lncRNA SNHG 15調控miR-95-3p對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響

[摘要]目的探究長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）核仁小RNA宿主基因15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）調控微RNA95-3p（microRNA95-3p，miR-95-3p）對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響。方法將乳腺癌細胞分為對照組、敲減組、干擾組、共轉染組，體外培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MDA-MB-231。測定SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量；使用噻唑蘭（methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）法檢測乳腺癌細胞增殖能力；流式細胞儀檢測乳腺癌細胞凋亡情況；劃痕試驗檢測乳腺癌細胞遷移能力；Transwell侵襲實驗測定乳腺癌細胞侵襲個數(shù)；采用Westernblot法測定半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）相對表達量。結果與對照組比較，敲減組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量及增殖能力、增殖率、遷移能力、侵襲個數(shù)、Bcl-2蛋白表達下降；凋亡情況、凋亡率、caspase-3、Bax表達升高（P<0.05）。與敲減組、干擾組比較，共轉染組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量及增殖能力、增殖率、遷移能力、侵襲個數(shù)、Bcl-2蛋白表達升高；凋亡情況、凋亡率、caspase-3、Bax表達降低（P<0.05）。與干擾組比較，共轉染組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量及增殖能力、增殖率、遷移能力、侵襲個數(shù)、Bcl-2表達升高，凋亡情況、凋亡率、caspase-3、Bax蛋白表達降低（P<0.05）。結論lncRNASNHG15可通過調控miR-95-3p表達影響乳腺癌細胞的增殖與凋亡，與乳腺癌細胞的發(fā)生、發(fā)展呈正相關。

[關鍵詞]長鏈非編碼核仁小RNA宿主基因15；長鏈非編碼RNA；微小RNA95-3p；乳腺癌；增殖；凋亡

[中圖分類號]R737.9[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.013

EffectoflncRNASNHG15inregulatingmiR-95-3pontheproliferationandapoptosisofbreastcancercells

SUNKaiting，CHIYili

OncologyDepartment，WenzhouHospitalofIntegratedTraditonalChineseandWesternMedicine，Wenzhou325000，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToexploretheeffectoflongnon-codingRNA（longnon-codingRNA，lncRNA）smallRNAhostgene15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）regulatingmicroRNA95-3p（miR-95-3p）onbreastcancercellproliferationandapoptosis.MethodsBreastcancercellsweredividedintocontrolgroup，knockdowngroup，interferencegroupandco-transfectiongroup.HumanbreastcancercelllineMDA-MB-231wasculturedinvitro.MeasuretherelativeexpressionlevelsofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA;Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide（MTT）wasusedtodme5kf1uzPyFZ9rWlD99Xwg==etecttheproliferationabilityofbreastcancercells;Theapoptosisofbreastcancercellswasdetectedbyflowcytometry;Themigrationabilityofbreastcancercellswasdetectedbyscratchtest;Transwellinvasiontestwasusedtomeasurethenumberofbreastcancercellsinvaded;Westernblotwasusedtodeterminetherelativeexpressionlevelsofcaspase-3，B-celllymphoma-2（Bcl-2），andBcl-2associatedXprotein（Bax）.ResultsComparedwithcontrolgroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationability，proliferationrate，migrationability，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionweredecreased，buttheapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionwereincreasedinknockdowngroup（P<0.05）.Comparedwithknockdowngroupandinterferencegroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationcapacity，proliferationrate，migrationcapacity，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionwereincreased，butapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionweredecreasedinco-transfectiongroup（P<0.05）.Comparedwithinterferencegroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationability，proliferationrate，migrationability，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionwereincreased，butapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionweredecreasedinco-transfectiongroup（P<0.05）.ConclusionlncRNASNHG15canaffecttheproliferationandapoptosisofbreastcancercellsbyregulatingmiR-95-3pexpression，andispositivelyassociatedwiththeoccurrenceanddevelopmentofbreastcancercells.

[Keywords]Longnon-codingnucleolarsmallRNAhostgene15;Longnon-codingRNA;microRNA95-3p;Breastcancer;Proliferation;Apoptosi

乳腺癌是女性腫瘤中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，為現(xiàn)階段嚴重威脅女性生命安全的疾病之一，因此，尋求治療乳腺癌的有效靶點非常重要[1]。長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）核仁小RNA宿主基因15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài)，具有一定的促癌作用，但目前對其在乳腺癌中的表達研究較少[2]。miRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的微小單鏈RNA，通過轉錄調控基因表達[3]。研究表明miRNA對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用，微RNA95-3p（microRNA95-3p，miR-95-3p）在乳腺癌中呈高表達狀態(tài)，具有促癌作用[4]。隨著患者病情的加重，miR-95-3p表達量增高，下調表達后，可使瘤細胞的增殖侵襲能力下降，調控凋亡情況，但具體機制尚未明確[5]。基于此，本文將研究lncRNASNHG15調控miR-95-3p對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自美國ATCC細胞庫。本研究經溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：2023-L087）。

1.1.2實驗試劑SNHG15抑制劑、SNHG15、miR-95-3p轉染試劑購自南通百奧邁科生物技術有限公司（批號：210823、220114、211216）；胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、Lipofectamine2000試劑盒、噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號：201225、211118、210412）；TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒購自上海恒遠生物有限公司（批號：220826、210925）；結晶紫染色液購自廈門海標科技有限公司（批號：211125）；Matrigel凝膠購自上海鈺博生物科技有限公司（批號：220112）；BCA蛋白定量試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號：211215）；半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗體、標記的免疫球蛋白（immunoglobulinG，IgG）購自美國GeneCopoeia公司（批號：210817、221105、201214、191214）。

1.1.3儀器設備CO2培養(yǎng)箱購自松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；流式細胞儀購自常州必達科生物科技有限公司；PCR儀購自北京中西華達科技有限公司；光學顯微鏡購自上海廣密公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)分組轉染方法將人乳腺癌細胞系MDA-MB-231復蘇后，放置于含有10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，需在37℃、95%濕度飽和、5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。當MDA-MB-231進入對數(shù)生長期時，將其接種于6孔板內，觀察細胞匯合度達到70%進行質粒轉染。轉染過程需嚴格按照Lipofectamine2000試劑盒說明書操作，轉染過程中將其分為對照組、敲減組、干擾組、共轉染組。對照組采用si-NC轉染，敲減組采用si-SNHG15抑制劑轉染，干擾組采用anti-NC+miR-95-3p轉染，共轉染組采用si-SNHG15+miR-95-3p轉染。各組轉染后進行24h的培養(yǎng)。后續(xù)所有試驗均重復3次，取均值。

1.2.2SNHG15、miR-95-3pmRNA相對表達量檢測使用TRIzol試劑盒提取MDA-MB-231細胞總RNA，采用紫外分光光度法檢測提取后的總RNA濃度，檢查RNA完整性，將總RNA通過逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，得到cRNA，進行定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreaction，qRT-PCR）試驗，將Rox、ddH2O、p1、p2、cRNA加入孔內，稀釋cRNA，置于PCR儀，上機檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）為內參采用2-ΔΔCt方法計算SNHG15、miR-95-3p相對表達量。

1.2.3檢測MDA-MB-231增殖能力MDA-MB-231細胞穩(wěn)定轉染后，使用MTT法進行檢測，按照密度2×104個/ml放置于96孔板內，將細胞懸液接種于孔內，在CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h時間點，在孔內加入MTT溶液培養(yǎng)4h后，使用DMSO進行顯色，觀察在波長450nm處的吸光度（opticaldensity，OD）值，以此判斷細胞的增殖能力。細胞增殖率=（早期細胞增殖數(shù)+晚期細胞增殖數(shù)）/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4檢測MDA-MB-231凋亡情況MDA-MB-231細胞穩(wěn)定轉染后，采用流式細胞儀于24h、48h、72h時間點檢測MDA-MB-231細胞凋亡情況，使用4%多聚甲醛固定MDA-MB-231細胞1h，在37℃條件下，于H2O2中孵育30min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗滌，離心后進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度，加入緩沖液、碘化丙啶（propyliodide，PI）、熒光異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）與膜聯(lián)蛋白V（annexinV）標記后取細胞懸液，在搖床上避光孵育20min，上機檢測。細胞凋亡率=（早期細胞凋亡數(shù)+晚期細胞凋亡數(shù)）/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5檢測MDA-MB-231遷移能力MDA-MB-231細胞穩(wěn)定轉染后，通過劃痕試驗檢測其遷移能力。在6孔板內，取2×103個細胞培養(yǎng)過夜，移液槍垂直劃線，沖洗，分別培養(yǎng)0h、24h取出，觀察劃痕愈合狀態(tài)，在顯微鏡下觀察并計算細胞遷移數(shù)值。

1.2.6檢測MDA-MB-231侵襲個數(shù)MDA-MB-231細胞穩(wěn)定轉染后，進行Transwell侵襲實驗。在每個Transwell小室底面均勻涂抹纖維連接蛋白，固化。將MDA-MB-231細胞在4℃條件下，于CO2培養(yǎng)箱內Matrigel凝膠過夜，在上、下室分別加入細胞懸液、10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內恒溫培養(yǎng)24h，將Transwell小室取出，使用PBS進行清洗，放入乙醇溶液中固定，結晶紫染色液中染色，拭去濾膜上層細胞后在顯微鏡下觀察。

1.2.7測定caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量MDA-MB-231細胞穩(wěn)定轉染后，使用Westernblot法檢測caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量。使用裂解液進行裂解，分離蛋白后，用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經變性后轉膜，封閉，加入稀釋后的一抗，在4℃條件下，孵育過夜；加入二抗，孵育1h；使用增強化學發(fā)光法（enhancedchemiluminescence，ECL）發(fā)光顯影，檢測蛋白；以GAPDH為參照，計算蛋白表達量。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。用Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間兩兩比較采用獨立t檢驗，計量資料多組間比較采用F檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量比較

與對照組相比，敲減組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量降低，干擾組、共轉染組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2各組MDA-MB-231增殖能力比較

與對照組相比，敲減組增殖能力降低，干擾組、共轉染組增殖能力升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組增殖能力升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2；各組細胞的增殖情況見圖1。

2.3各組MDA-MB-231細胞凋亡情況比較

與對照組相比，敲減組MDA-MB-231細胞凋亡數(shù)升高，干擾組、共轉染組凋亡數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組凋亡數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3；各組細胞凋亡情況見圖2。

2.4各組MDA-MB-231細胞增殖率、凋亡率比較

與對照組相比，敲減組MDA-MB-231細胞增殖率降低，凋亡率升高，干擾組、共轉染組增殖率升高，凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組增殖率升高，凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4；各組細胞增殖、凋亡情況比較見圖3。

2.5各組MDA-MB-231細胞遷移、侵襲能力比較

與對照組相比，敲減組MDA-MB-231細胞遷移、侵襲個數(shù)降低，干擾組、共轉染組遷移、侵襲個數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組MDA-MB-231細胞遷移、侵襲個數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表5；各組細胞遷移、侵襲能力比較見圖4。

2.6各組MDA-MB-231線粒體凋亡蛋白表達比較

與對照組相比，敲減組caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，干擾組、共轉染組caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與敲減組、干擾組相比，共轉染組caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表6、圖5。

3討論

乳腺癌是女性第一高發(fā)惡性腫瘤，隨著生活水平的提高，其發(fā)病率逐年提高，其發(fā)生誘因多認為與基因、家族等因素有關[6]。但目前尚未明確影響其發(fā)展的分子機制，由于對理解乳腺癌的發(fā)生不夠全面，臨床治療效果并不理想[7]。現(xiàn)已證實lncRNASNHG15與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，在多種惡性腫瘤中表達異常，如結直腸癌、肺癌、乳腺癌等[8]。本研究認為lncRNASNHG15可能在乳腺癌中具有重要作用，但具體機制尚未闡明，因此，本文通過研究lncRNASNHG15調控miR-95-3p觀察對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，以便對乳腺癌防治進行更有效的臨床指導，控制乳腺癌的復發(fā)率、致死率，提高預后效果。

目前miR-95-3p在腫瘤中的研究較少，但miR-95-3p在多種惡性腫瘤中表達處于異常狀態(tài)[9]。miR-95-3p在乳腺癌機體內屬于促癌因子，其表達增強可顯著提高癌細胞的增殖轉移，減少凋亡，增強癌細胞周期的發(fā)展[10]。在機體產生癌變時，miR-95-3p可對癌細胞的增長與凋亡進行調控，加快癌細胞的發(fā)展速度[11]。本研究進一步探究lncRNASNHG15對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，結果顯示SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相對表達量出現(xiàn)上調，且對SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA的表達進行分組可知，抑制lncRNASNHG15含量，SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA表達均降低，上調lncRNASNHG15、miR-95-3p，其蛋白含量顯著升高。本研究與岳成旭等[12]研究結果一致，表明抑制lncRNASNHG15可降低乳腺癌細胞的增殖能力，促進其凋亡發(fā)生。

相關研究指出，lncRNASNHG15可能在轉錄后發(fā)揮調控作用，通過影響下游基因表達，影響癌細胞的增殖與凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNASNHG15與miR-95-3p存在明顯的正相關關系，干擾lncRNASNHG15表達后，可顯著降低miR-95-3p表達，降低增殖能力，加快癌細胞凋亡；提高lncRNASNHG15、miR-95-3p表達水平，可顯著提高乳腺癌細胞增殖率，降低癌細胞凋亡率。由此得出，lncRNASNHG15可能存在對乳腺癌細胞增殖、凋亡的調控，可達到相關研究治療效果[14]。本研究還證實通過控制lncRNASNHG15、miR-95-3p表達水平可有效調控癌細胞的侵襲、轉移，lncRNASNHG15水平降低，乳腺癌細胞遷移能力降低、侵襲個數(shù)減少；lncRNASNHG15水平升高，其遷移能力升高、侵襲個數(shù)增多。在lncRNASNHG15高水平情況下，miR-95-3p含量也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[15]。

caspase-3、Bax、Bcl-2參與癌細胞凋亡過程并發(fā)揮關鍵作用[16]。caspase-3表達水平升高可促進癌細胞凋亡[17]；Bax促進癌細胞凋亡，Bcl-2抑制癌細胞凋亡，二者對癌細胞的生存發(fā)展具有重要作用[18-19]。研究結果顯示caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白在乳腺癌細胞中均呈現(xiàn)異常狀態(tài)，敲減lncRNASNHG15水平可明顯提高caspase-3、Bcl-2水平，降低Bax水平，加快癌細胞凋亡；提高lncRNASNHG15水平可導致caspase-3、Bcl-2水平降低，Bax水平升高，降低癌細胞凋亡，使癌細胞得以發(fā)展。本研究與吳坤琳等[20]研究具有一致性，表明caspase-3、Bax、Bcl-2可對乳腺癌細胞的增殖、凋亡產生重要影響。

綜上，lncRNASNHG15通過調控miR-95-3p表達對乳腺癌細胞的增殖、凋亡產生影響，敲減lncRNASNHG15可降低乳腺癌細胞增殖能力、提高凋亡率，明確lncRNASNHG15、miR-95-3p與癌細胞的正相關關系，可進一步明確lncRNASNHG15在乳腺癌細胞中的作用，為臨床治療乳腺癌提供一定依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–12–01）

（修回日期：2024–07–08）