腦靶向麻醉雙藥納米體系的制備及性質研究

[摘要]目的構建一種丙泊酚-羥丁酸鈉腦靶向麻醉雙藥納米體系（lactoferrin-modifiedbrain-targetedpropofol-sodiumhydroxybutyratedual-anestheticsstarchnanocomposite，Lf-SNPs），評估其腦靶向、麻醉增效的性能。方法本研究選擇天然淀粉作為納米材料，乳鐵蛋白作為腦靶向蛋白，采用反相乳液法制備腦靶向納米體系，分別通過疏水作用力、靜電作用力實現麻醉藥丙泊酚、羥丁酸鈉的聯合負載及腦內靶向遞送，測定其粒徑、電位、體內分布；將20只C57BL/6小鼠隨機分為對照組（同濃度混合藥物）和Lf-SNPs組，每組各10只，通過尾靜脈給藥記錄小鼠的鎮靜催眠持續時間，評估其麻醉藥效性能。結果Lf-SNPs粒徑（330.6±22.6）nm，平均電位（–23.4±0.5）mV，靜脈給藥30s即可見腦內分布，3min時達峰值，可持續分布達30min，單次注藥鎮靜催眠持續時間（38.7±5.9）min，較對照組明顯延長（P<0.05），可增強麻醉效果。結論Lf-SNPs具有丙泊酚、羥丁酸鈉聯合負載能力，可實現腦內靶向遞送，增強麻醉藥效。

[關鍵詞]丙泊酚；羥丁酸鈉；腦靶向；納米體系；淀粉

[中圖分類號]R914.2[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.025

Studiesonpreparationandproperties?;ofbrain-targeteddual-anestheticsnanocomposites

GAOYuan1，2，MAJiahai1

1.DepartmentofAnesthesiology，YantaiYuhuangdingHospital，Yantai264000，Shandong，China;2.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，Shaanxi，China

[Abstract]ObjectiveToconstructalactoferrin-modifiedbrain-targetedpropofol-sodiumhydroxybutyratedual-anestheticsstarchnanocomposite（Lf-SNPs）andevaluateitsbraintargetingandoptimizedanestheticproperty.MethodsInthisstudy，naturalstarchwasselectedasthenanomaterial，lactoferrinasthebraintargetingprotein，andLf-SNPswaspreparedbyinvertedphaseemulsionmethod.Thedual-loadingandbrain-targeteddeliveryofpropofolandsodiumhydroxybutyratewereachievedbyhydrophobicandelectrostaticforces，respectively.Lf-SNPs’particlesize，potential，distributioninvivoweremeasured.&nbsp;TwentyC57BL/6micewererandomlydividedintotwogroups：Controlgroup（sameconcentrationofmixedanesthetics）andLf-SNPsgroup，with10miceineachgroup.Thedurationofanestheticefficacywasrecordedaftercaudalveinadministration.ResultsTheLf-SNPshadaparticlesizeof（330.6±22.6）nmandaveragepotentialof（–23.4±0.5）mV，respectively.ThedistributionofLf-SNPsinthebrainwasvisible30safterintravenousadministration，thereachingpeakat3min，andsustainabledistributingfor30min.Thedurationofanestheticefficacyofsinglebolusinfusionwas（38.7±5.9）min，whichwassignificantlylongerthanthatofthesameconcentrationofcontrolgroup（P<0.05）.ConclusionLf-SNPshasthedual-loadingcapacityofpropofolandsodiumhydroxybutyrate，whichcanrealizethetargeteddeliveryinbrainandenhancetheanestheticeffect.

[Keywords]Propofol;Sodiumhydroxybutyrate;Brain-targeted;Nanocomposites;Starch

麻醉藥物廣泛用于麻醉及重癥監護，然而目前臨床常用的麻醉藥藥效不盡如人意，且其制劑多伴隨各種副作用，難以滿足日益增長的臨床應用需求，因此探索研發新型麻醉藥物制劑具有重要意義。丙泊酚雖然起效、恢復迅速，易于靶控輸注，但因其脂溶性強，應用時常需配制成脂肪乳劑，這可能誘發高脂血癥、變態反應等副作用，且易引起呼吸、循環抑制，具有一定的臨床用藥風險[1]。羥丁酸鈉作為唯一的天然麻醉藥，可模仿γ-氨基丁酸產生類似生理性睡眠，具有對呼吸、循環抑制小等優點，然而因其水溶性好，血-腦脊液屏障（bloodbrainbarrier，BBB）通透性差，存在用量大、起效慢、恢復時間長等不足，目前主要用于治療睡眠障礙[2]。丙泊酚和羥丁酸鈉可分別刺激中樞神經系統γ-氨基丁酸受體的不同亞基，抑制沖動傳遞，但兩者難以同時入腦而發揮藥效，若能實現腦內聯合遞送，就可聯合兩種藥物的優勢，發揮起效迅速、增強藥效、減少藥物用量和副作用、產生類似生理性睡眠的鎮靜催眠效果，使患者在術中保持安全、平穩的麻醉狀態。腦靶向納米載藥體系為改良麻醉藥物腦內遞送提供新的策略，因此本研究選擇生物相容性高的天然淀粉作為納米材料，乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）作為腦靶向蛋白，擬構建一種丙泊酚-羥丁酸鈉腦靶向麻醉雙藥納米體系（lactoferrin-modifiedbrain-targetedpropofol-sodiumhydroxybutyratedual-anestheticsstarchnanocomposite，Lf-SNPs），實現麻醉藥丙泊酚、羥丁酸鈉的聯合負載及腦內遞送，并對其腦靶向、麻醉增效的性能進行評估。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑

動物SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體質量（20±2）g；健康雄性裸鼠，體質量（18±2）g，均購自西安交通大學，實驗動物生產許可證號為：SYXK（陜）2020-005。羥丁酸鈉注射液（批準文號：國藥準字H20054750，生產單位：西安漢豐藥業有限責任公司，規格：10ml：2.5g）；Lf（批準文號：Sigma-61326，生產單位：美國Sigma-Aldrich公司，濃度≥85%，規格：10mg）；丙泊酚（批準文號：D106369，生產單位：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，濃度≥98%，規格：5g）；玉米淀粉、乙酸酐、二甲亞砜、液體石蠟、環氧氯丙烷、司班60（Span60）、1-甲基咪唑、氫氧化鈉、冰醋酸、2，3-環氧丙基-三甲基氯化銨、透明質酸（hyaluronicacid，HA）、Cy5、IR780、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）均購自中國醫藥基團上海化學試劑公司。

1.2方法

1.2.1分組將20只C57BL/6小鼠正常喂養7d后隨機分為對照組和Lf-SNPs組，其中對照組為同濃度混合藥物組，每組10只。20只裸鼠分組同上。

1.2.2Lf-SNPs的制備2mg/mlHA溶液中加入5mgLf，加入EDC、NHS反應、透析，制備腦靶向外殼（Lf-HA）。0.03g/ml玉米淀粉溶液中加入0.75ml2，3-環氧丙基-三甲基氯化銨反應4h，制備陽離子淀粉。采用反相乳液法將20mg/ml陽離子淀粉溶液水相緩慢滴入5mg/mlSpan60油相中，加入15μl環氧氯丙烷交聯，常溫反應4h制備淀粉納米顆粒（starchnanoparticles，SNPs）[3-4]。按照體積比1∶100將羥丁酸鈉、丙泊酚滴入上述體系中，按體積比0.3∶1.0混合液滴入Lf-HA溶液中制備Lf-SNPs。

1.2.3淀粉負載麻醉雙藥預測分子模擬：采用Gromacs5.1.1分子動力學模擬軟件構建丙泊酚、羥丁酸鈉和淀粉分子，使用Gromos54a7生物大分子模擬力場和SPC水分子力場進行分子模擬，保持溫度在300K（26.8℃），壓力為1.0bar（0.1MPa）。將一個淀粉分子置于一個7nm×7nm×7nm的模擬盒中，將300個羥丁酸鈉或丙泊酚分子充盈在整個模擬盒中，進行100ns（1ns=10-9s）模擬，測定淀粉分子與藥物分子間蘭納-瓊斯勢（Lennard-Jonespotential，L·J勢）變化，預測淀粉是否可實現兩種藥物的負載。

電荷模擬：5mg/ml的陽離子淀粉中按質量比1∶1加入羥丁酸鈉攪拌30min，測定加入前后陽離子淀粉的Zeta電位變化。

1.2.4Lf-SNPs理化性能測定采用馬爾文粒度儀測定Lf-SNPs的粒徑、Zeta電位；采用透射電鏡觀察Lf-SNPs的粒徑、分散性和穩定性；通過比表面積分析儀測量SNPs的比表面積。

1.2.5Lf-SNPs腦靶向性能測定近紅外熒光染料Cy5、IR780的理化性質分別與羥丁酸鈉、丙泊酚相似，在本研究中分別代表麻醉藥羥丁酸鈉、丙泊酚進行體內靶向成像。按上述方法使Lf-SNPs負載近紅外染料Cy5及IR780，裸鼠尾靜脈注射后采用近紅外小動物活體成像系統觀察給藥后不同時間點的腦內分布情況。

1.2.6Lf-SNPs藥效評估尾靜脈單次注射Lf-SNPs，記錄翻正反射消失、持續時間。翻正反射消失視為反映麻醉藥物起效的客觀指標，表現為給藥后小鼠仰臥30s內不能恢復正常體位。翻正反射消失持續時間為翻正反射消失至翻正反射恢復的間隔時間[5]。

1.3統計學方法

采用SPSS25.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（）表示，各組之間的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1淀粉負載麻醉雙藥預測

圖1A、圖1D分別為丙泊酚、羥丁酸鈉分子的三維化學結構。淀粉分子呈螺旋結構，丙泊酚分子廣泛分布于淀粉螺旋的內、外部，見圖1B；而羥丁酸鈉分子僅隨機分散在淀粉分子的外壁周圍，無法進入淀粉螺旋內部，見圖1E。丙泊酚與淀粉模擬其L·J勢能增加，而羥丁酸鈉幾乎無勢能變化，與上述結果相符，見圖1C。以上結果表明淀粉螺旋具有包裹丙泊酚的潛力，而難以實現羥丁酸鈉的負載。因此有必要對淀粉進行改性修飾，豐富淀粉功能性，才有可能實現以上兩種藥物同時負載。陽離子淀粉加入羥丁酸鈉后其電位由（19.8±0.9）mV變為（9.3±0.3）mV，電位明顯降低（P<0.05），說明陽離子淀粉可與羥丁酸鈉靜電吸附結合，有望實現麻醉雙藥的負載，見圖1F。

2.2Lf-SNPs的理化性能測定

電鏡下觀察Lf-SNPs外形呈殼-核結構，形態多為規則的類球型，腦靶向外殼Lf-HA的厚度為（88.0±13.2）nm，見圖2A；其粒徑為（330.6±22.6）nm，表面電位為（–23.4±0.5）mV，見圖2B。Lf-SNPs的比表面積為110.6m2/g，約為普通淀粉的5倍，具有較大的表面積，可為負載麻醉雙藥提供較廣闊的空間，見圖2C。此外，Lf-SNPs的多分散系數為（0.08±0.03），分散性良好，常溫下放置30d內粒徑變化較小，具有較好的穩定性，見圖2D。

2.3Lf-SNPs的腦靶向性能測定

與對照組比較，Lf-SNPs給藥30s即出現腦內Cy5、IR780熒光分布，3min時達到峰值，并可持續30min腦內分布，具有腦組織特異性靶向性能，可應用于腦內藥物遞送，見圖3。

2.4Lf-SNPs的藥效評估

對照組的翻正反射消失持續時間為（13.6±1.8）min，Lf-SNPs組為（38.7±5.9）min，麻醉持續時間較對照組明顯延長（P<0.05）；說明Lf-SNPs可延長丙泊酚和羥丁酸鈉聯用的持續時間，提高麻醉效果。

3討論

隨著現代社會的發展和中國醫療體系的逐漸完善，民眾對舒適化麻醉的需求越來越高，這對麻醉醫生提出新的挑戰，亟需研發藥效理想、安全、毒副作用少的新型麻醉藥，以滿足不同手術麻醉的需要。目前，麻醉新藥研發受到廣泛關注，劉進團隊研發的“超長效局麻藥”專利成功實現臨床轉化，此外還有艾司氯胺酮、甲苯磺酸瑞馬唑侖等新藥逐步上市[6-7]。然而，當前麻醉新藥技術迭代慢，研發、生產及臨床推廣均需要很長的生命周期，大部分麻醉醫生不易改變用藥習慣且存在價格昂貴、用藥謹慎等劣勢，這些情況均導致難以滿足臨床一線的麻醉需求。雖然目前臨床常用的麻醉藥物各有優、缺點，但如果聯合各麻醉藥的優勢，或可規避混合用藥的劣勢，發揮較理想的麻醉效果[8]。因此，本研究選擇丙泊酚、羥丁酸鈉為代表，實現麻醉雙藥的腦內靶向輸送，綜合丙泊酚起效快及羥丁酸鈉似生理性睡眠的優勢，減少用量和副作用，有望提供舒適化的麻醉狀態。

腦靶向納米載藥體系是一種新型的藥物載體，通過負載藥物并連接靶向BBB表面受體的相應配體，可實現腦部靶向藥物遞送，提高腦組織內藥物濃度、藥物利用率，提高藥效的同時又可減少藥物用量、降低不良反應發生率，是目前藥物腦內輸送研究的主要方向之一[9-10]。其中，腦靶向雙藥納米載藥體系在腦膠質瘤、阿爾茨海默癥等疾病治療方面進行廣泛探索，實現治療雙藥的腦內遞送及病灶部位的富集，如小干擾RNA與抗腫瘤藥物聯合遞送，可有效提高協同治療效果[11-12]。Lf作為一種腦靶向配體，其受體在BBB上有一定程度的表達且不易受內源性Lf的干擾，Lf修飾的納米載體可跨越BBB，顯著提高腦內納米載體的濃度[13-14]。淀粉來源于多種植物，天然無毒，含有較多羥基，具有靈活的化學修飾性、黏附性、增強吸收性、生物相容性等理化和生物特性，且淀粉納米顆粒制備方式簡便，可由天然淀粉經酸或酶解合成，廣泛應用于生物醫藥領域，可作為各種藥物的理想載體[15-16]。此外，淀粉納米顆粒的多孔化學修飾可增大比表面積，提高吸附性，增加藥物負載率[17]。前期研究以淀粉為納米載體材料，依賴淀粉自身的疏水螺旋結構，通過疏水作用力負載丙泊酚，制備丙泊酚-丙酸酯淀粉納米螺旋載體，可靶向BBB表面的脂質成分，實現丙泊酚腦內靶向輸送[18]。在此基礎上，本研究選擇淀粉為藥物載體材料，Lf為腦靶向蛋白，采用分子模擬預測、指導淀粉化學修飾負載麻醉雙藥丙泊酚、羥丁酸鈉，構建Lf-SNPs實現腦內靶向遞送。

分子模擬是一種依靠牛頓力學模擬分子體系運動的新型計算方法，通過觀察分子間相互作用揭示事物的客觀規律，逐漸被用于觀察納米載藥體系的自組裝過程[19]。其L·J勢能可反映分子間相互作用勢能，數值越大結構越穩定。本研究通過該技術對淀粉負載麻醉雙藥進行預測，丙泊酚與淀粉相互作用其L·J勢能增加，提示淀粉螺旋具有包裹丙泊酚的潛力；而羥丁酸鈉則無明顯變化，可能因其分子量小、且疏水性極差，難以進入淀粉螺旋空腔的疏水環境所致。本研究進一步對羥丁酸鈉的負載進行不斷嘗試，利用羥丁酸鈉可解離釋放Na+、剩余游離羧基的特性，通過靜電作用力與陽離子淀粉結合，實現丙泊酚、羥丁酸鈉兩種麻醉藥物的同時負載。

本研究制備的Lf-SNPs形態較規則，通過交聯修飾增加表面孔隙，使其具有體積小、表面積大的優點，可提高藥物的吸附率。其良好的生物相容性、分散性、表面負電性可避免被體內免疫系統的識別吞噬，延長體內循環時間，從而提高腦內蓄積濃度。在體內輸送過程中，可與BBB表面的Lf受體特異性結合，由其介導的跨BBB轉運實現腦內靶向輸送，給藥30s即可見腦內分布，3min達峰值，持續存在30min，單次注藥鎮靜催眠持續時間（38.7±5.9）min，較同濃度混合對照組明顯延長，具有起效迅速、維持時間長等優點，可綜合丙泊酚、羥丁酸鈉的麻醉優勢，提供較為安全、理想的麻醉效果。

綜上所述，本研究初步證明Lf-SNPs具有腦靶向輸送和麻醉增效性能，具有潛在發展前景，可為麻醉新藥研發提供可行的思路及發展方向，其具體的麻醉協同、靶向性的機制研究仍需基礎動物實驗研究進一步闡明。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–03–20）

（修回日期：2024–07–09）