PTS通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路對(duì)胃癌細(xì)胞的影響

[摘要]目的探討6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase，PTS）對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。方法通過蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot，WB）和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）測(cè)定胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、AGS細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞中PTS蛋白及mRNA的表達(dá)。選取AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將AGS細(xì)胞分為對(duì)照（NC）組、sh-PTS組、sh-PTS+BML-284組。采用CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖；采用劃痕愈合測(cè)定細(xì)胞遷移能力；采用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移、侵襲能力；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；WB和RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin、c-myc、GSK-3β、Wnt5a蛋白和mRNA水平。結(jié)果胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中PTS表達(dá)低于胃癌細(xì)胞，AGS細(xì)胞中PTS表達(dá)最高；敲低PTS可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，β-catenin、c-myc、Wnt5a蛋白水平下降，GSK-3β蛋白水平升高（P<0.05）；與sh-PTS組相比，sh-PTS+BML-284組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡水平下降，β-catenin、c-myc、Wnt5a蛋白表達(dá)升高，GSK-3β蛋白表達(dá)下降（P<0.05）。結(jié)論P(yáng)TS通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡。

[關(guān)鍵詞]6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶；胃癌；Wnt/β-catenin信號(hào)通路；惡性生物學(xué)行為

[中圖分類號(hào)]R735.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.19.006

EffectsofPTSongastriccancercellsbyregulatingWnt/β-cateninpathway

YANGJinpeng1，WANGWenhua1，ZHANGYongbo1，ZHANGYuying2

1.ClinicalCollegeofMedicine，ShandongSecondMedicalUniversity，Weifang261042，Shandong，China;2.DepartmentofGastroenterology，WeifangPeople’sHospital，Weifang261000，Shandong，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsof6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase（PTS）ongastriccancercells.MethodsTheexpressionofPTSproteinandmRNAingastricmucosalepithelialcellsGES-1andgastriccancercelllinesHGC-27cells，MGC-803cells，AGScellsandMKN-45cellsweredeterminedbyWesternblot（WB）andreversetranscriptionquantitative&nbsp;polymerasechainreaction（RT-qPCR）.AGScellswereselectedforfollow-upexperiments.AGScellsweredividedintocontrol（NC）group，sh-PTSgroup，andsh-PTS+BML-284group.CellproliferationwasmeasuredbyCCK-8.Cellmigrationabilitywasmeasuredbyscratchhealing.CellinvasionandmigrationweremeasuredbyTranswellassay.Apoptosiswasmeasuredbyflowcytometry.TheproteinandmRNAlevelsofβ-catenin，c-myc，GSK-3βandWnt5aweredetectedbyWBandRT-qPCR.ResultsTheexpressionofPTSingastricmucosalepithelialcellsGES-1waslowerthanthatingastriccancercells，andtheexpressionofPTSwasthehighestinAGScells.KnockingdownPTScouldinhibitproliferation，migrationandinvasionofgastriccancercells，promotecellapoptosis，decreasedβ-catenin，c-myc，Wnt5aproteinlevels，andincreasedGSK-3βproteinlevels（P<0.05）.Comparedwithsh-PTSgroup，cellproliferation，migrationandinvasionabilityofsh-PTS+BML-284groupwereenhanced，apoptosislevelwasdecreased，proteinexpressionofβ-catenin，c-mycandWnt5awasincreased，andproteinexpressionofGSK-3βwasdecreased（P<0.05）.ConclusionPTScanaffectproliferation，migration，invasionandapoptosisofgastriccancercellsbymediatingWnt/β-cateninpathway.

[Keywords]6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase;Gastriccancer;Wnt/β-cateninsignalingpathway;Malignantbiologicalbehavior

在全球范圍內(nèi)，胃癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率居第5位，病死率居第4位[1]。由于胃癌缺乏特異性癥狀及體征，部分患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，晚期胃癌患者5年生存率不足20%[2-3]。近年來，隨著代謝學(xué)與腫瘤學(xué)的深入發(fā)展，有關(guān)腫瘤代謝交叉方面的研究越來越多。6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（6-pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase，PTS）是催化四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）生成的關(guān)鍵酶，PTS基因定位于人染色體11ｑ22.3-23.3，全長約9kb，共有6個(gè)外顯子，編碼145個(gè)氨基酸[4]。既往研究對(duì)PTS的探索主要集中于苯丙酮尿癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域；隨著腫瘤代謝學(xué)的發(fā)展，關(guān)于PTS在某些腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注[5-6]。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)早期結(jié)直腸癌中PTS的表達(dá)水平高于癌旁正常組織；Ma等[8]發(fā)現(xiàn)PTS在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)高于癌旁組織，并通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響腫瘤細(xì)胞諸多能力。Wnt/β-catenin通路在胃癌起病及進(jìn)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而PTS在胃癌中的研究較少，其在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及作用機(jī)制尚未明確，是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生作用仍有待研究。

1材料與方法

1.1材料

胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、AGS細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）；RPMI-1640培養(yǎng)基、Ham’sF-12培養(yǎng)基、FBS（武漢普諾賽公司）；GV491-shPTS、GV491-空載體、HitransGP感染增強(qiáng)液（上海吉?jiǎng)P基因公司）；BML-284（MCE公司）；β-catenin多克隆抗體、c-myc多克隆抗體、GSK-3β多克隆抗體、PTS多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（Proteintech公司）；抗Wnt5a抗體（Abcam公司）。嘌呤霉素、CCK-8試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），Transwell小室、基質(zhì)膠（Corning公司）；AnnexinV-APC/7-AADApoptosisKit（聯(lián)科生物）；PCR引物（上海生工生物工程公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出凍存的各種細(xì)胞，37℃水浴鍋內(nèi)快速搖晃解凍。在凍存管表面噴灑75%乙醇后將其放入超凈臺(tái)，吸出凍存管中的細(xì)胞懸液并移入裝有5mlRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的離心管中，混合均勻，將離心管放入離心機(jī)，1300轉(zhuǎn)/min離心5min，倒掉上清液，加入2ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打并混勻，轉(zhuǎn)移至裝有8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2d后換液。

1.2.2shRNA-PTS表達(dá)載體的構(gòu)建和細(xì)胞感染根據(jù)PTS序列（GeneID：5805）構(gòu)建shRNA-PTS表達(dá)載體和陰性對(duì)照載體，取對(duì)數(shù)生長期的AGS細(xì)胞接種于6孔板，37℃培養(yǎng)24h，參照吉?jiǎng)P基因重組慢病毒使用手冊(cè)，向6孔板中加入適量病毒液及HitransGP感染增強(qiáng)液，感染慢病毒16h后換液，培養(yǎng)72h后換用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，繼續(xù)培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot，WB）和RT-qPCR測(cè)定細(xì)胞PTS蛋白和mRNA表達(dá)。

1.2.3細(xì)胞分組及干預(yù)將細(xì)胞分為對(duì)照（NC）組、sh-PTS組、sh-PTS+BML-284組。NC組感染GV491-空載體，sh-PTS組感染GV491-shPTS，sh-PTS+BML-284組在sh-PTS組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Wnt/β-catenin通路激活劑BML-284進(jìn)行處理。

1.2.4CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖能力將細(xì)胞密度稀釋至4×104個(gè)/ml，在96孔板中每孔加入100μl胃癌細(xì)胞懸液，每組3個(gè)復(fù)孔，分別于0h、24h、48h、72h向96孔板各孔中加入10μlCCK-8試劑，37℃孵育2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度，采用GraphPadPrism9.0進(jìn)行分析及繪圖。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力向6孔板各孔中接種細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，待細(xì)胞貼壁鋪滿孔底后制造劃痕，觀察0h、48h時(shí)的細(xì)胞遷移情況，利用ImageJ計(jì)算愈合率，GraphPad9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移、侵襲能力用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞進(jìn)行稀釋，向Transwell小室上室中加入細(xì)胞懸液200μl，在下室中加入1ml含30%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24h后從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，磷酸鹽緩沖液洗滌，向培養(yǎng)板每個(gè)孔加入4%多聚甲醛2ml，固定30min；0.1%結(jié)晶紫染色30min，磷酸鹽緩沖液洗滌，晾干后鏡下觀察下室的細(xì)胞。選取不同視野觀察已染色細(xì)胞，拍照并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。侵襲實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前將Matrigel膠濃度稀釋至0.5mg/ml包被Transwell小室的上室，余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞進(jìn)行消化，取等量細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，換成含5-氟尿嘧啶（5μg/ml）的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)8h后收集細(xì)胞，用AnnexinV-APC和7-AAD雙染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.2.8WB檢測(cè)細(xì)胞中Wnt5a、GSK-3β、c-myc、β-catenin蛋白表達(dá)各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，離心后取上清液，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后將蛋白質(zhì)煮沸變性。確定蛋白上樣量，采用12％SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。室溫?fù)u床封閉2h，孵育一抗，4℃過夜后TBST清洗3次，二抗室溫?fù)u床孵育1h。TBST清洗3次，ECL發(fā)光劑顯影。

1.2.9RT-qPCR測(cè)定細(xì)胞中Wnt5a、GSK-3β、c-myc、β-cateninmRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性（95℃，2min）；循環(huán)擴(kuò)增（40個(gè)循環(huán)，變性95℃，15s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s）。使用GAPDH作為mRNA表達(dá)的對(duì)照，使用2-△△Ct進(jìn)行結(jié)果分析，所用引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1GES-1細(xì)胞及胃癌細(xì)胞系中PTS蛋白及mRNA表達(dá)情況

WB結(jié)果顯示，PTS在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于胃癌細(xì)胞系，且PTS在AGS細(xì)胞中的表達(dá)最高，見圖1A。RT-qPCR結(jié)果顯示，PTSmRNA在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于胃癌細(xì)胞系，見圖1B。可見PTS在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于GES-1細(xì)胞。

2.2AGS細(xì)胞感染shRNA-PTS慢病毒后PTS蛋白和mRNA水平

WB結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-PTS組細(xì)胞的PTS表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），見圖2A。RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-PTS組細(xì)胞的PTSmRNA水平顯著降低（P<0.01），見圖2B。表明成功構(gòu)建PTS敲低表達(dá)的AGS細(xì)胞。

2.3PTS可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-PTS組細(xì)胞的增殖能力減弱（P<0.01）；sh-PTS+BML-284組細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于sh-PTS組（P<0.01），見圖3。

2.4PTS可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-PTS組細(xì)胞的遷移能力較NC組減弱（P<0.0001），sh-PTS+BML-284組細(xì)胞的遷移能力較sh-PTS組增強(qiáng)（P<0.0001），見圖4。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-PTS組細(xì)胞的愈合率較NC組下降（P<0.0001），sh-PTS+BML-284組細(xì)胞的愈合率較sh-PTS組升高（P<0.001），見圖5。

2.5PTS可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-PTS組細(xì)胞的侵襲能力較NC組減弱（P<0.0001），sh-PTS+BML-284組細(xì)胞的侵襲能力較sh-PTS組增強(qiáng)（P<0.0001），見圖6。

2.6PTS抑制胃癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，sh-PTS組細(xì)胞凋亡水平高于NC組（P<0.05），sh-PTS+BML-284組細(xì)胞的凋亡水平低于sh-PTS組（P<0.01），表明PTS可抑制胃癌細(xì)胞凋亡，見圖7。

2.7PTS通過激活Wnt/β-catenin通路調(diào)控胃癌的發(fā)展

WB結(jié)果顯示，sh-PTS組的Wnt5a、c-myc、β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于NC組，GSK-3β表達(dá)顯著高于NC組（P<0.05）；sh-PTS+BML-284組的Wnt5a、c-myc、β-catenin蛋白表達(dá)高于sh-PTS組，GSK-3β表達(dá)低于sh-PTS組（P<0.05），見圖8；RT-qPCR結(jié)果顯示，sh-PTS組的Wnt5a、c-myc、β-cateninmRNA表達(dá)水平顯著低于NC組，GSK-3βmRNA表達(dá)水平顯著高于NC組（P<0.05），見圖9。

3討論

Ma等[8]通過構(gòu)建PTS低表達(dá)及PTS過表達(dá)的肺癌細(xì)胞株驗(yàn)證PTS通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展。本研究通過CCK-8、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)表明敲低PTS表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示PTS在胃癌中可能是一種促癌基因，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。

多種腫瘤細(xì)胞的遷移、凋亡受Wnt/β-catenin通路的調(diào)控[9-11]。Wnt/β-catenin信號(hào)的激活取決于細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平[12]。Wnt配體與細(xì)胞表面的卷曲蛋白/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6，LRP5/6）受體復(fù)合物結(jié)合后被激活，通過LRP5/6磷酸化募集并激活Dishevelled（DVL）蛋白，DVL蛋白滅活由支架蛋白1、APC蛋白、酪蛋白激酶1α和GSK-3β組成的破壞復(fù)合體，導(dǎo)致大量的β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，β-catenin易位到細(xì)胞核，激活下游癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致多種惡性腫瘤的發(fā)展[13-14]。Wnt/β-catenin通路的激活作為胃癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。Peng等[15]發(fā)現(xiàn)，SUFU受miRNA-20b調(diào)控激活Wnt/β-catenin通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。RNA腺苷脫氨酶1（adenosinedeaminaseactiononRNA1，ADAR1）在胃癌中的表達(dá)高于正常組織，ADAR1高表達(dá)的患者生存預(yù)后較差[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)ADAR1在胃癌、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和網(wǎng)膜組織中上調(diào)。其上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。通過siADAR1沉默ADAR1后可抑制Wnt/β-catenin通路從而抑制胃癌細(xì)胞的活力、集落形成、遷移，顯著減少腹膜轉(zhuǎn)移瘤的體積。RTKN2作為一種致癌基因，對(duì)紫外線輻射具有抗性[18]。Zhao等[19]研究發(fā)現(xiàn)RTKN2在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，功能實(shí)驗(yàn)表明RTKN2通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長和輻射抗性。

本研究中，通過WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低PTS可抑制Wnt/β-catenin通路的激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證PTS調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在sh-PTS組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入BML-284，結(jié)果顯示敲低PTS與BML-284共處理可逆轉(zhuǎn)敲低PTS對(duì)胃癌細(xì)胞的影響，提示PTS可通過激活Wnt/β-catenin通路對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，凋亡等生物行為產(chǎn)生影響。

綜上所述，PTS通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，PTS可作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–03–04）

（修回日期：2024–06–15）