枸櫞酸鐵銨對小鼠黑質多巴胺能神經元電活動影響

［摘要］目的探討枸櫞酸鐵銨（FAC）對小鼠黑質多巴胺能神經元電活動影響。方法取出生15～20 d的C57BL/6小鼠制備腦片，應用全細胞膜片鉗技術觀察FAC對黑質多巴胺能神經元自發放電活動及膜電位的影響。結果小鼠黑質腦片置于FAC溶液（100 μmol/L）中5 min后，多巴胺能神經元自發放電頻率明顯降低（t=5.533，P＜0.01）。10 min后，多巴胺能神經元自發放電頻率則顯著減慢（t=7.297，P＜0.001）。神經元膜電位明顯向超級化方向移動（t=4.227，P＜0.01）。結論FAC能夠抑制正常小鼠黑質多巴胺能神經元的電活動。

［關鍵詞］帕金森病；鐵；多巴胺能神經元；膜片鉗術；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號］R742.5；R591.1［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0341-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.044［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240419.1405.001;2024-04-2309：35：52

Effect of ferric ammonium citrate on the electricalactivity of dopaminergic neurons in the substantia ingra of mice XIE Ruyi， XIU Minxia， SHI Limin（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on the electrical activity of dopaminergic neurons in the substantia nigra of mice.MethodsBrain slices were prepared from the C57BL/6 mice of 15-20 days of postnatal age， and the whole-cell patch clamp technique was used to observe the effect of FAC on the spontaneous discharge and membrane potential of substantia nigra dopaminergic neurons. ResultsAfter the brain slices of the substantia nigra of mice infiltrated with 100 μmol/L FAC solution for 5 minutes， there was a significant reduction in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons （t=5.533，Plt;0.01）， and after 10 minutes， there was a significant reduction in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons （t=7.297，Plt;0.001）. The neuronal membrane potential moved towards hyperpolarization （t=4.227，Plt;0.01）. ConclusionFAC can inhibit the electrical activity of dopaminergic neurons in the substantia nigra of normal C57BL/6 mice.

［Key words］Parkinson disease; iron; dopaminergic neurons; patch-clamp techniques; mice， inbred C57BL

帕金森病（PD）是一種常見的中老年神經系統退行性疾病。其顯著病理學特征為中腦黑質致密帶多巴胺能神經元進行性缺失、紋狀體區多巴胺含量相應減少、鐵沉積等[1-2]。臨床尸檢結果證實，PD病人黑質鐵含量升高了30%～35%[3-4]。隨后大量影像學及生化分析、核磁共振技術等研究也證實了此結果[5-7]。PD病人黑質中的鐵負荷與運動障礙呈正相關[8-9]。鐵離子超負載可以促進羥基自由基、超氧陰離子的形成，引起脂質過氧化等[10-12]。多巴胺能神經元在正常生理情況下具有規則的自發放電活動[13]，在運動調控中發揮重要作用[14-16]。因此，闡明鐵對多巴胺能神經元電活動的影響至關重要。本實驗從電生理的角度出發，旨在探討急性灌流枸櫞酸鐵銨（FAC）對黑質多巴胺能神經元自發放電活動及膜電位的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物出生15～20 d的C57BL/6小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。小鼠飼養于25 ℃、12 h晝夜循環光照的SPF級清潔環境中，可自由飲水、攝食和活動。動物實驗通過青島大學醫學部實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2實驗試劑及其配制①FAC溶液配制：將FAC（由美國Sigma公司提供）使用三蒸水配制成10 mmol/L的儲存液，置于4 ℃下保存。在應用前稀釋至100 μmol/L[17]。②人工腦脊液（ACSF）的配制：為含有124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、2.4 mmol/L CaCl2、1.3 mmol/L MgCl2、1.3 mmol/L NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3和10.0 mmol/L葡萄糖混合溶液，調整pH值為7.4（用1 mol/L的NaOH稀釋）、溶液滲透量濃度為310 mmol/L。③低鈣切片液的配制：為含有124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、0.5 mmol/L CaCl2、1.0 mmol/L的MgCl2、1.3 mmol/L的NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3和10.0 mmol/L 葡萄糖混合溶液，調整pH值為7.4（用1 mol/L NaOH稀釋）、滲透量濃度為310 mmol/L，并持續注入體積分數0.05 CO2與體積分數0.95 O2的混合氣體進行氧合（切片液需提前放入冰箱-80 ℃冷凍40 min，成冰沙狀）。④電極內液的配制：為含有120.0 mmol/L 葡萄糖酸鉀、10.0 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、10.0 mmol/L的C14H24N2O10、2.0 mmol/L MgCl2、2.0 mmol/L Na2ATP、0.3 mmol/L Na2GTP和20.0 mmol/L KCl混合溶液，調整pH值為7.3（用1 mol/L KOH稀釋）、滲透量濃度為290 mmol/L，-20 ℃分裝保存備用。

1.2實驗方法

1.2.1離體黑質腦片制備小鼠迅速斷頭取腦，置于ACSF冰水混合物中，1 min后將修剪好的腦組織切成250 μm厚度的腦切片，轉移至連續通入含體積分數0.95 O2及體積分數0.05 CO2混合氣體的ACSF中，孵育1 h，隨后將腦片于室溫下放置。每次隨機取其中1片進行腦片全細胞膜片鉗實驗，其余腦片依然培養在ACSF中，以備后續實驗。

1.2.2腦片全細胞膜片鉗電生理學記錄將離體腦片轉移至持續灌流ACSF（持續通入體積分數0.95 O2及體積分數0.05 CO2的混合氣體）的浴槽內，首先在低倍光鏡下找到黑質區域，然后轉換到高倍光鏡下選擇健康、飽滿、邊界清晰的細胞進行全細胞膜片鉗電生理學記錄。選定細胞后，將拋光的玻璃微電極注入1/3～1/2的電極內液，去除其中的氣泡，微加正壓于電極后端，避免電極尖端沾染雜質。直至電極尖端進入液面以下，使電極尖端慢慢接近細胞表面直至在細胞表面壓出類似“酒窩”的形狀，此時電流變小，電阻慢慢變大。迅速釋放正壓，快速達到1 kΩ封接。如果電阻沒有達到1 kΩ，則可以通過注射器給予細胞膜片一個負壓，使之完成封接，此時補償快電容。之后，采用負壓法打破電極腔正下方的膜片，使電極與細胞內液相通，此時補償慢電容。轉換鉗制模式至電流鉗模式，將電流鉗置于0 pA，判斷為黑質多巴胺能神經元后，記錄細胞的自發放電活動與膜電位。實驗數據用Patchmaster軟件采集并儲存，用Minianalysis、Clamfit等軟件進行分析。

1.3統計學分析

應用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 5統計軟件進行數據處理。計量資料數據以±s形式表示，兩組均數比較采用配對t檢驗。以Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1FAC對黑質多巴胺能神經元自發放電影響

參考本實驗室之前的研究方法確定多巴胺能神經元[18]：位于中腦腹側邊緣；細胞一般呈紡錘或三角形，胞體較大，直徑大于25 μm；在電流鉗模式下，給予神經元-100 pA的超極化電流刺激后，神經元膜電位出現顯著的內向整流（Sag）特征；在全細胞模式下，神經元大多表現出頻率1～5 Hz的自發放電活動，少數神經元無自發放電。

本次實驗共記錄到6個具有自發放電的多巴胺能神經元，基礎放電頻率為（1.40±0.35）Hz，當灌流含有100 μmol/L FAC的ACSF溶液5 min后，放電頻率降低為（0.36±0.49）Hz，差異具有統計學意義（t=5.533，P＜0.01）。當繼續灌流ACSF溶液至10 min時，多巴胺能神經元的放電頻率進一步降低至（0.22±0.37）Hz，與灌流前相比較顯著減慢，差異具有統計學意義（t=7.297，P＜0.001）。隨后應用ACSF沖洗腦片，上述記錄的6個神經元均未能恢復自發放電活動。見圖1A。

2.2FAC對黑質多巴胺能神經元膜電位影響

本次實驗記錄到6個沒有自發放電的多巴胺能神經元，其膜電位為-（53.10±3.88）mV；在灌流100 μmol/L FAC 10 min后，膜電位為-（58.78±2.92）mV。與灌流FAC前相比，膜電位明顯向超級化方向移動，差異均有統計學意義（t=4.227，P＜0.01）。見圖1B～E。

3討論

在腦內神經元生長代謝過程中，金屬元素鐵發揮著重要的生理作用，如參與線粒體中能量產生、合成血紅蛋白參與氧轉運、髓鞘形成、神經遞質的合成與代謝等[19]。然而，鐵因其自身理化性質也具有一定細胞毒性作用：通過Fenton反應產生羥自由基等活性氧（ROS），介導ROS損傷DNA、蛋白質和脂質，造成氧化應激損傷，引發細胞衰老或死亡[20-24]。

因此，鐵在大腦特定區域的過度積累會導致一系列代謝失常，引發PD、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥等多種神經退行性疾病。就PD而言，確有研究表明在多巴胺能神經元損傷過程中超負載鐵離子引起了級聯反應[25]，而減少腦內鐵含量可減輕神經元死亡，延緩疾病進程[26]。不過這些研究多為探討分子反應機制，而未關注多巴胺能神經元的電活動與鐵含量升高之間是否存在關聯。

黑質多巴胺能神經元正常狀態下的電活動是維持其基本功能的關鍵，在黑質紋狀體系統功能的調節以及PD發病中發揮重要作用。在全細胞電流鉗模式下其主要表現為規則的緊張性放電，即起搏放電，本實驗記錄到的多巴胺能神經元基礎放電頻率為1～2 Hz，少數細胞無自發放電。而當放電頻率降低1 Hz即可導致多巴胺的釋放下降10%，影響機體的運動功能[27]。因此，闡明鐵對黑質多巴胺能神經元放電活動的影響，對于研究PD的病理機制及治療措施是極其關鍵的。

本文結果表明，FAC對多巴胺能神經元電活動的抑制作用具有時間依賴性。灌流5 min左右，多巴胺能神經元的自發放電頻率開始降低，隨著灌流時間的延長，神經元的放電頻率開始顯著降低甚至被完全抑制，ACSF沖洗后不能恢復放電。對于沒有自發放電活動的多巴胺能神經元，灌流FAC后神經元的膜電位出現明顯的超極化，同樣表明神經元的電活動即興奮性被抑制。然而，鐵是通過何種機制對多巴胺能神經元的電活動產生上述影響尚不清楚。此前有研究結果顯示，低濃度Fe2+和Fe3+可降低大鼠海馬神經元甘氨酸激活氯電流（IGLY）的激活閾值，而較高濃度Fe2+和Fe3+則降低了IGLY的峰值幅度[28]。不同濃度的Fe2+均可使瞬時外向鉀電流（IA）、延遲整流外向鉀電流（Ik）的激活電壓閾值降低，并使Na+通道I-V曲線左移[29]。黑質多巴胺能神經元的自發放電與瞬時外向鉀通道、延遲整流外向鉀通道、Na+通道相關，本實驗室前期亦證實，利用4-氨基吡啶阻斷瞬時外向鉀通道會對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD小鼠模型黑質區多巴胺能神經元損傷具有保護作用[30]。因此，我們推測鐵可能通過影響K+通道、Na+通道而改變多巴胺能神經元的放電活動，并且這種影響可能是不可逆的。

綜上所述，本研究證實鐵對黑質多巴胺能神經元電活動確有影響，100 μmol/L的FAC可以導致神經元自發放電活動減慢和膜電位超極化，從而抑制神經元的興奮性。由于本實驗只采取了單一濃度FAC進行研究，因此具體的影響機制及是否存在濃度依賴性仍需要后續實驗探究。

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（本文編輯于國藝）