高原青稞籽粒提取物的成分分析及其抗氧化活性研究

摘 要 目的：對比青稞籽粒的提取方法，以最大化獲得其抗氧化活性物質(zhì)。方法：采用生物發(fā)酵法、水提法、醇提法3種方法，對比分析青稞籽粒提取物中β-葡聚糖、總酚的提取效率。通過鐵離子還原抗氧化能力測定（FRAP），2，2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法檢測青稞籽粒提取物的抗氧化能力。同時，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對提取物進行代謝物鑒定。結(jié)果：醇提法表現(xiàn)出最優(yōu)的提取效果，得到2.03 μg/mL β-葡聚糖和8.88 μg/mL沒食子酸當量的總酚，并在FRAP、ABTS、DPPH 3種抗氧化能力檢測法中都顯示出最強的抗氧化能力。代謝物分析篩選出25種化合物，其中23種具有抗氧化活性。結(jié)論：本研究揭示了青稞籽粒提取物的代謝組成及其抗氧化活性，為深入理解青稞的營養(yǎng)特性及其潛在健康效益提供了科學依據(jù)，也為青稞在醫(yī)藥和保健品開發(fā)中的應(yīng)用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞 高原青稞 提取物 抗氧化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 代謝組學

中圖分類號：R284； R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）11-0023-06

引用本文 辜苗， 盧寶榮， 王久存， 等. 高原青稞籽粒提取物的成分分析及其抗氧化活性研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（11）： 23-28； 73.

Compositional analysis and antioxidant activity study of highland barley seed extracts

GU Miao1，2， LU Baorong2， WANG Jiucun2， MA Yanyun2

（1. School of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010021， China； 2. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433， China）

ABSTRACT Objective： To compare the extraction process of highland barley seeds to maximize their antioxidant activities. Methods： Three methods， namely， biofermentation， aqueous extraction and alcohol extraction， were used to comparatively analyze the extraction efficiency of β-glucan and total phenols from barley seed grain extract. The antioxidant capacity of the three barley seed extracts was detected by ferric reducing antioxidant power （FRAP）， 2，2’-binamine-di-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid（ABTS） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging assay. Meanwhile， the identification of metabolite from the extracts was performed using high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Results： The alcoholic extraction method showed optimal extraction， yielding 2.03 μg/mL β-glucan and 8.88 μg/mL gallic acid equivalent of total phenols， and the strongest antioxidant activity in all the three antioxidant activity assays， FRAP， ABTS， and DPPH. Twentyfive compounds were screened out by metabolite analysis， 23 of which possessed antioxidant properties. Conclusion： This study reveals the metabolic composition of highland barley seed extract and its antioxidant activity， which provides a scientific basis for an in-depth understanding of the nutritional properties of barley and its potential health benefits， as well as theoretical support for the application of barley in the development of pharmaceuticals and nutraceuticals.

KEY WORDS highland barley； extract； antioxidant； LC-MS/MS； metabolomics

青稞（Hordeum vulgare Linn. var. Nudum Hook. f.）是一種主要生長在西藏自治區(qū)青藏高原的重要作物，種植在海拔4 200 m左右的地區(qū)[1]。青稞中含有黃酮類以及酚類物質(zhì)等功能活性物質(zhì)，具有較強的抗氧化性能和清除自由基潛力[2]。

抗氧化是一種保護生物體免受活性氧的損害的生理過程[3]。抗氧化能力的降低或失衡會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，如癌癥、糖尿病、皮膚相關(guān)疾病[4-6]。因此，提高抗氧化能力是維持生物體健康、預(yù)防和治療疾病的重要手段之一。

隨著人們生活節(jié)奏的加快和環(huán)境污染的惡化，人們越來越關(guān)注健康和預(yù)防病癥，從而增加了對抗氧化的關(guān)注和需求。天然植物活性成分通常具有安全性高、多靶點作用、易于獲得和利用及可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢[7-8]。但也存在一些限制和挑戰(zhàn)，如純度不高、穩(wěn)定性差、生物活性低等問題[9-10]。

因此，本研究采用鐵離子還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power， FRAP）測定法、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-binamine-di-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfo nic acid， ABTS）自由基清除法、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）自由基清除法檢測青稞籽粒提取物的抗氧化能力，并使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography with tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）對青稞籽粒提取物進行物質(zhì)含量鑒定及篩選具有抗氧化能力的物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

青稞籽粒（中國西藏山南市洛扎縣紫色短芒）；無水乙醇、NA2CO3[生工生物工程（上海）股份有限公司]；酵母粉（安琪酵母股份有限公司）；沒食子酸（gallic acid， GA。上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；b-葡聚糖、福林酚（美國Sigma-Aldrich公司）；總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）、總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法。上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DPPH（美國MedChemExpress公司）。

閃式提取儀（中國上海堃博自動化設(shè)備有限公司）；真空冷凍干燥儀（美國Labconco公司）；研磨機（中國小熊電器股份有限公司）；恒溫振蕩 器（美國精騏有限公司）。

1.2 青稞籽粒提取物制備

本研究采用3種方式提取青稞籽粒，獲得青稞籽粒提取物（hordeum vulgare seed extract， HVSE），分別命名為生物發(fā)酵法提取青稞籽粒（1-HVSE）、水提法提取青稞籽粒（2-HVSE）、醇提法提取青稞籽粒（3-HVSE），具體操作流程如圖1所示。

1.3 b-葡聚糖含量檢測

剛果紅配制：稱取剛果紅粉末1 mg，溶于10 mL ddH2O中，剛果紅濃度為0.1 mg/mL；標準曲線繪制：使用0.2 mg/mL b-葡聚糖配制不 同濃度：0、5、10、30、50、70、100、120 、150、180、200 μg/mL b-葡聚糖；取20 μL標準品、待測樣品、空白對照加入96孔板中，加

入180 μL配制好的剛果紅溶液；室溫下反應(yīng)30 min，550 nm下測定吸光度。

1.4 總酚含量檢測

以GA當量計算總酚含量，繪制GA標準品曲線，設(shè)置不同濃度GA；分別將20 μL 3種青稞籽粒提取物、GA標準品、空白對照加入96孔板中；然后在96孔板中加入40 μL 10% F-C試劑，充分混勻；再向96孔板中加入160 μL 700 mmol/L Na2CO3溶液，室溫避光孵育2 h；待孵育結(jié)束后，用酶標儀于765 nm下測定吸光值；根據(jù)繪制好的標準曲線，計算青稞籽粒提取物的總酚含量。

1.5 抗氧化能力檢測

FRAP法及ABTS法抗氧化能力檢測：根據(jù)試劑盒提供的實驗操作流程進行。

DPPH法抗氧化能力檢測：稱取DPPH 2 mg，溶于無水乙醇50 mL，配制成0.004% DPPH溶液，黑暗條件下保存4 ℃；樣本∶DPPH=1∶5加入樣本和DPPH，在1.5 mL EP管中，加入樣本、對照（無水乙醇、PBS）100 μL，DPPH 400 μL；避光反應(yīng)20 min，離心取上清1 000 r/min，3 min，取上清100 μL，加入96孔板中，517 nm下測吸光度。注意加入樣本時，不能產(chǎn)生氣泡。

1.6 LC-MS/MS

采用LC-MS/MS技術(shù)對3-HVSE的代謝物進行鑒定，具體實驗流程大致如下：

1）樣本收集，稱取250 mg 3-HVSE于1.5 mL EP管中備用；代謝物預(yù)處理，3-HVSE溶解進行代謝物提取；LC-MS/MS上機；下機原始數(shù)據(jù)使用CD 3.1數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)預(yù)處理；然后比對高分辨二級譜圖數(shù)據(jù)庫mzCloud和mzVault以及MassList一級數(shù)據(jù)庫檢索（搜庫），進行代謝物鑒定。

2）信息分析，將在搜庫中得到的代謝物定性和定量數(shù)據(jù)進行信息分析。對鑒定到的代謝物進行分類，得到正離子（pos）模式和負離子（neg）模式2種代謝物分類圖，將代謝物與LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫比對分析得到LIPID MAPS代謝物分類圖。最后篩選相對含量前50的代謝物進行功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 青稞籽粒提取物b-葡聚糖、總酚含量

b-葡聚糖標準曲線為y=0.012 6x+1.037 6，青稞籽粒提取物b-葡聚糖含量分別為0.22、0.62、2.03 μg/mL，其中1-HVSE提取出的b-葡聚糖含量最低，3-HVSE最高，約為1-HVSE的9倍，2-HVSE的3倍左右。總酚含量測試的標準曲線線性方程為：y=0.004 5x-0.004 2，酚類物質(zhì)含量分別為4.38、4.85、8.88 μg/mL，3-HVSE中總酚含量最高。

2.2 青稞籽粒提取物抗氧化能力檢測

分別用3種抗氧化能力測試方式（FRAP、ABTS、DPPH）檢測青稞籽粒提取物的抗氧化能力，采用酚類物質(zhì)作為陽性對照（以GA當量表示）。結(jié)果如圖2中圖A、B、C所示，3-HVSE抗氧化能力最強、2-HVSE次之、1-HVSE最低。用ABTS、DPPH法檢測不同濃度青稞籽粒提取物的抗氧化能力，如圖2中圖D所示，ABTS檢測法中，3-HVSE抗氧化能力最強，在濃度約為10 mg/mL時，抗氧化能力最高，隨后不變。圖E中DPPH法同樣也檢測出3-HVSE抗氧化能力最強，2-HVSE、1-HVSE抗氧化能力相當。

2.3 青稞籽粒提取物中存在多種抗氧化活性成分

為了驗證總酚含量是否與青稞籽粒提取物呈劑量依賴關(guān)系，檢測不同濃度下的青稞籽粒提取物的總酚含量，結(jié)果如圖3中圖A所示，3種提取物的總酚含量隨濃度增加不斷增大，3-HVSE在各濃度下的總酚含量最高， 2-HVSE次之，1-HVSE最低。在相同濃度的總酚含量下檢測提取物的抗氧化能力，結(jié)果如圖3中圖B～D所示，1-HVSE、3-HVSE的抗氧化能力高于相同量GA。這提示，青稞籽粒提取物的抗氧化能力可能并非僅源于多酚物質(zhì)，還可能蘊含著其他未知的抗氧化成分。

2.4 青稞籽粒提取物LC-MS/MS代謝物分類及抗氧化活性物篩選

為了探究3-HVSE中更多的抗氧化活性成分，采用LC-MS/MS法分析3-HVSE的物質(zhì)成分。青稞籽粒提取物屬于混合物，具體物質(zhì)成分未知，所以選擇2種離子（pos和neg）模式進行代謝物鑒定及分類。結(jié)果如圖4所示pos模式下檢測到的化合物共分為11類，其中占比最高的為脂質(zhì)和類脂分子（36.15%），此中的木脂素、新木脂素及相關(guān)化合物（1.69%）已經(jīng)被證明具有清除體內(nèi)自由基，抗氧化的作用。Neg模式下檢測到的代謝物可分為14類，其中占比最高的為脂質(zhì)和類脂分子（29.91%），同時也檢測到了占比1.03%的木脂素、新木脂素及相關(guān)化合物類物質(zhì)。

LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明，如圖5所示，類黃酮物質(zhì)在正負離子模式中注釋到的種類最多，此結(jié)果驗證了前文中3-HVSE酚類物質(zhì)含量高且抗氧化能力強的結(jié)論。另外，該注釋結(jié)果還表明青稞籽粒提取物中具有其他種類的抗氧化活性物質(zhì)。

對于3-HVSE中檢測到的代謝物，選擇其中相對含量前50的代謝物從高到低進行排序，篩選出23種已知具有抗氧化等功效相關(guān)的物質(zhì)，進行作用、功效的注釋，結(jié)果如表1所示。

3 討論

青稞籽粒中含有豐富的營養(yǎng)成分，如b-葡聚糖、酚類化合物等，具有較高的抗氧化活性[28-29]。為了更充分地提取青稞籽粒中的抗氧化成分，本研究采用3種不同的提取方法對青稞籽粒進行提取。檢測結(jié)果顯示，3-HVSE提取物中b-葡聚糖和總酚含量最高，抗氧化能力也最強，說明醇提法不僅能更有效地提取出青稞的b-葡聚糖和酚類物質(zhì)，而且可能還富集了其他未知的抗氧化活性成分。

為了深入研究3-HVSE中的代謝物，采用LC-MS/ MS技術(shù)對其進行鑒定和分析。分別通過pos、neg模式掃描，共鑒定出25種類型的化合物，包括脂質(zhì)和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環(huán)化合物、苯丙類和聚酮類等。這些化合物中，許多已知具有抗氧化等生理活性。

對3-HVSE中相對含量最高的前50種代謝物進行功能注釋，結(jié)果顯示其中23種被鑒定為具有抗氧化功能的活性物質(zhì)。這說明3-HVSE不僅提取出豐富的b-葡聚糖和酚類化合物，而且還富集了其他類型的抗氧化活性成分。

綜上，醇提法是一種有效提取青稞籽粒中具有抗氧化生理活性成分的方法。LC-MS/MS技術(shù)可以較全面地揭示青稞籽粒提取物中的代謝物組成，為研究青稞營養(yǎng)成分及其生理功能提供參考。同時，鑒定出多種具有抗氧化能力的天然化合物，為青稞在保健品、醫(yī)藥、護膚品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學依據(jù)。今后，可以進一步研究青稞籽粒提取物中主要代謝物的生理活性及其作用機制，以充分發(fā)揮青稞的保健功效。

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