四逆湯對A549肺癌干細胞增殖及凋亡的影響

摘要：目的 研究經方四逆湯對A549肺癌干細胞增殖及凋亡的影響。方法 利用無血清懸浮培養誘導A549肺癌干細胞，檢測標志物CD133陽性率，驗證細胞干性。分別用不同劑量四逆湯含藥血清（10%、20%）干預A549肺癌干細胞。CCK-8、流式細胞檢測四逆湯干預后對A549肺癌干細胞增殖及凋亡能力的影響。通過qPCR檢測四逆湯干預后對A549肺癌干細胞增殖及凋亡能力的影響。結果 經無血清培養基培養的細胞球CD133陽性率為（82.3667±0.47258）%，明顯高于肺癌細胞組（P<0.05）；經CCK-8檢測四逆湯干預的肺癌干細胞組在48、72h時吸光值較對照組均顯著降低（P<0.05），四逆湯干預的肺癌干細胞凋亡率較對照組顯著升高（P<0.05）；四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平（P<0.05），顯著升高肺癌干細胞Bax mRNA水平（P<0.05）。結論 四逆湯能抑制A549肺癌干細胞增殖并促進其凋亡。

關鍵詞：四逆湯；肺癌干細胞；增殖；凋亡

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）07-0062-06

肺癌作為惡性腫瘤之首，其發病率、死亡率居高不下，針對肺癌的研究任重而道遠。肺癌干細胞（lung cancer stem cells，LCSCs）的提出是肺癌研究的一個新突破口。肺癌干細胞是肺癌組織內未分化的細胞亞群，具有自我更新、分化的能力，被認為是肺癌母細胞，是肺癌復發、轉移、耐藥的源頭，在腫瘤的發生發展中具有重要作用［1-2］。從肺癌干細胞入手，從根本治療肺癌，是肺癌治療的方向。中醫藥在腫瘤干細胞領域的研究也取得了一定的成績，多項研究表面，中醫藥能有效抑制腫瘤干細胞的分化增殖，是肺癌干細胞研究的熱點［3-4］。張仲景《傷寒論》所載四逆湯，是扶陽代表方，有回陽救逆之效。陽虛寒凝是肺癌產生的重要病機之一，臨床以四逆湯治療中晚期肺癌取得了良好療效；多項研究表明，四逆湯能減輕患者癌痛、抑制癌癥轉移、減低化療耐藥性、提高肺癌晚期患者的生存質量等作用［5-9］。本研究以四逆湯含藥血清干預肺癌干細胞，觀察其對肺癌干細胞增殖、凋亡的影響，為肺癌以陽虛論治提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑及耗材 四逆湯由附子、干姜、甘草組成，昆明市中醫醫院中藥房提供；實驗所需動物家兔購買于湖南太平洋生物有限公司；細胞系A549人肺癌細胞、胎牛血清、F-12K培養基購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；纖維細胞生長因子（FGF）購自賽默飛世爾科技公司，重組人表皮生長因子（EGF）購自上海生工生物公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；anti-human CD133購自Biolegend生物公司。

1.2 四逆湯含藥血清制備 四逆湯組將熬好的中藥，按照1.5 g/kg灌胃兔子，每天2次，連續3 d，末次給藥一小時后處死取血。空白組灌胃兔子相同體積生理鹽水，每天2次，連續3 d，末次給藥1 h后處死取血，收集空白組全血和中藥血清組全血，低速離心后分離出上層血清，56℃水浴鍋中滅活30min，0.22um的濾膜過濾除菌，分裝至-80℃保存備用。

1.3 人肺癌 A549 細胞株的干細胞誘導 將A549細胞株培養于完全培養基中，取對數生長期的 A549 細胞，用無血清干細胞培養基（DMEM 培養基+胰島素（4U/L）+B27（1X）+EGF（20 ng/mL）+bFGF20ng/mL）懸浮培養，以利于干細胞球的形成。隔 1～2 d更換培養基，2周后可見腫瘤細胞球形成，傳代用于后續實驗。

1.4 流式檢測 CD133 的表達 將誘導前后的細胞離心去上清，PBS清洗，4%PFA 在4℃下固定4～48h，用10%的二抗同源血清（PBS配置）封閉30 min，離心去上清不用清洗；滴加適當濃度一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗3×3min；滴加適當濃度二抗，37℃孵育30 min；上級檢測。

1.5 CCK-8檢測 實驗分3組（空白組細胞、空白血清組、中藥血清組），誘導成功后鋪96孔板，按照實驗分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養處理24、48、72h后，每孔加入10ul CCK-8試劑，置于培養箱中孵育2h；酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光值（A）。細胞活力（%）=［A（實驗組）-A（空白組）］/［A（對照組）-A（空白組）］×100%；細胞抑制率（%）=［A（對照組）-A（實驗組）］/A（對照組）=1-細胞活力。

1.6 流式檢測細胞凋亡 實驗分2組（中藥血清組、空白血清組），誘導成功后按照實驗分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養處理1h，收集細胞，加PBS洗兩遍，取300ul 預冷的1×Binding Buffer 重懸細胞，每管各加入5 ul Annexin V-FITC 和 10ul PI，輕微混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200ul預冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式儀檢測。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過添加TriQuick Reagent總RNA提取試劑（Solarbio，北京，中國）從細胞提取總RNA。用One Step SuperRT-PCR Mix Kit（Solarbio，北京，中國）將總RNA逆轉錄為cDNA。隨后，qPCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（Servicebio，武漢，中國）在StepOnePlus real-time PCR system（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，Inc.）上進行。GAPDH作為標準化對照。引物（上海捷瑞生物工程有限公司）序列見表1。

1.8 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。所有實驗重復3次，定量結果采用均數±標準差（x±s）表示。2組之間定量數值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤干細胞誘導結果 通過無血清懸浮培養A549細胞14天，誘導肺癌干細胞形成。通過電子顯微鏡觀察細胞成球情況，經流式檢測CD133的表達情況。結果顯示細胞成球情況良好（圖1A）。此外，如A549細胞CD133陽性率為（0.8467±0.23116）%，A549肺癌干細胞CD133陽性率為（82.3667±0.47258）%，兩者差異有統計學意義（P<0.05）。無血清培養的細胞球CD133陽性率明顯高于A549肺癌細胞，證實A549肺癌干細胞誘導成功。

2.2 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞增殖的影響 進一步通過CCK-8檢測了不同劑量四逆湯含藥血清干預A549肺癌干細胞24、48、72h后細胞增殖活性。如圖2所示，四逆湯作用于肺癌干細胞48、72h后肺癌干細胞的吸光度值顯著降低（P<0.05），細胞存活率降低。其中，10%四逆湯含藥血清組干預24、48、72h對肺癌干細胞的抑制率分別為2.64、22.72、18.06、20%四逆湯含藥血清組干預24、48、72h對肺癌干細胞的抑制率分別為11.18、30.93、26.81%。以上結果表明，四逆湯能顯著抑制肺癌干細胞增殖。

2.3 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞凋亡的影響 不同劑量四逆湯含藥血清干預A549肺癌干細胞72h后通過流式細胞儀檢測了細胞凋亡。結果見圖3，其中對照組細胞凋亡率為（5.81±2.68）%，10%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率為（14.88±0.37）%，20%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率為（20.46±0.05）%。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率均顯著上升（P<0.05）。以上結果表明，四逆湯含藥血清明顯促進了A549肺癌干細胞的凋亡。

2.4 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞增殖相關基因PCNA、Ki67 mRNA的影響 通過qPCR檢測了各組細胞PCNA、Ki67 mRNA水平，結果見圖4。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞PCNA、Ki67 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

2.5 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2 mRNA的影響 通過qPCR檢測了各組細胞Bax、Bcl-2 mRNA水平，結果見圖5。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞Bax mRNA水平均顯著上升（P<0.05）而Bcl-2 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

3 討論

肺癌發生率逐年上升，隨著醫學技術的不斷發展，放化療、手術切術、靶向治療等治療技術也日益成熟，然肺癌的死亡率居高不下，轉移、耐藥、復發率高仍是肺癌治療的難點。肺癌干細胞被認為是肺癌轉移、耐藥及復發的元兇，數量很少的肺癌干細胞即可分化產生大量特異性的腫瘤細胞并構成高度異質性的腫瘤組織［10-14］，即使手術切除了大部分腫瘤組織，殘留的少量肺癌AD8RFI+T44ECvIxt4wAQR3YVOoSyl8IFFAlM5bS5d4A=干細胞仍會繼續分化。針對肺癌干細胞的治療是提高肺癌治療成功率的關鍵。

中醫學對干細胞的認識主要參雜在精氣學說、五行學說、藏象學說等理論中。精氣作為宇宙萬物的本原，是人體化生精氣的基本物質與原動力，是人體進行各項生命活動的基礎，《素問.金匱真言論》中記載：“夫精者，身之本也”，《靈樞.本神》也認為“生之來者，謂之精”，而《素問.上古天真論》云：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，《難經》述：“十二經脈者，皆系于生氣之源，所謂生氣之源者，謂十二經脈之根本，謂腎間動氣也。此五臟六腑之本，十二經脈之根”。干細胞的特性與先天之精存在一定的相似性，故而認為干細胞是細胞層次上的先天之精，因此，可將正常人體干細胞認為腎中之精氣。正常狀態下，腎中精氣維持著人體各項生命活動的正常運行，而當腎中精氣虧虛，陰陽失衡，正常干細胞受到抑制，或突變為異常干細胞，而異常細胞過度增生，便導致了腫瘤的發生和演變。因此，我們認為腎中精氣虧虛與腫瘤干細胞的產生可能有密切的關系，尤其是腎陽虧虛，是腫瘤晚期的主要病理機制。扶助腎中陽氣可能是通過抑制腫瘤干細胞的增殖、分化從而達到抗腫瘤的目的［15］。

四逆湯由附子、干姜、甘草組成。方中附子大辛大熱，溫壯元陽，破散陰寒，回陽救逆，為君藥；干姜，入心、脾、肺經，溫中散寒，助陽通脈，為臣藥；炙甘草益氣補中，以治虛寒之本，緩和干姜、附子峻烈之性，調和藥性，使藥力持久，故為佐使藥。臨床上運用四逆湯溫補腎陽之效，治療晚期肺癌陽虛寒凝證效果顯著；大量臨床研究也表明四逆湯能改善肺癌患者臨床癥狀、提高免疫力、降低腫瘤標記物水平［16-17］；也有大量學者研究顯示四逆湯能促進惡性腫瘤細胞凋亡。

而本研究結果顯示，普通A549肺癌干細胞在無血清培養條件下，大部分細胞凋亡，而只有其中的干細胞可在無血清培養條件下成球貼壁生長，這些存活的細胞進一步培養成球后檢測CD133標記物明顯高于普通A459肺癌細胞，從而進一步確定了成球細胞的干性。而經四逆湯含藥血清干預的肺癌干細胞增殖力明顯減弱、凋亡率明顯增加。此外，四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平，顯著升高肺癌干細胞Bax mRNA水平。因此可證實四逆湯可以抑制A549肺癌干細胞的增殖、促進其凋亡，從而達到抑癌的目的。此研究結果為中醫臨床“扶陽抑癌”理論提供了科學依據。

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