薇甘菊內酯衍生物LY19380b對人白血病細胞HEL的作用及機制研究

[摘要]目的研究薇甘菊內酯衍生物LY19380b對人白血病細胞HEL的作用及機制。方法四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyltetrazolium，MTT）法檢測LY19380b對不同的人腫瘤細胞的抗增殖活性，利用流式細胞術測定細胞周期，AnnexinV-FITC/PI和Hoechst33258染色測定細胞凋亡；Westernblot分析LY19380b對細胞凋亡及周期相關蛋白的影響。結果LY19380b對不同的人腫瘤細胞均具有抗增殖活性，對人白血病細胞HEL具有顯著的生長抑制作用，可誘導HEL細胞發生凋亡并導致細胞周期阻滯；此外，LY19380b作用于HEL細胞后顯著增加P53、BIM、BID、BAD、BAX、FLIP、P21及CyclinB1蛋白的表達，降低Bcl-2、p-CDC25C、p-AKT、p-STAT3、p-ERK蛋白的表達。結論LY19380b通過增加促凋亡蛋白BIM、BID、BAD、BAX的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導人白血病細胞HEL發生凋亡，上調周期蛋白P21、CyclinB1的表達，從而導致HEL細胞周期阻滯。

[關鍵詞]白血?。晦备示諆弱ィ坏蛲?；機制

[中圖分類號]R979.1[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.19.001

TheeffectandmechanismofanovelmikanolidederivativeLY19380bonhumanleukemiacellHEL

RAOQing1，2，3，LIUSheng1，3，HUANGLei1，3，LIYanmei1，3，ZHENGJiang1，2

1.StateKeyLaboratoryofFunctionsandApplicationsofMedicinalPlants，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550014，Guizhou，China;2.SchoolofPharmacy，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550025，Guizhou，China;3.DepartmentofPharmacologicalActivityScreening，NaturalProductsResearchCenterofGuizhouProvince，Guiyang550014，Guizhou，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethemechanismofmikanolidederivativeLY19380bininhibitingthegrowthofhumanleukemiacellHEL.MethodsMethylthiazolyltetrazolium（MTT）assaywasusedtodetecttheeffectofcompoundLY19380bontheproliferationofhumantumorcells，flowcytometrywasusedtodeterminecellcycle，AnnexinV-FITC/PIdoublestainingandHoechst33258stainingwereusedtodetermineapoptosis.WesternblotwasusedtoanalyzeeffectsofLY19380boncellcycleandapoptosis-relatedproteins.ResultsLY19380bhadanti-proliferativeactivityondifferenthumantumorcells，andsignificantlyinhibitedthegrowthofhumanleukemiacellHEL.ItcanalsoinduceapoptosisandaffectthecellcycleofHEL.Inaddition，LY19380bcouldsignificantlyincreasetheexpressionsofP53，BIM，BID，BAD，BAX，FLIP，P21andCyclinB1proteins，whiledecreasedtheexpressionsofBcl-2，p-CDC25C，p-AKT，p-STAT3andp-ERKproteins.ConclusionByincreasingtheexpressionsofpro-apoptoticproteinsBIM，BID，BADandBAX，decreasingtheexpressionofanti-apoptoticproteinBcl-2，LY19380binducedtheapoptosisofhumanleukemiacellHEL，andupregulatedtheexpressionsofP21andCyclinB1，thusleadingtocellcyclearrestinHEL.

[Keywords]Leukemia;Mikanolide;Apoptosis;Mechanism

白血病是一種常見的血液系統惡性腫瘤，以血細胞在造血器官中異常增殖為特征。由于白血病細胞在骨髓內的無序增殖，導致骨髓正常的造血功能受到抑制，白血病患者常出現貧血、感染、出血和器官浸潤等一系列癥狀[1]。隨著環境污染的增加，白血病的發病率在全球呈現上升趨勢。據報道，2018年美國大約有60300例新增白血病病例，2017年中國臺灣白血病的發病率約為4.7/10萬[2]。據調查，中國400萬名白血病患者中，有50%是兒童，大部分是2～7歲的孩子[3]。

薇甘菊是菊科多年生草本植物或灌木狀攀緣藤本，原產于南美洲和中美洲，是世界上最具危險性的有害植物之一，于20世紀80年代傳入中國，其入侵給中國的經濟發展造成巨大的損失。有效地控制此植物的蔓延，或對其進行開發利用是保護生態系統健康發展、保護生物多樣性的重要舉措。薇甘菊的莖和葉中含有豐富的有機成分，如醇類、萜類及烯類等，是其發揮殺菌和抗病毒作用的物質基礎。薇甘菊中的薇甘菊內酯和二氫薇甘菊內酯具有抑制金色鏈球菌和白色念珠菌的活性，其提取液也可對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌及綠膿桿菌等常見病原菌產生抑制作用，具有較高的藥用價值[4]。文獻報道薇甘菊中日耳曼烷倍半萜二內酯具有抑菌活性和細胞毒活性[5]；Dou等[6]研究發現，薇甘菊水提物在濃度較高時對白血病細胞K562和宮頸癌細胞Hela展現出較好的抗增殖活性，且體內在不影響胸腺指數和脾臟指數的前提下對S180肉瘤細胞具有一定的抑制作用。這些研究結果提示薇甘菊中的活性成分具有一定的抗腫瘤作用，因此，筆者檢測薇甘菊內酯衍生物LY19380b的抗白血病活性并研究其作用機制。

1材料與方法

1.1細胞株

人白血病細胞株HEL、人肝細胞株HL7702、人黑色素瘤細胞株WM35、人乳腺癌細胞株MDA-MB-468及人骨髓瘤細胞株MM.1S均為本實驗室保存。

1.2主要試劑

RPMI-1640、DMEM培養基購于賽默飛公司；胎牛血清購于BiologicalIndustries公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購于BD公司；P21、BAD、BID、BCL2、P53、FLIP、AKT、STAT3、Phospho-CDC25C抗體購于CellSignalingTechnology公司；ERK、Phospho-ERK、BIM、Phospho-STAT3、CyclinB1抗體購于Abcam公司；BAX、GAPDH、Phospho-AKT抗體購于成都正能生物技術有限責任公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyltetrazolium，MTT）、牛血清白蛋白、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白Marker購于索萊寶公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、細胞裂解液、5X蛋白上樣緩沖液、Western轉膜液購于碧云天公司。

1.3細胞培養

人白血病細胞HEL、人肝細胞HL7702和人骨髓瘤細胞MM.1S用RPMI-1640完全培養基（含10%胎牛血清）培養，人黑色素瘤細胞WM35、人乳腺癌細胞MDA-MB-468用DMEM完全培養液（含10%胎牛血清）培養，37℃，5%CO2濃度。

1.4MTT法檢測腫瘤細胞的增殖活性

取處于對數生長期的細胞，每種細胞按相應的密度接種于96孔板（每孔100μl），于37℃，5%CO2孵箱中培養4h。加入不同濃度的LY19380b（0.075μmol/L，0.15μmol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L），對照組給予0.1%DMSO處理，空白組不含細胞，每組設3個平行孔。37℃培養箱中分別培養24h、48h、72h，每孔加入20μlMTT（5mg/ml），37℃繼續培養4h。96孔板2500轉/min離心10min，吸盡液體，每孔加入160μlDMSO，37℃搖床孵育30min，酶標儀（490nm）檢測光密度（opticaldensity，OD）值，帶入下列公式進行計算：細胞存活率（%）=（OD樣本–OD空白）/（OD對照–OD空白）×100%。

1.5AnnexinV/PI雙染法測定細胞凋亡

將對數生長期的HEL細胞按3×105/ml細胞數接種于60mm培養皿（每皿3ml），37℃培養4h后，加入LY19380b（0.15μmol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L），并設置DMSO對照組，37℃分別培養24h和48h。收集細胞后磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）清洗2次，并用100μlBindingbuffer重懸細胞，每管分別加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI混勻，室溫避光孵育15min。孵育完后用Bindingbuffer洗一次，220g離心去上清液，并加入200μlBindingbuffer重懸細胞，艾森NovoCyte流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6Hoechst33258染色法檢測細胞凋亡

將對數生長期的HEL細胞按3×105/ml細胞數接種于60mm培養皿（每皿3ml），37℃培養4h后，加入LY19380b（0.3μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L），并設置DMSO對照組，37℃培養24h。收集細胞后PBS清洗2次，離心收集細胞加入500μl固定液，緩緩懸起細胞，室溫固定10min。220g離心5min去固定液，PBS洗3遍，離心棄去大部分液體，剩余50μl液體在管內，輕輕懸起細胞，滴至載玻片上，稍微晾干，滴加500μlHoechst33258染色液，室溫染色5min。棄去染色液，PBS洗3遍，盡量吸盡液體。將抗熒光淬滅封片液滴于載玻片上，小心蓋上蓋玻片（避免產生氣泡），熒光顯微鏡觀察結果。

1.7細胞周期的檢測

將對數生長期的HEL細胞按3×105/ml細胞數接種于60mm培養皿（每皿3ml），37℃培養4h后，加入LY19380b（0.15μmol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L），并設置DMSO對照組，37℃分別培養24h和48h。收集細胞，預冷PBS清洗2次，每管加入500μl70%的預冷乙醇（現配現用），4℃孵育6h，-20℃孵育過夜。離心棄乙醇，并用預冷PBS洗2次。每管加入500μl配好的染液（RNaseA100μg/ml，PI50μg/ml，TritonX-1000.2%，現配現用），混勻，避光室溫染色10min，PBS洗2次，200μlPBS重懸，200目篩網過篩，艾森NovoCyte流式細胞儀檢測結果。

1.8Westernblot檢測蛋白表達的變化

將對數生長期的HEL細胞按3×105/ml細胞數接種于60mm培養皿（每皿3ml），37℃培養4h后，加入LY19380b（0.15μmol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L），并設置DMSO對照組，37℃培養18h后，收集細胞。按照細胞數量每管加入相應體積的RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000轉/min離心15min，收集上清。BCA蛋白濃度測定試劑盒對上清蛋白濃度進行定量，5×SDSloadingbuffer進行變性。配置5%濃縮膠和10%～15%的分離膠，取50μg樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束將蛋白條帶轉印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，相應單克隆抗體為一抗4℃孵育過夜，兔二抗孵育2h后成像。GAPDH作為內參對照，Odyssey紅外成像系統記錄結果。

1.9統計學方法

采用SPSS18.0軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用兩因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1LY19380b對HEL細胞增殖的抑制作用

LY19380b對人白血病細胞HEL的半數抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）值最小，且HL7702細胞的IC50值為HEL細胞的69倍（16.61/0.24），見表1。隨著LY19380b濃度的增加，其對HEL細胞的生長有較為明顯的影響，但對HL7702細胞卻無明顯抑制作用，見圖1。

2.2LY19380b對HEL細胞的增殖抑制作用

LY19380b可強烈抑制HEL細胞的增殖，且呈現出時間和濃度依賴性，見表2、圖2。

2.3LY19380b誘導HEL細胞凋亡

Hoechst染色結果證明，隨著LY19380b濃度的增大，細胞凋亡明顯增加。在熒光顯微鏡下觀察，對照組的細胞核呈常規藍色，凋亡細胞的細胞核呈碎塊狀或致密濃染，顏色微發白，見圖3。細胞凋亡結果顯示LY19380b可誘導HEL細胞發生凋亡，見圖4。

2.4LY19380b對HEL細胞周期的影響

當LY19380b作用24h后，0.5μmon/L和1μmon/L濃度組的G2期比例上升；當LY19380b作用48h后，0.15μmon/L和0.3μmon/L濃度組的G2期比例也開始增加，當LY19380b濃度上升到1μmon/L時，S期比例明顯增加，見圖5。

2.5LY19380b對HEL細胞蛋白表達的影響

LY19380b處理HEL細胞后，P53腫瘤抑制蛋白、促凋亡蛋白BIM、BAD、BID、BAX、FLIP的表達顯著上升，細胞周期蛋白P21、CyclinB1蛋白表達顯著增加。抗凋亡蛋白Bcl-2及細胞周期蛋白磷酸酶CDC25C、磷酸化的STAT3、AKT、ERK蛋白表達下降，見圖6。

3討論

近年來，中國白血病死亡率逐年上升，相反，美國白血病死亡率持續下降。截止目前，美國食品藥品監督管理局已批準20種治療白血病藥物，為白血病患者提供諸多治療選擇，但僅有5種在中國上市且價格昂貴。因此，研發中國擁有自主產權、有效治療腫瘤的創新藥物具有重大意義。本研究探討薇甘菊內酯衍生物LY19380b抗人白血病細胞增殖的作用機制。結果顯示，LY19380b對人白血病細胞HEL具有顯著的生長抑制作用，其IC50值為（0.24±0.02）μmol/L；LY19380b可誘導HEL細胞凋亡，且表現出時間和濃度的依賴性，其還能影響HEL的細胞周期?；瘜W藥物治療（化療）是惡性腫瘤治療的主要手段之一，近年來，隨著醫學和藥學等相關學科的發展，化療藥物得到較快的發展，但在惡性腫瘤的化療過程中，抗腫瘤藥物的毒性作用仍是限制其應用的主要因素。肝臟作為主要的藥物代謝器官，易受到化療藥物的損害。本研究中顯示LY19380b具有較強的抗白血病活性，但對正常的肝細胞卻沒有明顯的生長抑制現象，表明LY19380b是一個具有選擇性的高效低毒的抗腫瘤化合物，可作為一個新的抗腫瘤藥物候選分子。

細胞凋亡是一種受嚴格控制和進化保守的程序性細胞死亡，對組織的穩態至關重要。當細胞增殖和死亡之間的穩態被打破時，誘導凋亡的通路隨即發生變化，從而誘導腫瘤的發生[7]。細胞凋亡被確定為腫瘤治療的一個手段[8-9]。凋亡是受多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、抑癌基因P53等，BIM、BAD和BID蛋白屬于Bcl-2家族中的促凋亡蛋白[10]。本研究中LY19380b可顯著提高P53、BIM、BAD和BID蛋白的表達，表明其通過上調促凋亡蛋白的表達增加HEL細胞凋亡。細胞周期則受到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的控制，P21通過結合并抑制周期依賴性激酶（CDK2和CDK1）的活性導致細胞周期特定階段的生長停滯[11-12]。研究報道P21可顯著抑制細胞中CDK1的活性，導致細胞周期停滯[13-15]。本研究中LY19380b能增加P21蛋白水平，從而擾亂細胞周期進程，抑制HEL細胞增殖。P53腫瘤抑制蛋白在DNA損傷和其他基因組畸變的細胞應答中起重要作用。P53的激活可導致細胞周期停滯、DNA修復或凋亡[16]。細胞FLIP（FLICE抑制性蛋白）是一種凋亡調節分子，可表達為兩種選擇性剪切同工型：FLIP短型（FLIPS）和FLIP長型（FLIPL）[17]。FLIPL過表達可生成胱天蛋白酶-8異二聚體，從而產生活化的蛋白酶，最終導致細胞凋亡。AKT在控制存活和凋亡中發揮至關重要的作用，AKT通過磷酸化和失活BAD抑制凋亡，并通過負向調節細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21Waf1/Cip1參與細胞周期調節[18-20]。研究顯示STAT3在多種人類腫瘤中持續激活，并有致癌的潛在可能性，具有抗凋亡活性[21]。STAT3通過Tyr705位點的磷酸化而激活，從而誘導二聚化、核轉位、DNA結合。本研究發現LY19380b可明顯下調磷酸化AKT和STAT3的表達，提示其可通過這些靶點抑制腫瘤細胞的生長。

綜上所述，薇甘菊內酯衍生物LY19380b通過抑制磷酸化的AKT和STAT3、增加腫瘤抑制蛋白P53、促進凋亡蛋白BIM、BAD、BAX、BID、FLIP的表達，從而增加人白血病細胞HEL的凋亡；增加細胞周期蛋白P21、CyclinB1的表達，使HEL細胞發生細胞周期阻滯。但本研究尚未揭示LY19380b具體的作用靶點及變化蛋白之間的相互作用，還需要通過進一步研究明確更深入的作用機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–09–20）

（修回日期：2024–06–12）

InformaticsandHealth征稿啟事

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