紫外線B（UVB）損傷人皮膚基底膜屏障的分子特征

摘 要 目的：觀察UVB照射引起的基底膜屏障損傷的特征。方法：使用40 mJ/cm2 UVB照射HaCaT細胞，通過RNA-seq數據分析研究基底膜屏障相關基因的表達特征。通過透射電鏡和免疫熒光染色，在3組離體皮膚組織中觀察50 mJ/cm2 UVB連續照射3 d后基底膜結構及關鍵屏障蛋白含量的變化。結果：發現了18個與基底膜相關的基因，其中17個基因表達下調，COL4A4、COL4A5、COL4A6、ITGB1、ITGA3、ITGA4、ITGA6、LAMA5的表達水平下調倍數超過1.5倍（P<0.05），而HPSE的表達上調了2.4倍（P<0.000 1）。在離體皮膚組織實驗中，UVB照射后觀察到基底膜透明層和致密層斷裂，半橋粒破壞，完整性和連續性受損，并且整合素蛋白含量下降（P<0.05）。結論：UVB照射會下調基底膜屏障結構相關基因的表達，上調乙酰肝素酶基因表達，造成基底膜結構紊亂以及基底膜關鍵屏障蛋白降解，使基底膜屏障受損。

關鍵詞 UVB 離體皮膚組織培養 皮膚基底膜損傷

中圖分類號：R339.57； R751 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）11-0037-05

引用本文 楊雅麟， 劉一洲， 王久存， 等. 紫外線B（UVB）損傷人皮膚基底膜屏障的分子特征[J]. 上海醫藥， 2024， 45（11）： 37-41； 56.

Molecular characteristics of human skin basement membrane barrier damaged by ultraviolet B （UVB）

YANG Yalin1，2， LIU Yizhou2， WANG Jiucun2， MA Yanyun2

（1. School of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010021， China； 2. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China）

ABSTRACT Objective： To observe the characteristics of basement membrane barrier damage caused by UVB irradiation in cell models and isolated skin tissues. Methods： HaCaT cells were irradiated with 40 mJ/cm2 UVB， and the expression characteristics of basement membrane barrier-related genes were analyzed by RNA-seq data. In addition， transmission electron microscopy and immunofluorescence staining were used to observe the changes of basement membrane structure and key barrier protein content in three groups of isolated skin tissues after continuous irradiation with 50 mJ/cm2 UVB for 3 days. Results： Eighteen genes related to basement membrane were found， of which the expression of 17 genes were down-regulated. The expression levels of COL4A4， COL4A5， COL4A6， ITGB1， ITGA3， ITGA4， ITGA6 and LAMA5 was down-regulated by more than 1.5 times （P<0.05）， while the expression level of HPSE was up-regulated by 2.4 times （P<0.000 1）. In the in vitro skin tissue experiment， the transparent layer and dense layer of the basement membrane were observed to be broken after UVB irradiation， the hemidesmosomes were destroyed and their integrity and continuity were damaged， and the integrin protein content was decreased （P<0.05）. Conclusion： UVB irradiation can down-regulate the expression of genes related to the structure of the basement membrane barrier， up-regulate the expression of heparanase gene， cause the disorder of the basement membrane structure and the degradation of the key barrier protein of the basement membrane， and damage the basement membrane.

KEY WORDS UVB； in vitro skin tissue culture； skin basement membrane injury

紫外線B（ultraviolet B， UVB）輻射是日常生活中不可避免的環境因素，長期暴露于UVB輻射下會導致皮膚細胞的損傷和炎癥反應[1]，進而引發一系列皮膚問題，包括皮膚老化、皮膚癌和基底膜損傷?；啄な瞧つw中重要的組成部分，由膠原蛋白、整合素和其他基質分子組成。研究發現，UVB輻射可以破壞基底膜結構的完整性，引發基底膜蛋白的降解，進而影響皮膚功能和健康[2]。過去HaCaT細胞、小鼠皮膚和臨床受試者被廣泛應用于對皮膚基底膜研究中，但存在一定局限性。而離體皮膚組織模型具有獨特的優勢和應用前景。首先，相比于細胞，它能夠維持復雜的細胞-細胞相互作用、細胞-基質相互作用以及結構的完整性[3]。其次，相比于小鼠皮膚，其更能反映人類皮膚的特征和反應，這有助于減少物種間差異帶來的不確定性。此外，相對于臨床受試者，可避免對患者或志愿者進行侵入性采樣。

在本研究中，我們采用了一種新穎的方法，通過體外細胞模型與離體皮膚組織模型，克服單一模型的限制，并獲得更貼近真實皮膚環境的研究結果，旨在揭示UVB損傷人體皮膚基底膜屏障的分子特征。

1 材料與方法

1.1 試劑

William培養基（Gibco，美國）；中性通用型組織固定液（塞維爾，中國）； L-谷氨酰胺（上海生工，中國）；熒光封片劑（Southern Biotech，美國）；氫化可的松、牛胰島素（優寧維，中國）；醋酸雙氧鈾（Ted Pella，美國）；電鏡固定液、812包埋劑、鋨酸（百奧斯，中國）。

1.2 儀器

實驗用UVB輻射裝置（自制光源，波長315 nm）；HM325型輪轉式石蠟切片機（MICROM，德國）；包埋機（中威電子儀器，中國）；200目方華膜銅網（中鏡科儀，中國）；透射電子顯微鏡（HITACHI，日本）。

1.3 轉錄組測序分析

取對數生長期HaCaT細胞進行40 mJ/cm2 UVB照射處理，24 h后提取RNA并進行轉錄組測序分析，每組包括3個生物學重復，選取其中與基底膜屏障相關的基因繪制火山圖和蛋白互作圖。

1.4 離體皮膚組織培養及UVB處理

離體皮膚組織為手術切除的新鮮的健康人皮膚組織。將其修剪為1 mm×1 mm小塊，置于穿梭小室中，加入600～800 μL添加生長因子的William完全培養基，使皮膚組織位于氣液界面（真皮浸沒于培養基中，表皮裸露于空氣中），培養1～2 d，觀察組織形態特征，第2～3天開始進行UVB輻射，50 mJ/cm2，連續照射3 d，每次照射前更換新鮮培養基，第3次UVB輻射結束后培養24 h，再分別用電鏡固定液和中性組織固定液進行固定。

1.5 電鏡切片制作

離體皮膚組織放入電鏡固定液（2.5%戊二醛），4 ℃保存，10×PBS洗滌；再放入1%鋨酸固定液，室溫下避光后固定2 h；脫水；滲透包埋；聚合；切片；染色；透射電子顯微鏡下觀察。

1.6 組織免疫學檢測

1.6.1 皮膚組織石蠟包埋與切片制備

離體皮膚組織模型在4%甲醛溶液中固定24 h以上，取出后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、制片。

1.6.2 免疫熒光染色

將切片脫蠟水化、抗原修復、血清封閉、孵育一抗（ITGB1，1∶500；ITGA3，1∶2 000；ITGA6，1∶500）、孵育二抗、染核、封片、光學顯微鏡下觀察，進行組織免疫學檢查。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 基底膜屏障相關基因檢測

本研究通過對UVB處理的HaCaT細胞樣本進行轉錄組測序分析，發現COL4A1、ITGB1、ITGA3、ITGB4、ITGA6、LAMA5、NID1等基底膜基因在UVB照射后總體呈現下調趨勢，而HPSE（乙酰肝素酶）基因在UVB照射后呈現上調趨勢（圖1），結果提示，UVB照射能夠減少Ⅳ型膠原、整合素以及層粘連等基底膜屏障基因表達，其中COL4A4、COL4A5、COL4A6、ITGB1、ITGA3、ITGA4、ITGA6、LAMA5基因下調倍數大于1.5倍（P<0.05），且促進乙酰肝素酶的合成且基因上調倍數為2.4倍（P<0.01），說明UVB照射引起降解基底膜酶的基因表達增加，基底膜屏障相關基因表達減少，對皮膚基底膜屏障造成損傷。

2.2 UVB誘導的離體皮膚組織基底膜結構損傷

通過以上細胞中轉錄水平的結果，進一步在組織中構建基底膜損傷模型，對UVB照射后的皮膚組織進行透射電鏡觀察，結果提示，正常人體皮膚基底膜透明層、致密層呈現出連續、均勻的結構，半橋粒結構完整，錨定纖維排列有序；UVB照射后，透明層、致密層出現明顯斷裂，完整性、連續性受損，半橋粒結構破壞，錨定纖維排列紊亂、稀疏（圖2）。說明UVB照射會引起基底膜結構的破壞，進而改變正常的皮膚結構。

2.3 UVB誘導的離體皮膚組織中整合素蛋白的降解

通過免疫熒光染色觀察UVB照射后組織中關鍵基底膜屏障蛋白的表達量及表達分布，能夠定位皮膚基底膜區域，并且發現UVB照射后皮膚基底膜區域ITGB1、ITGA3、ITGA6蛋白含量減少，分布彌撒，對熒光強度進行量化分析具有統計學差異（P<0.01）（圖3～圖5）。上述結果提示，在離體皮膚組織中UVB照射可以引起皮膚基底膜蛋白表達下降，造成皮膚基底膜損傷。

3 討論

在健康的人體皮膚中，基底膜除了作為一種特殊的支撐結構外，還具有其他多種非常重要的功能。其中基底層細胞中不同類型的整合素受體能夠組成局灶性黏附和半橋粒的一部分，進一步通過多種支架蛋白，調節肌動蛋白和角蛋白的細胞骨架，在細胞與基質黏附中發揮重要功能[4]。牢固的基底層細胞附著和動態調控對維持皮膚自我更新、屏障功能和對應激的響應都至關重[5]。大量研究表明，在皮膚創傷修復過程中，功能完整的表皮的再生依賴于基底膜的準確重建以及隨后的角質形成細胞的分化，而駐留在基底層的表皮干細胞與基底膜相互作用，基底膜介導表皮干細胞的增殖和分化[6]。在強紫外線照射地區，人們的皮膚往往受到不同程度UVB損傷，與非暴露皮膚相比，暴露在陽光下的皮膚會過早老化，其組織學特征為細胞異型、細胞極性喪失、基底膜變扁平和關鍵蛋白減少[7]。此外乙酰肝素酶同樣會被激活并釋放，這些酶能夠降解基底膜中的基質成分，導致基底膜結構的破壞。

本研究通過對體外細胞和組織水平的研究，揭示UVB損傷人皮膚基底膜屏障的分子特征。在細胞層面，我們選用40 mJ/cm2的輻照劑量構建細胞損傷模型。由于HaCaT細胞在體外培養條件下能夠合成包括膠原和整合素在內的多種組成基底膜的細胞外基質成分以及乙酰肝素酶等降解基底膜的蛋白酶，影響皮膚基底膜結構和功能的穩定性[8]，因此本研究利用HaCaT細胞模型進行體外實驗探究UVB照射對皮膚基底膜的影響。首先通過RNA-seq檢測UVB處理后的HaCaT細胞的基因表達情況，發現UVB照射能夠使Ⅳ型膠原和部分整合素等基底膜基因總體呈現下調趨勢，下調倍數超過1.5倍；而與基底膜降解相關的乙酰肝素酶的基因水平升高，上調2.4倍，且均具有顯著性。說明UVB照射在細胞水平能夠抑制基底膜基因的表達。

接下來在組織水平進一步驗證UVB照射會引發皮膚基底膜結構的損傷。本研究運選用50 mJ/cm2的輻照劑量連續照射3 d的離體皮膚組織構建基底膜損傷模型，通過透射電鏡觀察發現，UVB照射后，基底膜透明層、致密層出現明顯斷裂，半橋粒結構改變，錨定纖維排列稀疏，皮膚基底膜的完整性、連續性受損。緊接著又進行組織免疫熒光染色發現，UVB照射后，定位于皮膚基底膜的ITGB1等蛋白的含量減少，并且其分布呈彌散狀態，且有顯著差異。UVB照射對基底膜結構發生了損害。

綜上所述，UVB照射對皮膚基底膜具有損傷作用。Ⅳ型膠原的減少可能導致皮膚基底膜的結構破壞和功能異常，而ITGB1、ITGA3和ITGA6的減少可能影響細胞與基底膜之間的粘附和相互作用[9]。本研究結果提供了關于UVB照射引起皮膚基底膜結構損傷的重要證據，這些發現也為進一步研究皮膚光損傷、皮膚老化以及相關疾病的發生機制提供了新的線索[10]。并且離體皮膚組織模型作為一種新穎的研究工具，在皮膚生物學和相關疾病研究中具有廣闊的應用前景，為深入理解皮膚損傷和疾病提供了新的途徑。

參考文獻

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