表達(dá)下降（P<0.01），見表2、圖2。

2.3As2O3對(duì)各細(xì)胞系中DNMT蛋白表達(dá)的影響

As2O3處理前，DNMT1蛋白在各細(xì)胞中表達(dá)與其mRNA相同，從低到高依次為NP69、CNE1、CNE2、C666-1，且這些細(xì)胞在藥物作用后表達(dá)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的變化趨勢基本與mRNA的表達(dá)一致，見圖2、圖3。As2O3處理后，DNMT3B在NP69中的表達(dá)降低，而DNMT1和DNMT3A蛋白表達(dá)升高（P<0.01）；C666-1及CNE2細(xì)胞表達(dá)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的水平顯著下降（P<0.01）；CNE1細(xì)胞表達(dá)DNMT1和DNMT3B蛋白的水平降低，而表達(dá)DNMT3A蛋白的水平升高，見圖3。

3討論

DNA甲基化是人類基因組最常見的可逆性表觀遺傳修飾方式，它是通過細(xì)胞內(nèi)DNMT的催化將S-腺苷甲硫氨酸的甲基共價(jià)地結(jié)合在基因組特定核苷酸的過程。通常在基因組CpG島的胞嘧啶5位碳原子上添加1個(gè)甲基而形成5-甲基胞嘧啶，使特異DNA發(fā)生甲基化。這些甲基化胞嘧啶位于DNA啟動(dòng)子和（或）增強(qiáng)子區(qū)域，造成其不能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而導(dǎo)致基因（尤其抑癌基因）的轉(zhuǎn)錄受遏制[8]。DNA甲基化調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)，參與發(fā)育、分化及基因表達(dá)等各種細(xì)胞過程。DNA的正常甲基化水平發(fā)生改變可導(dǎo)致各種病理情況，尤其是惡性腫瘤[9]。哺乳動(dòng)物含有3種具有功能的DMNT異構(gòu)體（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B），其結(jié)構(gòu)相似、催化機(jī)制相同。DNMT1的作用在于識(shí)別半甲基化DNA而維持DNA甲基化狀態(tài)，而DNMT3A及DNMT3B負(fù)責(zé)DNA初始甲基化，其中DNMT3B對(duì)基因組的甲基化作用大于DNMT3A，這些DNMT的作用具有一定的重疊性[10]。

惡性腫瘤中DNMT表達(dá)水平通常發(fā)生改變，但在不同類型腫瘤中起主導(dǎo)作用的DNMT成員不同[11]。如DNMT3A突變對(duì)惡性血液腫瘤具有重要作用，乳腺癌中DNMT3B的表達(dá)水平顯著高于DNMT1及DNMT3A，而DNMT1、DNMT3A及DNMT3B在胰腺癌、乳腺癌組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)，所以認(rèn)為不同腫瘤中較高水平的DNMT異構(gòu)體是最佳的去甲基化治療靶點(diǎn)[12-15]。鑒于甲基化和去甲基化處于動(dòng)態(tài)過程中，DNA甲基化是3種DNMT成員共同作用的結(jié)果，因此，共同抑制DNMT1、DNMT3A及DNMT3B可能效果更佳[16]。相比于其他惡性腫瘤（肝、肺、腎、乳腺等），鼻咽癌抑癌基因表達(dá)降低，存在DNA高度甲基化[4]。

本研究中As2O3處理前后，各細(xì)胞系DNMT的表達(dá)趨勢不同，考慮與各細(xì)胞系的內(nèi)在差異有關(guān)，如NP69為正常鼻咽上皮細(xì)胞，而C666-1為EBV陽性未分化鱗癌細(xì)胞，CNE1和CNE2雖均為EBV陰性，但分化程度不同。其中，C666-1表達(dá)DNMT水平高于CNE1、CNE2及NP69，而經(jīng)As2O處理后細(xì)胞DNMT的表達(dá)均下降，考慮與EBV基因組產(chǎn)物成分潛伏膜蛋白1（latentmembraneprotein1，LMP1）對(duì)鼻咽癌表觀遺傳學(xué)的作用有關(guān)[17]。此外，LMP1通過結(jié)合DNMT基因的啟動(dòng)子1而誘導(dǎo)DNMT1、DNMT3A及DNMT3B表達(dá)和激活其活性，可能是本研究中C666-1細(xì)胞表達(dá)較高水平DNMT的主要原因[18]。經(jīng)As2O3處理后，CNE1及CNE2細(xì)胞對(duì)DNMT1、DNMT3A及DNMT3B表達(dá)水平降低程度不同，考慮可能與細(xì)胞分化程度差異有關(guān)。NP69作為人類正常鼻咽上皮細(xì)胞，表達(dá)DNMT（DNMT1、DNMT3A）水平最低。盡管上述細(xì)胞表達(dá)DNMT譜存在差異，C666-1、CNE1及CNE2細(xì)胞均以DNMT1高表達(dá)為主，而DNMT1對(duì)于維持DNA甲基化狀態(tài)起重要作用。另外，本研究中鼻咽癌細(xì)胞高表達(dá)DNMT1及DNMT3A除受LMP1蛋白介導(dǎo)外，很重要的是受GLI1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。據(jù)報(bào)道，胰腺癌組織及細(xì)胞中DNMT1是Hedghog信號(hào)通路下游核轉(zhuǎn)錄因子GLI1的靶基因，而且GLI1可通過間接機(jī)制誘導(dǎo)DNMT3A表達(dá)上調(diào)[19]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Hedghog信號(hào)通路在鼻咽癌組織及腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)[20]。

本研究中筆者觀察到鼻咽癌細(xì)胞經(jīng)As2O3處理后，EBV感染與否及不同分化程度的鼻咽癌細(xì)胞中DNMTmRNA受抑制程度不一，其具體體現(xiàn)為各種細(xì)胞表達(dá)DNMTmRNA的水平變化趨勢不完全一致，其中C666-1細(xì)胞中3種DNMTmRNA的表達(dá)均顯著降低；而CNE1和CNE2細(xì)胞中DNMT1mRNA及DNMT3BmRNA的表達(dá)下調(diào)，但DNMT3AmRNA的表達(dá)呈上升趨勢。可見，As2O3是DNMT的廣譜抑制劑。As2O3對(duì)鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)DNMT的抑制差異可能受多種因素影響，具體機(jī)制有待研究。研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可抑制Hedgehog信號(hào)通路中GLI1轉(zhuǎn)錄活性及GLI2聚集，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。而且，As2O3抗急性早幼粒細(xì)胞白血病的作用與GLI蛋白有關(guān)[22]。此外，As2O3可通過其他直接及間接作用抑制DNMT，如DNMT的C端催化域都含有豐富的半胱氨酸琉基，As2O3作為疏基酶抑制劑可直接抑制DNMT活性。同時(shí)，As2O3代謝產(chǎn)生的S-腺苷同型半胱氨酸是DNMT的抑制物，進(jìn)一步抑制DNA甲基化過程。因此，筆者認(rèn)為As2O3通過多靶點(diǎn)及多種機(jī)制抑制DNMT的水平及活性。目前僅2種DNMT抑制劑（5-氮胞苷及和地西他濱）獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，這些核苷類似物的作用機(jī)制是通過作用于DNMT1而抑制DNA甲基化；由于存在細(xì)胞毒性、缺乏特異性及生物利用度較差而導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制，目前主要用于治療骨髓增生異常綜合征，治療實(shí)體瘤的效果不明顯[23]。因此，非核苷類DNMT抑制劑的研發(fā)備受關(guān)注。

綜上，本研究觀察到As2O3可抑制鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)DNMT，表明As2O3在一定程度上對(duì)鼻咽癌具有去甲基化作用。但經(jīng)As2O3處理后，一些鼻咽癌細(xì)胞系表達(dá)DNMT異構(gòu)體呈上調(diào)，其機(jī)制未明，考慮這些細(xì)胞可能存在DNMT基因甲基化（而As2O3使其去甲基化而恢復(fù)表達(dá)）。進(jìn)一步明確DNMT不同異構(gòu)體的表達(dá)及其作用機(jī)制，有望為聯(lián)合去甲基化與其他靶向藥物或傳統(tǒng)放化療而治療包括鼻咽癌在內(nèi)的惡性實(shí)體瘤提供有益參考。As2O3對(duì)鼻咽癌的去甲基化效果及其可行性尚有待在體內(nèi)外腫瘤模型中深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–10–17）

（修回日期：2024–06–18）