一種農桿菌介導的在煙草葉片中實現外源基因瞬時表達的方法

摘要：煙草是一種被廣泛使用的模式植物，經常被用于分子生物學研究。本研究利用農桿菌介導的轉化技術研究了一種新的外源基因在煙草葉片中瞬時表達的系統。首先，通過PCR擴增目的基因，與質粒進行連接后與大腸桿菌轉化培養，通過PCR、酶切驗證和測序確認基因插入，再轉化農桿菌。經侵染后成功在煙草中實現了目的基因（GFP）的表達。本研究有助于推進利用煙草作為模式植物的分子生物學研究，并在各個領域都有應用潛力。

關鍵詞：煙草；農桿菌介導轉化；瞬時基因表達；分子生物學研究

植物基因轉化技術中，盡管存在轉化效率低等問題，農桿菌介導的轉化方法仍因其高效且便捷被廣泛應用于基因功能研究。農桿菌注射技術作為新興手段，以其瞬時表達和操作簡便性，為高通量基因功能分析提供了可能。近年研究通過農桿菌介導的方法在植物中實現了外源基因的快速表達，為深入探索植物生物學提供了新的思路。這項技術已經廣泛應用于基因表達、基因相互作用、蛋白表達以及疫苗生產等領域的研究。如唐伶俐等利用農桿菌介導成功建立了厚皮甜瓜遺傳轉化體系[1]。孫蔓莉等通過在本氏煙草上共表達RB和Avrblb1，探究了影響農桿菌介導基因瞬時表達效率的因素，如農桿菌菌懸液OD600值、菌系、植物品種及生長發育階段等[2]。張悅婧等則以本氏煙草為材料，分析了不同農桿菌菌株、菌液濃度和侵染時間對瞬時轉化過程中報告基因GFP熒光表達量的影響[3]。蔡瀾峰通過基因質粒pCAMBIA2301為載體，在模式作物煙草上測試了五種農桿菌菌株侵染能力，以及5個甘蔗品種的遺傳轉化方法進行了一系列優化，包括愈傷組織、心葉和懸浮細胞三種靶組織類型[4]。這些研究展示了農桿菌注射技術快速、靈活和高效的特點，為植物基因功能研究提供了新的思路和手段，為深入探索植物生物學提供了重要的技術支持。本研究基于此，構建了一個農桿菌介導的煙草葉片外源基因瞬時表達體系，并進行了一系列驗證，以期為植物基因表達提供新途徑。

1 方法與材料

1.1 質粒提取與濃度測定

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌菌液（DH5α）：含有質粒的大腸桿菌菌株。

質粒提取試劑盒（TRAN Code：EM101-02 Lot：R51030-V2）；離心機（eppendorf Centrifuge 5424）；恒溫金屬浴（GINGOh2O3-100C）；吸附柱；Nanodrop。

1.1.2 實驗方法

取1.5 mL大腸桿菌菌液，在10000G下離心1 min，棄去上清液，留下菌體。加入250μL預冷的Resuspension Buffer（RB），輕柔顛倒混勻。隨后加入250μL Lysis Buffer（LB）8aznQdkbxag/64A9RgBALQ==，輕柔顛倒混勻6～8次。加入350μL Neutralizing Buffer（NB），輕柔顛倒混勻約10次后在12 000 G常溫離心5 min，上清液移到吸附柱上，用12 000 G常溫離心上清液1 min，倒掉清液。加入650μL Wash Buffer（WB）后12 000 G常溫離心1 min，倒出液體再12 000 G常溫離心1 min。加入30μL預熱至65℃的Elution Buffer（EB），將質粒從橡膠柱上洗下，靜置溶解1min，再10 000 G常溫離心1 min。最終，用2μL樣品進行分光光度計濃度檢測。

1.2 引物設計和目的基因的PCR擴增

1.2.1 試驗材料

上游引物pCB-GFP-F：5'- GGACTCTAGAGGAT

CCATGGTGAGCAAG -3'（BamHI酶切位點）。

下游引物pCB-GFP-R：5'- GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAG -3'（SacI酶切位點）。

質粒模板：載體質粒pCAMBIA1300-35S-空-

GFP。pCAMBIA1300-35S-空-GFP質粒含有GFP基因編碼區。

Taq Mix酶；PCR儀（BIO-RAD T100? Thermal

Cycler2）

1.2.2 試驗方法

以含有GFP基因的pCAMBIA1300-35S-空-GFP質粒為模板進行GFP基因編碼區的PCR擴增。PCR反應體系為50μL，其中，上下游引物（10μmol/L）各2μL，載體質粒pFF19 DNA 1μL（XX ng），Taq Mix酶 25μL，加水補至50μL。

擴展條件：

預變性：95℃，5 min。

變性：95℃，30 s。

退火：55℃，30秒。

延伸：72℃，1 min。

循環次數：34個循環。

最終延伸：72℃，50 min。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

1.3.1 試驗材料

瓊脂粉（tsingke TSJ001）；1×TAE緩沖液；核酸膠染劑；PCR擴增產物；DNA Marker（tsingke DL2000 DNA Marker）；GoldenView染色劑；DNA loading（EDTA，溴酚藍）。

1.3.2 試驗方法

取0.4 g瓊脂糖，加入40 mL1×TAE緩沖液中。隨后，將混合物加熱至溶解，然后冷卻至65℃左右，加入4μL核酸膠染劑，充分混合。接著將膠板放入膠槽內并插入梳子，倒入瓊脂糖凝膠溶液，等待其完全凝固后拔出梳子。將膠板放入電泳槽內，槽內加入足夠的1×TAE緩沖液使其覆蓋膠面。使用移液槍將樣品加入膠孔內。隨后將電泳槽連接至電源并設定180V恒定電壓，直至溶液前端達到膠板底部。最后關閉電源，取出膠板，并進行照膠操作，以記錄和分析凝膠上的DNA遷移帶。

1.4 載體線性化與純化

1.4.1 試驗材料

大腸桿菌質粒（DH5a）；DNA loading buffer

緩沖液；BamHI-HF酶（NEW ENGLAND BioLabs

R3136S）；SacI酶（NEW ENGLAND BioLabs

R0156L）。

1.4.2 試驗方法

線性化。在質粒載體線性化的試驗中，加入37μL蒸餾水、6μL大腸桿菌質粒（1μg）、5μL緩沖液、1μL Bam-HI酶和 1μL SacI-HF酶。反應程序：37℃，1～2 h。

純化。如前所述進行核酸電泳后，將膠板取出，將目的條帶所在膠塊切下稱重，按照試劑所示流程進行膠回收，得到酶切產物。

1.5 線性化載體與目標片段的連接與菌落培養

1.5.1 試驗材料

CE buffer（Vazyme 7E771E3）；EXuasell酶（Vazyme 7E771E3）；感受態大腸桿菌；LB培養基。

1.5.2 試驗方法

首先在離心管中加入0.42μL DNA 片段（按照最適插入片段使用量=[0.04x 插入片段堿基對數]ng（0.06pmol）配比）與 6.5μL 載體（最適克隆載體使用量=[0.2×克隆載體堿基對數]ng（0.03pmol）配比），再加入CE buffer 4μL，EXuasell酶2μL，與去離子水7.06μL。其次將上述體系用PCR儀37℃培育30 min。之后將同源重組產物使用感受態大腸桿菌轉化，37℃搖勻培養30 min后涂布在對應抗性的固體培養基上，倒置37℃過夜。

1.6 基因重組后的菌落的PCR鑒定

1.6.1 試驗材料

Taq酶mix。

F端引物pCB-GFP-F：5’- GGACTCTAGAG

GATCCATGGTGAGCAAG -3’（BamHI酶切位點）。

R端引物NOS-R：5’- GATAATCATCGCA

AGACCGG -3’（在NOS終止子上）。

1.6.2 試驗方法

挑取單菌落至40μL無菌水中。每個板挑取3個陽性菌落，取4份劑量的F端引物、R端引物、去離子水和Taq酶混合在一起，即F端引物和R端引物各4μL，40μL Taq酶，混勻。

配制PCR反應體系，進行核酸電泳，觀察目的條帶。

1.7 重組質粒提取與重組質粒的酶切驗證

首先取37μL的蒸餾水放入離心管，其次加入1μg

質粒（按提取的濃度應加入4μL），接著加入5μL cutsmart緩沖液，構建cutsmart體系，再加入1μL BamHI，然后加入1μL XmaI，接著37℃金屬浴1 h，如上所述進行核酸電泳。

1.8 農桿菌的重組DNA的導入

1.8.1 試驗材料

農桿菌（GV301）；去離子水；含有GFP的質粒；感受態細胞。

1.8.2 試驗方法

用提前培育2 d的農桿菌（GV301）取2μL質粒，與20μL感受態，在冰上靜置5 min，然后放入液氮5 min，再37℃金屬浴5 min，再在冰上靜置5 min。28℃搖床2 h。接著把搖好的菌5 000 r/min離心1 min，吸去上清液，將剩余部分吹打混勻，滴加到培養基上，涂勻，在28℃培養2 d。

1.9 農桿菌侵染煙草

1.9.1 實驗材料

農桿菌（GV301）；去離子水MgCl2溶液（1 mol/L）；

ASG-乙酰丁香酮（1 mol/L）；MES-2-嗎啉乙硫磺（15 mol/L）。

1.9.2 試驗方法

取提前培養好的農桿菌5 mL，5000rpm離心5 min。配置侵染液，1 mL MgCl2溶液（1mol/L）、1 mL ASG-乙酰丁香酮（1mol/L）、1 mL MES-2-嗎啉乙硫磺（15 mol/L）。接著將離心好的菌液上清液倒出，取100μL，與900μL侵染液混合，在光度儀中測出濃度，運用公式（測出濃度×體積/需求濃度-體積）算出所稀釋的量（2.15×5/1～5 mL）=5.75 mL。按這個濃度來配置所需溶液，將其放在搖床上培育2 h。然后將搖好的菌拿出，用針管吸取，將煙草葉子翻轉，背面朝上，用針尖扎一個孔，然后取下針尖，用食指抵住背面用注射器頭堵住葉片背面的孔，慢慢將注射器中的菌液到葉片里直至整個葉片都被菌液充滿（若一個孔不能使這個葉片布滿，則多扎幾個），最后繼續種植煙草約2 d。

2 試驗結果與分析

質粒提取及濃度測定結果顯示，組別1的質粒

濃度為247.956 g/μL，A260/A280為1.93左右，符合試驗要求。這說明提取的質粒樣品具有足夠的濃度和較少的雜質。

以pCAMBIA1300-35S-空-GFP質粒為模板，使用pCB-GFP-F和pCB-GFP-R引物進行PCR擴增試驗，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察到明顯的、符合預期大小的PCR條帶（圖1），成功得到了預期大小為750 bp的擴增產物，說明PCR成功。

圖2的瓊脂糖電泳圖展示了載體線性化實驗的結果。通過瓊脂糖電泳圖可以發現1號泳道的上方較亮的條帶為10 000 bp左右的線性化后的載體，在下方較暗的條帶為750 bp的線性化載體；2號泳道僅有一條較亮條帶，長度約為750 bp，和BamHI位點與SacI位點之間的片段長度相符，應為目的基因的PCR產物，說明載體線性化與PCR有效。

菌落擴培結果顯示，經過37℃、12 h的培養，培養基上含有GFP片段的菌落生長良好，有較多菌落，說明轉化較為成功。

菌落PCR結果如圖3所示，1、2、3泳道分別為培育好的含有GFP段落的不同獨立菌落的樣品，4為加入了無菌水的對照組。發現1、2、3泳道的條帶大小、位置基本一致，說明其取樣菌落均為真陽性，而4泳道的空白對照沒有條帶，說明無菌水無污染且實驗有效。

（M為DNA marker DL2000，1、2、3為不同的獨立菌落樣本，4為加了無菌水的對照重組質粒提取與重組質粒的酶切驗證實驗結果如圖4所示，可以看到泳道1、2均有一條較亮、長度約在10 000 bp的條帶，但由于酶切位點BamHI與XbaI之間還未插入目標基因序列，只有極少量bp的片段，切下來的片段過短，在瓊脂糖凝膠電泳圖上不可見。所以圖中沒有第二條較小條帶為正常情況，實驗有效。

M為DNA marker DL2000，泳道1、2為同一份樣品質粒轉化農桿菌試驗結果獲得了一盆（三片葉子）經過含有GFP片段的根癌農桿菌侵染的本氏煙草，菌液基本充滿了目標葉子。

3 總結與展望

本研究通過構建一種農桿菌介導的在煙草葉片中實現外源基因瞬時表達的體系，成功地實現了外源基因在本氏煙草上的快速而有效的表達。該方法具有較高的操作效率，為研究者們提供了一種新的、迅速的基因外部表達方式。農桿菌介導的基因瞬時表達技術在植物基因工程領域展現出了巨大的潛力。然而，在充分利用這一技術的同時，我們也要正視其存在的一些局限性。首先，農桿菌介導并非百分之百成功，其轉化效率受到植物天然防御機制的制約，導致試驗失敗的風險存在[5]。解決這一問題需要深入研究植物與農桿菌互作的機制，尋找提高轉化效率的途徑。其次，瞬時表達的特性使得其在子代中無法穩定遺傳。這對于作物改良和育種工作來說是一個挑戰。未來的研究可以嘗試通過進一步改良農桿菌介導技術，使得其表達能力更具持久性，能夠穩定傳遞給后代。此外，農桿菌介導的基因瞬時表達在不同植物種類中可能存在差異。因此，未來的研究可以探索優化該技術以適應更廣泛的植物類型，提高其通用性和適應性。通過克服其局限性，我們可以更好地利用這一技術，為未來植物科研和農業發展提供更多可能性。

參考文獻

[1] 唐伶俐，徐龍蘭，徐永陽，等.農桿菌介導的厚皮甜瓜遺傳轉化體系的建立[J].果樹學報，2024（2）：1-14.

[2] 孫蔓莉，孟玉玲，張強，等.農桿菌介導的煙草瞬時表達影響因素研究[J].西北農業學報，2015，24（1）：161-165.

[3] 張悅婧，李穎，王娟娟，等.不同轉化條件對3種農桿菌GFP基因在本氏煙草中瞬時表達的影響[J].植物研究，2022，42（1）：121-129.

[4] 蔡瀾峰.根癌農桿菌介導甘蔗遺傳轉化技術研究[D].福州：福建農林大學，2010.

[5] 姚冉，石美麗，潘沈元，等.農桿菌介導的植物遺傳轉化研究進展[J].生物技術進展，2011，1（4）：6.