基于網絡藥理學和分子對接技術探究人參皂苷Rb₁抗腦缺血再灌注損傷的作用機制

摘 要 目的：通過網絡藥理學和分子對接技術尋找人參皂苷Rb1抗腦缺血再灌注損傷的可能作用機制，為今后實驗研究提供一定的理論依據。方法：通過SuperPred數據庫獲取人參皂苷Rb1相關作用靶點，利用GEO、GeneCards和OMIM數據庫獲取腦缺血再灌注損傷的異常表達分子，通過交集分析獲得人參皂苷Rb1作用于腦缺血再灌注損傷的可能靶點。對所選靶點進行蛋白-蛋白相互作用網絡構建、GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，獲得有效靶點的基因和信號通路。最后運用AutoDock軟件對關鍵靶點與人參皂苷Rb1進行分子對接，獲得最佳結合靶點。結果：在SuperPred數據庫中獲得人參皂苷Rb1的潛在作用靶點163個，在GeneCards和OMIM數據庫中獲得腦缺血再灌注損傷的潛在作用靶點228個，分析后獲得14個人參皂苷Rb1與腦缺血再灌注損傷的交集靶點。GO功能富集分析得150個條目，KEGG信號通路富集分析得24條信號通路。分子對接結果顯示，人參皂苷Rb1與NFKB1和STAT3有較強的親和力。結論：人參皂苷Rb1可能通過NFKB1和STAT3信號通路產生抗腦缺血再灌注損傷作用。

關鍵詞 腦缺血再灌注損傷 人參皂苷Rb1 網絡藥理學 分子對接 作用機制

中圖分類號：R285； R743.3 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）11-0093-06

引用本文 王玉珠， 陳婷婷， 李曉宇. 基于網絡藥理學和分子對接技術探究人參皂苷Rb1抗腦缺血再灌注損傷的作用機制[J]. 上海醫藥， 2024， 45（11）： 93-98； 119.

基金項目：上海市臨床重點專科建設項目（shslczdzk06504）；復旦大學附屬中山醫院院內青年基金項目（2021ZSQN19）

Mechanism of ginsenoside Rb1 against cerebral ischemia-reperfusion injury based on compound network pharmacology and molecular docking technology

WANG Yuzhu， CHEN Tingting， LI Xiaoyu

（Department of Pharmacy， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： The possible targets of ginsenoside Rb1 against cerebral ischemia-reperfusion injury were investigated by network pharmacology and molecular docking technology to explore the molecular mechanism of ginsenoside Rb1， so as to provide a theoretical basis for future experimental studies. Methods： Ginsenoside Rb1-related target genes were obtained from the SuperPred database， and abnormally expressed molecules in cerebral ischemia-reperfusion injury were obtained from the GEO， GeneCards and OMIM databases， and the possible targets of ginsenoside Rb1 acting on cerebral ischemia-reperfusion injury were obtained through intersection analysis. Effective genes and signaling pathways were enriched by the protein-protein interaction network， GO function enrichment analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis. AutoDock software was used to molecularly dock key targets and active ingredients to select the best binding target. Results： One hundred and sixty-three potential targets of ginsenoside Rb1 were obtained from SuperPred database， and 228 potential targets of cerebral ischemia-reperfusion injury from GeneCards and OMIM databases. A total of 14 targets of ginsenoside Rb1 were obtained after intersecting with cerebral ischemia-reperfusion injury. One hundred and fifty entries were obtained by GO functional enrichment analysis， and KEGG pathway enrichment analysis yielded 24 signaling pathways. The analysis of docking showed that ginsenoside Rb1 had stronger affinity with NFKB1 and STAT3. Conclusion： Ginsenoside Rb1 may exert anti-cerebral ischemia-reperfusion injury effects through NFKB1 and STAT3 signaling pathways.

KEY WORDS cerebral ischemia-reperfusion injury； ginsenoside Rb1； network pharmacology； molecular docking； mechanism

腦卒中是全球人口第二大死亡原因，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中的80%左右。腦卒中具有發病率高、死亡率高和致殘率高的特點，給人們生命健康帶來嚴重威脅[1]。大腦對缺氧最為敏感，腦細胞缺血、缺氧會導致大腦功能損害，損害程度與缺血、缺氧時間的長短和殘存的血流量有關。總體而言，短時間內大腦不完全性缺血、缺氧造成的腦組織損傷是可逆的，而長時間的大腦嚴重或完全性缺血、缺氧則會導致腦梗死。因此，處理缺血性腦卒中要盡早，并須快速恢復大腦血流的再灌注。然而，在某些情況下，大腦缺血后血流的再灌注會導致腦組織損傷及其功能障礙進一步的加重，這種現象被稱為腦缺血再灌注損傷[2]。對腦缺血再灌注損傷的預防和治療是缺血性腦卒中治療的重要組成。

我們的前期研究顯示，三七總皂苷對過氧化氫所致原代培養的大鼠腦微血管內皮細胞（rat brain microvascular endothelial cells， rBMECs）損傷有很好的保護作用，而產生此保護作用的主要物質基礎可能為人參皂苷Rb1、Rg1、Rd1，其中以人參皂苷Rb1的貢獻最大[3]。我們在實驗中發現，對大鼠靜脈注射20 mg/kg的三七總皂苷注射液后，人參皂苷Rb1在其腦組織中的分布量最高約為1.4 μg/g，分布持續時間長達24 h，而人參皂苷Rg1的腦組織含量最高僅為0.2 μg/g，分布持續時間只有1 h。基于此，我們以人參皂苷Rb1為代表，研究其能否透過血腦屏障入腦。體外試驗發現，葡萄糖轉運體抑制劑根皮素可顯著抑制rBMECs對人參皂苷Rb1的攝取，由此驗證了我們提出的葡萄糖轉運體可能參與了大腦對人參皂苷Rb1攝取的假設[4]。人參皂苷Rb1能透過血腦屏障入腦，然而其發揮腦組織保護作用的靶點還未見有相關研究報告，仍需進行進一步的探索。本研究運用網絡藥理學和分子對接技術探究人參皂苷Rb1抗腦缺血再灌注損傷的作用機制，旨在為腦卒中治療及其研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 腦缺血再灌注損傷靶點基因的獲取

從GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE163614表達數據（HTSeq-Counts），其中大鼠腦缺血再灌注損傷樣本為實驗組，假手術組為對照組。同時，使用GEO數據庫中的R包“homologene”將大鼠基因轉化為人類同源基因。以“cerebral ischemiareperfusion injury”為關鍵詞，分別通過GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）和OMIM數據庫（http：// www.omim.org/）對腦缺血再灌注損傷的疾病靶點進行搜索。將自這兩個數據庫獲得的基因合并去重，得到腦缺血再灌注損傷相關的疾病靶點。

1.2 人參皂苷Rb1靶點基因的獲取

通過SuperPred數據庫（http：//prediction.charite.de/）獲取人參皂苷Rb1靶點基因。由于自該數據庫獲得的基因名為UniProt ID，故還需通過UniProt網站（http：// www.uniprot.org/）將UniProt ID轉化為常用的基因符號。

1.3 人參皂苷Rb1和腦缺血再灌注損傷靶點基因的Venn圖分析

使用GEO數據庫中的R包“Venn Diagram”，將腦缺血再灌注損傷和人參皂苷Rb1的靶點基因進行映射分析，繪制兩者的Venn圖，選取交集，得到兩者的共靶點基因（關鍵基因）。

1.4 人參皂苷Rb1在腦缺血再灌注損傷中的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

為了探究關鍵基因的生物學功能和相關信號通路，對上述所得腦缺血再灌注損傷和人參皂苷Rb1的共靶點基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。將偽發現率設置為<0.05，對排名前10位的條目進行討論分析。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡圖構建

將腦缺血再灌注損傷和人參皂苷Rb1的共靶點基因蛋白導入STRING數據庫（http：//www.string-db.org），設置中等置信度>0.4，并去除孤立靶點，得到蛋白-蛋白相互作用信息。將蛋白-蛋白相互作用信息導入Cytoscape軟件，使相互作用可視化。

1.6 分子對接

在PDB數據庫（http：//www1.rcsb.org/yWfJ2ZIuNTo54l6t3aCu7HbP1hQ5oShGwa5+PMdvKpQ=）中檢索并篩選關鍵靶點受體蛋白三維結構文件，然后將這些結構文件導入AutoDock Tools軟件進行分子對接，并使用PyMol軟件進行可視化處理。對接分數（結合能）越低，表示配體和受體的親和力越強。通常，對接分數<？5 kcal/mol被認為具有很強的化合物-靶點結合親和力。

2 結果

2.1 人參皂苷Rb1和腦缺血再灌注損傷靶點基因交集的Venn圖

通過GeneCards和OMIM數據庫共獲得疾病相關靶點基因228個，通過SuperPred數據庫獲得藥物相關靶點基因163個。使用GEO數據庫中的R包“Venn Diagram”，繪制疾病相關靶點基因與藥物相關靶點基因交集的Venn圖（圖1），獲得14個關鍵基因，分別為PLAT、SERPINE1、ITGB1、ADRB1、NFKB1、NT5E、C5AR1、AXL、KDR、STAT3、PTGER2、PRKCD、SCN5A、S1PR3。

2.2 GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

為了探究關鍵基因的生物學功能和相關信號通路，使用GEO數據庫中的R包“Cluster Profiler”對14個關鍵基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。以P<0.05為篩選標準，共富集到150個GO生物學功能條目，其中GO生物學過程條目133個，GO細胞組分條目11個，GO分子功能條目6個。將上述3個部分各自最顯著（P值越小，越顯著）的前10個生物學功能（如果富集獲得的某個部分生物學功能少于10個條目，則取獲得的該部分的所有生物學功能）繪制成柱狀圖（圖2），發現GO生物學過程分別為血管生成的正向調節、血管系統發育的積極調節、傷口愈合、傷口愈合的調節、血管生成的調節、血管系統發育的調節、對傷害反應的調節、凝血的負調節、止血的負調節、血凝物的負調節，GO細胞組分分別為Schaffer collateral- CA1突觸、閏盤、細胞-細胞接觸區、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔、囊泡腔、膜筏、膜微域、谷氨酸能突觸、肌瘤，GO分子功能分別為跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、整合素結合、病毒受體活性、外源性蛋白結合。

以P<0.05為篩選標準，共富集到24條KEGG信號通路。將最顯著的前10條信號通路繪制成氣泡圖（圖3），發現分別為糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體信號通路、對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、弓形蟲病、神經活性配體-受體相互作用、補體和凝血級聯、胰島素抵抗、低氧誘導因子-1信號通路、趨化因子信號通路、癌癥中的蛋白聚糖。進一步的，繪制圈圖以展現參與上述信號通路的基因（圖4）。

2.3 蛋白-蛋白相互作用網絡圖

運用STRING數據庫，對14個關鍵基因進行蛋白-蛋白相互作用網絡分析，設置中等置信度>0.4，并去除孤立靶點，得到蛋白-蛋白相互作用信息。將蛋白-蛋白相互作用信息導入Cytoscape軟件，使相互作用可視化（圖5）。再使用Cytoscape軟件的cytoHubba插件，計算各基因節點的degree，繪制各基因degree柱狀圖（圖6）。

2.4 分子對接

本研究選擇糖代謝相關蛋白NFKB1和STAT3與人參皂苷Rb1進行分子對接。人參皂苷Rb1與NFKB1和 STAT3均具有較強的結合親和力，最低結合能分別為？7.9和？7.4 kcal/mol。

分子對接結果（圖7）顯示，人參皂苷Rb1與NFKB1的氨基酸殘基ARG-57、GLY-55、SER-243、ASN-250、ASP-274、LYS-275、ARG-308結合，由此形成人參皂苷Rb1與NFKB1的穩定復合物（圖7A）；與STAT3的氨基酸殘基ASP-502、TRP-501、THR-526、GLY-583、ARG-518結合，由此形成人參皂苷Rb1與STAT3的穩定復合物（圖7B）。

3 討論

腦卒中是臨床常見疾病之一。一些中成藥制劑，如燈盞生脈、血栓通等，對缺血性腦卒中有一定的療效，而它們的共有有效成分之一就是人參皂苷Rb1。人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷，屬達瑪烷型三萜皂苷類化合物，為人參、三七、西洋參等五加科植物的主要活性成分，具有延緩衰老、促進周圍神經再生、改善腦缺血狀態、抗骨質疏松和逆轉腫瘤細胞耐藥等多種藥理作用[5-8]。研究表明，人參皂苷Rb1能通過下調beclin-1表達，減少谷氨酸介導的大腦皮層神經元損傷[9]；通過上調抗凋亡基因Bcl和下調促凋亡基因Bax表達，減少缺氧神經元細胞的凋亡[10]；通過上調腦源性神經營養因子和抗凋亡基因表達，減少短暫性腦缺血引起的神經細胞凋亡[11]。因此，人參皂苷Rb1可能是通過多靶點、多通路的作用而產生腦保護作用的，這為進一步研究并推廣人參皂苷Rb1的臨床應用提供了理論依據。

我們在前期研究中發現，葡萄糖轉運體可能介導了人參皂苷Rb1的跨血腦屏障轉運[4]。此外，還有研究證實，人參皂苷Rb1可上調葡萄糖轉運體表達，進而使人參皂苷Rb1得以進一步透過血腦屏障入腦[12]。本研究對人參皂苷Rb1和腦缺血再灌注損傷共靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡圖的分析顯示，人參皂苷Rb1作用于腦缺血再灌注損傷的關鍵靶點為PLAT、SERPINE1、ITGB1、ADRB1、NFKB1、NT5E、C5AR1、AXL、KDR、STAT3、PTGER2、PRKCD、SCN5A、S1PR3，其中與糖代謝相關的是NFKB1和STAT3。通過GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析發現，人參皂苷Rb1是通過晚期糖基化終產物及其受體信號通路、對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、弓形蟲病、神經活性配體-受體相互作用、補體和凝血級聯、胰島素抵抗、低氧誘導因子-1信號通路、趨化因子信號通路、癌癥中的蛋白聚糖等而產生抗腦缺血再灌注損傷作用的。即：本研究結果表明，人參皂苷Rb1是通過多通路、多靶點作用而產生抗腦缺血再灌注損傷作用的。

在分子對接中，結合能越小，表示蛋白與化合物的結合越穩定[13]。本研究的分子對接結果表明，人參皂苷Rb1與腦缺血再灌注損傷糖代謝相關靶點蛋白NFKB1和STAT3均具有很強的親和力，提示人參皂苷Rb1可能是通過這兩個關鍵靶點而產生抗腦缺血再灌注損傷作用的。未來我們將對NFKB1和STAT3進行相關實驗驗證，進一步探究人參皂苷Rb1的抗腦缺血再灌注損傷作用機制。

參考文獻

[1] 《中國腦卒中防治報告》編寫組. 《中國腦卒中防治報告2020》概要[J]. 中國腦血管病雜志， 2022， 19（2）： 136-144.

[2] Mumoli N， Cei M. Acute ischemic stroke [J]. N Engl J Med， 2007， 357（21）： 2203.

[3] 李曉宇， 孫建國， 鄭媛婷， 等. 三七總皂苷對抗H2O2所致大鼠腦微血管內皮細胞損傷的物質基礎研究[J]. 中國藥理學通報， 2007， 23（8）： 1030-1034.

[4] 王玉珠， 顧圣瑩， 張吉剛， 等. 根皮素對rBMECs攝取人參皂苷Rb1的影響[J].中國藥學雜志， 2015， 50（3）： 226-232.

[5] Kim HJ， Kim P， Shin CY. A comprehensive review of the therapeutic and pharmacological effects of ginseng and ginsenosides in central nervous system [J]. J Ginseng Res， 2013， 37（1）： 8-29.

[6] Wang CZ， Anderson S， Du W， et al. Red ginseng and cancer treatment [J]. Chin J Nat Med， 2016， 14（1）： 7-16.

[7] Lu T， Jiang Y， Zhou Z， et al. Intranasal ginsenoside Rb1 targets the brain and ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Biol Pharm Bull， 2011， 34（8）： 1319-1324.

[8] Cheng B， Li J， Du J， et al. Ginsenoside Rb1 inhibits osteoclastogenesis by modulating NF-κB and MAPKs pathways [J]. Food Chem Toxicol， 2012， 50（5）： 1610-1615.

[9] Lan TH， Xu DP， Huang MT， et al. Ginsenoside Rb1 prevents homocysteine-induced EPC dysfunction via VEGF/p38MAPK and SDF-1/CXCR4 activation [J]. Sci Rep， 2017， 7（1）： 13061.

[10] Zhang B， Hata R， Zhu P， et al. Prevention of ischemic neuronal death by intravenous infusion of a ginseng saponin， ginsenoside Rb1， that upregulates Bcl-xL expression [J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2006， 26（5）： 708-721.

[11] Gao XQ， Yang CX， Chen GJ， et al. Ginsenoside Rb1 regulates the expressions of brain-derived neurotrophic factor and caspase-3 and induces neurogenesis in rats with experimental cerebral ischemia [J]. J Ethnopharmacol， 2010， 132（2）： 393-399.

[12] Wang YZ， Xu Q， Wu W， et al. Brain transport profiles of ginsenoside Rb1 by glucose transporter 1： in vitro and in vivo[J]. Front Pharmacol， 2018， 9： 398.

[13] 孫悅龍， 張夢潔， 豆佳紅， 等. 基于網絡藥理學及分子對接技術研究黃芪調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉的作用[J].中國畜牧獸醫， 2022， 49（8）： 3200-3211.