祛痘方提取物抗炎祛痘體外功效評價

摘 要 目的：體外評價祛痘方提取物的表皮屏障修復、抗炎、控油和抗菌功效。方法：分別通過檢測對十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）誘導的HaCaT細胞損傷模型增殖的影響、對脂多糖誘導的RAW 264.7細胞一氧化氮生成的影響、對SZ95細胞增殖及其中性脂質合成的影響、對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑制作用來評價祛痘方提取物的表皮屏障修復、抗炎、控油和抗菌功效。結果：祛痘方提取物能夠提高SDS誘導的HaCaT細胞的存活率，抑制經脂多糖處理的RAW 264.7細胞分泌一氧化氮，促進SZ95細胞生長并抑制其中性脂質合成，抑制金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的活性。結論：祛痘方提取物具有顯著的表皮屏障修復、抗炎、控油和抑菌功效，有望成為一種新的中藥祛痘護膚品原料。

關鍵詞 祛痘方提取物 表皮屏障修復 抗炎 控油 抑菌

中圖分類號：TQ658.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）11-0007-05

引用本文 朱迎全， 朱聰聰， 董怡彤， 等. 祛痘方提取物抗炎祛痘體外功效評價[J]. 上海醫藥， 2024， 45（11）： 7-11； 22.

In vitro evaluation of the anti-inflammatory and anti-acne effects of Qudou formulae extract

ZHU Yingquan1， ZHU Congcong2， 3， DONG Yitong4， ZHU Quangang2， 3

（1. Department of Pharmacy， Jing’an Hospital of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200072， China； 2. Department of Pharmacy， Shanghai Skin Disease Hospital， Shanghai 200443， China； 3. Shanghai Engineering Research Center for Topical Chinese Medicine， Shanghai 200443， China； 4. Shanghai Xiu Zhi Quan Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To explore the effects of Qudou formulae （QF） extract on the epidermal barrier repair， antiinflammatory， sebum controAp+3I0916Uyf92nj8W+kXCoDDc2wJrCzEIXzHf3YPLk=l and antibacterial function. Methods： The epidermal barrier repair， anti-inflammatory， sebum control and antibacterial effects of QF extract were evaluated by detecting its effects on sodium dodecyl sulfate （SDS）-induced proliferation of HaCaT cell damage model， lipopolysaccharide （LPS）-induced nitric oxide （NO） production in RAW 264.7 cells， proliferation of SZ95 cells and neutral lipid synthesis， and inhibition of Staphylococcus aureus （S. aureus） and Propionibacterium acnes （P. acnes）. Results： QF extract could improve the survival rate of SDS-induced HaCaT cells， inhibit the secretion of NO from LPS-treated RAW 264.7 cells， promote the growth of SZ95 cells and inhibit its neutral lipid synthesis， and had the inhibitory activity against S. aureus and P. acnes. Conclusion： QF extract has significant epidermal barrier repair， anti-inflammatory， oil control and antibacterial effects， and is expected to become a new raw material for Chinese medicine acne skin care products.

KEY WORDS Qudou formulae extract； epidermal barrier repair； anti-inflammatory； sebum control； bacteriostasis

痤瘡是一種常見的慢性皮膚病，其特征是丘疹、膿皰、囊腫甚至出現結節，累及約85%的青少年，嚴重影響患者的生理和心理健康。痤瘡的發病與免疫性炎性反應、皮脂分泌過多、痤瘡丙酸桿菌定植密切相關[1]，目前臨床上主要以異維A酸、抗生素治療為主，但有不良反應[2]。因此，探尋安全、有效的補充替代療法具有重要意義。

中醫學治療痤瘡經驗豐富，多以內服、外敷方藥為主。隨著中醫藥發展，從中草藥中萃取活性成分融入護膚品中日常使用以改善痤瘡等肌膚問題成為一種趨勢。祛痘方由丹參、苦參、白術、野菊花和甘草組成，其中丹參能抑制酪氨酸酶活性，具有美白作用[3-4]；苦參對多種皮膚炎癥、真菌感染有治療作用[5-6]；白術能改善皮膚屏障功能障礙和皮膚色素沉著[7-8]；野菊花具有顯著的抗炎、抗氧化作用[9]；甘草常用于治療皮膚瘙癢和皮膚屏障功能障礙[10-11]。祛痘方可能具有促進表皮屏障修復、改善皮膚炎癥和抗菌功效，從而改善痤瘡的臨床潛力，但現相關研究很少。本研究通過構建多種體外模型來評價祛痘方提取物的表皮屏障修復、抗炎和祛痘抗菌功效，為中醫藥在護膚品領域的開發應用提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

CCK-8細胞計數試劑盒（日本同仁化學研究所）；一氧化氮試劑盒、BeyoGold黑色透明底96孔細胞培養板（購自碧云天生物技術有限公司）；DMEM培養基、胎牛血清[購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；營養肉湯培養基、大豆酪蛋白瓊脂培養基、腦心浸液肉湯培養基、腦心浸液瓊脂培養基（購自青島海博生物技術有限公司）；丹參（批號：220224；產地：山東）、苦參（批號：220218；產地：山西）、蜜麩炒白術（批號：220208；產地：安徽）、野菊花（批號：220113；產地：湖北）、甘草（批號：220424；產地：內蒙古）（購自上海虹橋飲片有限公司）；人永生化角質形成細胞HaCaT、人皮脂腺細胞SZ95、小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7、金黃色葡萄球菌ATCC 6538（來自上海市皮膚病醫院）；痤瘡丙酸桿菌ATCC 6919（購自北納創聯生物科技有限公司）。

BPZ-6033真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；OSB-2100水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；Spectramax M2多模式酶標儀（美國Molecular Devices公司）；細胞培養箱、HFsafe-1200LC生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；YC-520L醫用冷藏箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）；電子天秤[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 實驗方法

1.2.1 祛痘方提取物的制備

按祛痘方處方稱取丹參、苦參、蜜麩炒白術、野菊花和甘草，適當粉碎后混合在一起，加6倍量水浸泡30 min，進行2次提取，每次1 h。提取液經過濾、濃縮，得到含生藥量1 g/mL的濃縮液。濃縮液再以2倍量乙醇醇沉12 h，然后過濾并濃縮至無乙醇味，得到含生藥量 1 g/mL的流浸膏[12]。

1.2.2 祛痘方提取物對HaCaT、SZ95、RAW 264.7細胞存活率的影響

在96孔板上按照每孔2萬個的密度接種HaCaT、SZ95或RAW 264.7細胞，并于細胞培養箱內孵育24 h，隨后分別加入含生藥量25、50、100、200 μg/mL的祛痘方提取物溶液，繼續孵育24 h。除去培養基并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）清洗，再加入含10% CCK-8試劑的培養基，孵育30 min，最后用酶標儀檢測各孔在450 nm波長下的光密度（optical density， OD），并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（給藥組OD450-PBS孔OD450）/（空白組OD450-PBS孔OD450）×100%。

1.2.3 祛痘方提取物對十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）誘導的HaCaT細胞損傷模型細胞生存率的影響

在96孔板上按照每孔1萬個的密度接種HaCaT細胞，并于細胞培養箱內孵育過夜，隨后吸除d900658a79464fa829cbd935f224b495上清液，加入80 μg/mL SDS溶液100 μL，繼續孵育24 h。吸除上清液后，再分別加入含生藥量25、50、100、200、400μg/mL的祛痘方提取物溶液，孵育24 h，最后用CCK-8法檢測細胞存活率。

1.2.4 祛痘方提取物對脂多糖誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型中一氧化氮濃度的影響

將RAW 264.7細胞以每孔20萬個的密度接種于12孔板，待細胞貼壁后分別加入含生藥量50、100、200、400 μg/mL的祛痘方提取物溶液，孵育1 h。然后，空白組加入100 μL培養基，其余組均加入等量的10 μg/mL脂多糖溶液，繼續孵育24 h后收集上清液。按照一氧化氮試劑盒說明書進行操作，用酶標儀于540 nm波長下檢測一氧化氮水平。根據標準品曲線計算經不同濃度祛痘方提取液處理后細胞中的一氧化氮水平，并計算一氧化氮抑制率。一氧化氮抑制率（%）=（模型組一氧化氮水平-給藥組一氧化氮水平）/模型組一氧化氮水平×100%[13]，其中模型組指僅加入了脂多糖溶液組。

1.2.5 祛痘方提取物對SZ95細胞中性脂質合成的影響

將SZ95細胞以每孔1萬個的密度接種于BeyoGold黑色透明底96孔細胞培養板上，次日分別加入含生藥量50、100、200 μg/mL的祛痘方提取物溶液，于37 ℃、5%二氧化碳細胞培養箱中孵育24 h。吸除上清液并用PBS清洗后，再向每孔中加入10 μg/mL的尼羅紅溶液進行染色，37 ℃下避光孵育10 min。PBS清洗后，用酶標儀于激發波長485 nm/發射波長565 nm下檢測尼羅紅的熒光強度。SZ95細胞內的相對脂質含量用給藥組與對照組的熒光強度之比（百分比）來表示。

1.2.6 祛痘方提取物對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的抑菌率測定

祛痘方提取物對金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的抑菌率通過微量肉湯稀釋法實驗獲得，實驗具體操作步驟為：①于無菌操作條件下，在96孔板各孔中加入100 μL的營養肉湯培養基（用于金黃色葡萄球菌培養）或腦心浸液肉湯培養基（用于痤瘡丙酸桿菌培養）；②在第1孔中加入100 μL的祛痘方提取物溶液，與孔中培養基吹打混勻后，吸出100 μL的混懸液加至第2孔中，如此操作直到第11孔，然后從第11孔中吸出100 μL的混懸液并棄掉，第12孔中不加祛痘方提取物溶液作為陽性對照；③向各孔中加入稀釋好的菌液100 μL并使每孔中的菌液終濃度均為1×106 CFU/mL，同時設置陰性對照（僅含不同稀釋倍數的祛痘方提取物溶液和培養基，以去除祛痘方提取物的背景OD630）；④孵育24 h后檢測OD630，并計算細菌存活率。細菌存活率（%）=（給藥組OD630-陰性對照孔OD630）/（陽性對照孔OD630-陰性對照孔OD630）×100%[14]。抑菌率（%）=100%-細菌存活率（%）。

1.3 統計學方法

運用SPSS 24.0軟件對研究數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，符合正態分布的，滿足方差齊性時組間比較采用t檢驗，不滿足方差齊性時組間比較采用t’檢驗；不符合正態分布的，組間比較采用非參數檢驗。P<0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 祛痘方提取物的表皮屏障修復功效評價結果

圖1A顯示，含生藥量50、100 μg/mL的祛痘方提取物均能促進HaCaT細胞生長，尤以含生藥量50 μg/mL祛痘方提取物的效果最為顯著（P<0.05）。圖1B顯示，經80 μg/mL SDS處理后，HaCaT細胞的存活率顯著下降（P<0.001），而給予含生藥量50、100 μg/mL的祛痘方提取物后，細胞存活率顯著提高（分別為P<0.001、P<0.05）。以上結果說明，含生藥量50、100μg/mL的祛痘方提取物均具有顯著的表皮屏障修復功效，其中以含生藥量50 μg/mL祛痘方提取物的效果最好。

2.2 祛痘方提取物的抗炎功效評價結果

圖2A顯示，含生藥量50～400 μg/mL的祛痘方提取物均能促進RAW 264.7細胞的生長。圖2B顯示，含生藥量50～400 μg/mL的祛痘方提取物均能抑制脂多糖誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型分泌一氧化氮，且隨著祛痘方提取物濃度增大，抑制作用趨于增強，其中含生藥量100、200、400 μg/mL的祛痘方提取物具有顯著的抑制作用（分別為P<0.05、P<0.001、P<0.001）。

2.3 祛痘方提取物的控油功效評價結果

圖3A顯示，含生藥量25～200 μg/mL的祛痘方提取物均能促進SZ95細胞生長，且隨著祛痘方提取物濃度增大，促進作用趨于增強，其中含生藥量100、200μg/mL的祛痘方提取物具有顯著的促進作用（均P<0.05）。圖3B顯示，含生藥量25～200 μg/mL的祛痘方提取物均能抑制SZ95細胞的中性脂質合成，且隨著祛痘方提取物濃度增大，抑制作用趨于增強，其中含生藥量200 μg/mL祛痘方提取物具有顯著的抑制作用（P<0.001）。以上結果說明，含生藥量25～200 μg/mL的祛痘方提取物對SZ95細胞均沒有細胞毒性，且能抑制其中性脂質合成，由此呈現控油功效。

2.4 祛痘方提取物的抗菌功效評價結果

將祛痘方提取物溶液稀釋4～256倍，觀察它們對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑制作用。由圖4可知，祛痘方提取物溶液稀釋4～8倍后對金黃色葡萄球菌的抑菌率>90%，但稀釋64倍后的抑菌率僅為16.11%，稀釋256倍后幾乎無抑菌作用（抑菌率<10%）。對于痤瘡丙酸桿菌，祛痘方提取物溶液稀釋4～16倍后的抑菌率>90%，稀釋64倍后的抑菌率為42.50%，稀釋128倍及以上幾乎無抑菌作用（抑菌率<10%）。

3 討論

痤瘡是一種常見皮膚病，由遺傳、激素和環境等多種因素引起。痤瘡的發病機制復雜，主要涉及炎性反應、皮脂分泌增多和微生物群異常等。在痤瘡的炎性反應關鍵環節中，角質形成細胞除充當表皮屏障外，還作為免疫細胞在啟動并維持先天性和適應性免疫反應方面發揮著重要作用[15-16]。巨噬細胞作為皮膚中的抗原呈遞細胞，能從外周循環進入皮膚，在皮膚組織內“巡視”，具有抗原感知、加工和呈遞的功能[17]。諸多證據顯示，痤瘡皮損周圍的巨噬細胞能夠分泌促炎細胞因子而促進痤瘡的發展[18-19]。此外，皮脂大量分泌和痤瘡丙酸桿菌定植也與痤瘡的發生發展密切相關。皮脂源于皮脂腺，是多種脂肪成分的混合物，包括甘油三酯、蠟酯、角鯊烯、游離脂肪酸和膽固醇等，其中游離脂肪酸可促使皮脂腺導管的角化，從而引起炎性反應；角鯊烯能促使毛囊壁上層細胞的增殖，從而形成黑頭粉刺[20]。痤瘡丙酸桿菌可通過分泌脂肪酸、蛋白質等，對毛囊壁結構造成損傷，從而加劇炎性反應。另外，金黃色葡萄球菌是人類皮膚的常見微生物，其與包括痤瘡在內的多種皮膚病的發生發展相關。

本實驗顯示，祛痘方提取物能夠促進正常HaCaT細胞和SDS誘導的HaCaT損傷模型細胞的生長，說明其具有一定的表皮屏障修復功效。脂多糖誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型是經典的炎癥模型，被廣泛用于抗炎功效評價。祛痘方提取物能夠抑制該模型分泌一氧化氮，但對RAW 264.7細胞本身沒有毒性，說明其具有抗炎功效。此外，祛痘方提取物雖然對SZ95細胞生長沒有抑制作用，但能減少SZ95細胞中性脂質的合成，并能有效抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性，說明其具有一定的控油和抗菌功效。

總之，祛痘方提取物具有較好的表皮屏障修復、抗炎、控油和抗菌功效，且其方中藥味均為常用中草藥，具有一定的安全性，故有望成為一種新的中藥祛痘護膚品原料。

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