液體活檢在肺癌早期診斷中的應用研究進展

［摘要］液體活檢是肺癌診斷的一種重要方法，較之傳統組織活檢，有安全無創、標本易獲取、可動態監測等優勢，在早期肺癌診斷中有確切價值。本文總結國內外液體活檢診斷早期肺癌的研究進展，探討其在早期肺癌診斷中的價值。

［關鍵詞］液體活組織檢查；肺腫瘤；早期診斷；生物標記，腫瘤；綜述

［中圖分類號］R734.2;R446.8［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0470-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.106［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240730.1145.003;2024-07-3109：16：33

Research advances in the application of liquid biopsy in the diagnosis of early-stage lung cancerHUANG Tongtong， XIN Ying， YIN Xiaojiao， SUN Yanqiu， XU Tao（Department of Respiratory and Critical Care Medicine， The Affiliated Hospital of Qing-dao University， Qingdao 266000， China）

［Abstract］Liquid biopsy is an important method for the diagnosis of lung cancer， and compared with traditional tissue biopsy， liquid biopsy has the advantages of favorable safety， noninvasiveness， convenience in obtaining specimens， and dynamic monitoring. Therefore， it has a marked value in the diagnosis of early-stage lung cancer. This article summarizes the research advances in liquid biopsy in the diagnosis of early-stage lung cancer in China and globally and discusses its value in the diagnosis of early-stage lung cancer.

［Key words］liquid biopsy; lung neoplasms; early diagnosis; biomarkers， tumor; review

肺癌是世界范圍內發病率及病死率最高的惡性腫瘤之一， 據美國癌癥協會統計，2020年全球肺癌新增病例和新增死亡病例在所有癌癥中的占比分別是11.4%和18.0%[1]。在我國，肺癌病人5年生存率僅為19.7%[2]。肺癌預后較差主要與多數病人初診時已經處于疾病晚期相關，實現肺癌的早診斷早治療是降低病死率、改善預后的重要手段。液體活檢作為一種新興的體外檢測方法，在肺癌的早期診斷中有重要價值。本文擬對國內外液體活檢診斷早期肺癌的研究進展作一綜述。

1液體活檢概述

液體活檢以血液、痰液、肺泡灌洗液等為檢測樣本，檢測體液中循環腫瘤細胞（CTC）、循環腫瘤DNA（ctDNA）、外泌體等生物標志物，近年來在腫瘤診治領域獲得了越來越多的關注，2020年被Nature雜志網站評選為腫瘤診治領域的里程碑事件之一。

相對于傳統的組織活檢，液體活檢有安全無創、標本易獲取、可重復取材等優勢，在提高臨床依從性、克服腫瘤異質性等方面有重要價值。當前許多研究已表明，液體活檢在腫瘤篩查、用藥指導、療效檢測、預后判斷等臨床實踐中都有著巨大的前景。

2液體活檢在早期肺癌診斷中的應用

2.1CTC

CTC于1869年首次在外周血中被發現[3]，指由于各種作用從原發性或轉移性的腫瘤組織中脫落而進入外周體液循環中的腫瘤細胞，是目前除循環游離DNA（cfDNA）外應用最多的液體活檢生物標志物[4]。

ILIE等[5]對168例慢性阻塞性肺疾病（COPD）、77例非COPD病人進行CTC檢測，結果顯示，COPD組5例血液標本中檢測到了惡性CTC，隨訪發現該5例病人后續都發生了肺癌，證明了CTC在早期肺癌篩查中的重要意義。HE等[6]檢測了24例Ⅰ期和Ⅱ期非小細胞肺癌（NSCLC）病人、72例健康對照者外周血CTC，其診斷靈敏度和特異度分別為62.5%和100.0%，說明了CTC對于肺癌早期篩查與診斷的潛在價值。

CTC的檢測分富集分離、鑒定分析兩步進行。首先通過密度梯度離心法、免疫磁珠吸附法等依賴于CTC物理學、生物學特征的方法富集CTC，繼而通過聚合酶鏈式反應（PCR）、細胞免疫熒光等方法對其進行分析[7]。其中免疫磁珠吸附法包括陽性富集和陰性富集，前者依賴于偶聯上皮細胞黏附分子（EpCAM）和細胞角蛋白等富集CTC，而后者依賴于偶聯CD45等標志物去除非腫瘤細胞[8]。CellSearch是美國食品藥品監督管理局唯一批準用于臨床的CTC檢測技術，該技術通過EpCAM抗體包被的磁珠結合CTC表面的EpCAM進行免疫分離[9]，但EpCAM易受上皮間質化影響，其診斷靈敏度欠佳且容易出現假陽性[10]。葉酸受體（FR）免疫磁珠負向篩選聯合靶向PCR，能靶向定量檢測FR陽性的CTC[11]，該方法不受上皮間質化的影響，彌補了CellSearch的部分不足。一項研究將FR靶向PCR CTC檢測應用于肺癌，發現良性肺結節病人的CTC水平顯著低于肺癌病人，該方法診斷肺癌的靈敏度和特異度分別為82.5%和72.2%，尤其對于Ⅰ期肺癌靈敏度可達86.8%，曲線下面積（AUC）可達0.912[12]，證明該方法對于早期肺癌有較好的輔助診斷價值。此外，近年也有一些獲得關注較多的其他CTC檢測技術，如CTCBIOPSY、微腔陣列（MCA）系統、微流控技術等，其肺癌檢出率的對比見表1。

2.2ctDNA

cfDNA是細胞以衰老、凋亡、壞死等方式釋放到體液循環中的游離DNA，主要包括正常組織細胞釋放的DNA、腫瘤細胞釋放的DNA，后者稱為ctDNA。ctDNA本質上是腫瘤組織的基因組片段，攜帶腫瘤細胞突變、插入、缺失、重排等基因組信息。

CHEN等[17]通過靶向測序檢測Ⅰ～Ⅲ期NSCLC病人的ctDNA和腫瘤組織DNA，發現了頻繁的驅動突變，該方法的診斷靈敏度和特異度分別為53.8%和47.3%。一項有關肺結節良惡性的研究顯示，ctDNA對于肺癌檢出的總體特異度為96.0%，靈敏度為69.0%[18]。因此，ctDNA被視作良好可靠的生物標記物，對于肺結節良惡性的定性診斷及早期肺癌的檢出有很大的價值。

基于上述研究和高通量測序（NGS）、數字PCR等檢測技術，ctDNA的檢測在肺癌的診治領域已有了部分應用，但仍面臨著在體液中含量低、清除速度快、敏感性低、缺乏統一檢測標準等問題。因此，ctDNA檢測在腫瘤臨床診治中的應用仍需克服相關技術難題以提高其可靠性和準確性。

2.3外泌體

外泌體是由細胞分泌到細胞外的囊泡，內含母細胞來源的DNA、微小RNA（miRNA）、蛋白質等成分，具有脂質雙分子層結構，在外周血、唾液、痰液、肺泡灌洗液等體液中均能檢測到，可通過自分泌或旁分泌的方式影響細胞間的物質交換和信息傳遞[19]，參與腫瘤的發生發展、侵襲、轉移。

ZHANG等[20]研究發現，外泌體中miR-5684和miR-125b-5p水平在NSCLC病人體內明顯降低，二者聯合診斷NSCLC的AUC為0.793，靈敏度和特異度分別為82.7%和62.1%，其中對于早期肺癌病人鑒別的靈敏度和特異度分別為80.6%和60.9%，證明了外泌體在區分肺癌病人和非肺癌病人方面的潛在價值。

外泌體的分離常采用超速離心法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等，再通過電子顯微鏡、免疫金標記技術、實時熒光定量PCR等方法分析鑒定[21]，其優勢在于體液中相對豐度高、外層的脂質雙分子層使其結構較穩定，有益于內容物的提取分析。但外泌體的檢測還存在著許多問題，比如并未建立一套分離提純的標準程序，上述提到的離心法、免疫吸附法等都有造成蛋白質污染的可能[22]，對實驗研究造成了較大的阻礙。總之，當前外泌體檢測難度大，檢測方法僅局限于實驗室層面，在實際臨床應用中不確定因素較多，克服技術難題、使其早日走向臨床應用仍任重而道遠。

2.4miRNA

miRNA是可以通過蛋白質-miRNA復合體、外泌體、腫瘤相關血小板（TEP）等物質攜帶釋放的非編碼RNA，長度約為18～25個核苷酸[23]，能夠對基因的轉錄、翻譯進行復雜的調控從而參與機體的病理生理過程。原癌基因和抑癌基因亦是一些miRNA的作用靶點，當這些miRNA出現異常時將導致原癌基因被激活、抑癌基因失活，從而導致癌癥的發生[24]。

BOUTABB等[25]研究顯示，未經治療的肺癌病人循環miR-16-5p、miR-92a-3p和miR-451a水平顯著高于健康個體，接受化療的病人miR-16-5p和miR-451a表達水平較未化療病人顯著降低，表明miRNA可能在肺癌發生發展的關鍵通路中發揮調控作用。XI等[26]的研究表明，外周血miR-146a、miR-200b、miR-7水平在肺結節和NSCLC病人體內有明顯差異。另有一項研究發現，合并肺癌的COPD病人在診斷肺癌的前3年，其血清中的miR-1246和miR-206就存在顯著差異表達，說明miRNA可以用于肺癌的診斷及早期篩查[27]。

miRNA的分離提取和檢測過程尚無規范化程序，且當前研究范圍較局限，欲準確衡量其臨床價值還需大規模的臨床試驗驗證。

2.5TEP

TEP是新近興起的腫瘤生物標志物，由腫瘤細胞將腫瘤相關分子轉移到血小板上，改變其RNA和蛋白質而產生[28]，最早由BEST等[29]于2015年發現。

BEST等[29]分析肺癌病人和健康者的血小板mRNA譜，發現其識別肺癌病人的靈敏度和特異度分別達到了97.0%、94.0%，準確度為96.0%。另有一項研究結果顯示，NSCLC病人血小板整合素亞基α2b（ITGA2B）水平明顯高于健康者，在隊列研究中診斷Ⅰ期NSCLC的靈敏度和特異度分別為96.4%和78.6%[30]。

TEP在外周血中含量高、能富集腫瘤細胞RNA以反映腫瘤生物學信息，但其作用機制、應用價值等方面的研究均處于起步階段，未來仍需要大量前瞻性研究來驗證其應用可行性。

2.6DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶的作用下將甲基

基團添加到DNA分子堿基上，最常見胞嘧啶第5位碳原子與甲基的結合。DNA分子中某些區域有較高密度的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpG），稱之為CpG島（CGIs），這些區域在正常情況下保持未甲基化狀態，而在惡性腫瘤病人體內常可以觀察到抑癌基因啟動子CGIs的高甲基化。異常的DNA甲基化會導致染色體結構改變、旋轉增加，影響基因轉錄，可能導致腫瘤的發生。

一項研究結合臨床資料、影像和基于基因甲基化的PulmoSeek模型構建PulmoSeek Plus模型，其在早期肺癌（0期和Ⅰ期）和5～10 mm結節中的診斷靈敏度分別為98.0%和99.0%，應用該模型對肺結節進行分類，可減少89.0%非必要手術并使延遲治療降低73.0%[31]。

DNA甲基化通過PCR擴增更易檢出，且它可能是一種癌前改變，有益于在更早期發現病變[32]。但和其他生物標志物一樣，其臨床應用也需要更多大樣本研究的支持，實際應用于臨床仍有很長的路要走。

2.7腫瘤相關自身抗體

腫瘤細胞發生基因突變、重組，從而產生異常蛋白，連同腫瘤細胞死亡后釋放出的細胞內蛋白，共同稱為腫瘤相關自身抗原，它可以激活機體的免疫系統，誘發產生腫瘤相關自身抗體[33]。

由英國Oncimmune公司研發的EarlyCDT-Lung肺癌相關自身抗體譜在歐美得到了推廣[34]。另外，經一項大規模、多中心研究驗證，我國針對亞洲人群基因特點研發的7種自身抗體檢測也在肺癌的早期診斷中表現出了很好的診斷效能，該自身抗體譜對Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC病人和局限性小細胞肺癌病人的診斷靈敏度分別達到62.0%、59.0%和59.0%[35]。

2.8循環染色體異常細胞（CAC）

腫瘤細胞在復制的過程中常會發生染色體結構的異常，從而產生CAC。攜帶3號（3p22.1，3q29）、10號（10q22.3，CEP10）染色體突變的外周血單個核細胞被命名為CAC，2010年首次在NSCLC病人外周血中被檢測到，據報道，CAC與原發腫瘤中的基因異常相似，與早期肺癌密切相關，且這些細胞的檢測不依賴于EpCAM，因此克服了CTC檢測的局限性[36]。

2020年KATZ等[37]公布了CAC在良惡性肺結節鑒別方面的研究成果，與組織活檢結果對照，CAC診斷的整體靈敏度為88.8%，特異度達100.0%。此外，YE等[38]進行了前瞻性研究，檢測肺結節大小≤10 mm病人體內的CAC，結果顯示其鑒別良惡性肺結節的靈敏度和特異度分別為70.5%和86.4%。

CAC作為液體活檢領域中的一種新選擇，對于肺結節良惡性鑒別、肺癌早期診斷的價值已得到了初步的研究驗證，現已部分應用于臨床，但尚未達到廣泛臨床應用要求，隨著分離富集與檢測技術的不斷進展，CAC的實踐應用價值有望得到進一步提高。

以上各類生物標記物對早期肺癌的診斷效能見表2。

3液體活檢的檢測方法

當前，ctDNA是臨床應用最廣泛的液體活檢生物標志物，常用的檢測方法包括基于PCR的靶向檢測和以NGS為主的非靶向檢測。PCR技術原理是先對目標DNA片段進行擴增，再進行檢測，操作簡便，但只能檢測部分已知可疑腫瘤基因片段。相比之下，NGS對所需DNA樣本的純度和濃度要求更低，能同時檢測多個突變基因位點并對其進行深度測序[41]，靈敏度和準確性都有顯著提高。呂爽等[42]對比分析了NSCLC病人病理組織切片DNA檢測結果和NGS對其外周血ctDNA的檢測結果，發現兩種方法無顯著差異，證明NGS檢測ctDNA突變具有較高的準確性。

4液體活檢與人工智能（AI）輔助診斷聯合應用

目前，AI越來越廣泛地應用于醫療領域，在腫瘤的早篩早診方面，液體活檢與AI技術的聯合為實現精準醫療、提高診斷效率及準確性提供了新的方向。

首先，經典機器學習、深度學習、影像組學等AI技術較人力能夠更高效、自動化地獲取影像學的深層圖像信息，與液體活檢的聯合應用對于肺結節的檢出及良惡性鑒別意義較大。梁文華等[43]聯合AI分析CT影像與ctDNA甲基化檢測鑒別肺結節良惡性，將檢測模型的準確率提高到了91.0%；YE等[44]綜合臨床特征、肺結節影像學特征、AI分析LDCT數據及液體活檢建立了一個早期肺癌預測模型，其靈敏度和特異度分別為89.5%和81.3%，AUC為0.88。

此外，將人工智能與液體活檢NGS相結合也為肺癌的早期診斷開辟了新的可能。首先通過NGS獲得肺癌病人的基因組信息，繪制基因組圖譜，再利用機器學習對其基因組信息進行分析，構建算法模型以用于肺癌的早期診斷[45]。已有研究對104例NSCLC病人的ctDNA特征譜和56例高風險病人的基因譜進行深度學習，開發了對肺癌診斷效率達50.0%～70.0%的Lung-CLiP模型[46]。

5液體活檢在早期肺癌診斷中的優勢與挑戰

液體活檢作為早期肺癌診斷的方法之一，因其安全、無創、便捷、可動態監測的特點逐漸改變著傳統的診治模式。傳統組織活檢存在一定缺陷，如局部取樣所得樣本相對有限，且受到病灶大小及位置的影響，尤其是對于直徑小于10 mm的肺小結節及位于肺野中帶、內帶肺結節穿刺難度大、準確率低。另外，穿刺活檢作為一種侵入性檢查，面臨著氣胸、出血和咯血、胸膜反應、空氣栓塞等并發癥的問題，在安全性及病人依從性方面較液體活檢有所不足。根據目前國內外研究進展，尚無影像學聯合組織活檢與液體活檢兩種檢測技術在肺結節診斷方面的比較研究，未來開展該領域的臨床研究將能夠對該兩種檢測技術的診斷效能做出更加客觀的對比。

然而，液體活檢仍不可取代組織活檢的診斷金標準價值，且其檢測的靈敏度和特異度有待進一步提高，亟需更加靈敏、準確的檢測技術以及標準的技術規范，以提高肺癌診斷的準確性、規范性及可推廣普及性。

6總結與展望

實現肺癌的早篩早診對提高病人生存率、指導針對性藥物應用或外科治療、改善病人預后等意義重大。液體活檢為早期肺癌的診斷提供了新選擇，其與影像學、AI技術等相結合更是一種前景巨大的診斷模式。

作為早期肺癌診斷領域的研究熱點，液體活檢技術近年來發展迅猛，隨著檢測技術的不斷更新、檢測程序逐漸規范化，結合基礎研究的理論支持及更多的臨床研究進行驗證，液體活檢技術必能在早期肺癌的精確診斷、治療指導、預后判斷等方面實現其應用價值。

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（本文編輯劉寧）