膠質瘤組織BSN表達及其對病人預后的影響

［摘要］目的探究巴松管突觸前細胞基質蛋白（BSN）在膠質瘤組織表達及其對病人預后的影響。方法通過從癌癥基因組圖譜（TCGA）、中國腦膠質瘤圖譜（CGGA）、膠質瘤基因組數據庫（GEO）和臨床蛋白質組腫瘤分析數據庫（CPTAC）下載膠質瘤的轉錄組數據、蛋白組數據和臨床樣本資料，分析膠質瘤組織BSN的表達水平及其與病人預后的關系。使用siRNA轉染U251細胞株，構建BSN表達下調的膠質瘤細胞系。采用Western blotting技術檢測BSN對膠質瘤細胞增殖相關蛋白PCNA和遷移相關蛋白CD44的表達水平的影響。結果與正常腦組織相比，膠質瘤組織BSN mRNA的表達水平顯著下調（Plt;0.001），其異常低表達與膠質瘤病人的不良預后顯著相關（Plt;0.001）。隨著膠質瘤級別的增加，BSN的mRNA水平逐漸下調。在高級別膠質瘤中，BSN的蛋白表達水平也顯著低于正常組 （Plt;0.001）。Western blotting檢測結果顯示，敲低BSN基因可以顯著上調U251細胞中PCNA和CD44蛋白的表達水平，差異有統計學意義（F=14.56、164.90，Plt;0.01）。結論BSN在膠質瘤組織中表達下調并與腫瘤的預后相關。敲低BSN可以促進膠質瘤細胞增殖、遷移相關蛋白的表達。BSN可能在膠質瘤發生發展中扮演抑癌基因的角色。

［關鍵詞］神經膠質瘤；巴松管突觸前細胞基質蛋白；受體，突觸前；膠質母細胞瘤；基因敲低技術；預后

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0345-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.085［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240711.1358.004;2024-07-1515：51：06

Expression of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon in glioma tissue and its influence on the prognosis of patientsZHOU Xiaotong， FU Lin， JIANG Hong（State Key Disciplines： Physiology （Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of Bassoon （BSN）， a presynaptic cytomatrix protein， in glioma tissue and its influence on the prognosis of patients. MethodsTCGA， CGGA， GEO， and CPTAC databases were used to download transcriptomic data， proteomic data， and the data of clinical samples， and the expression level of BSN in glioma tissue and its association with prognosis were analyzed. The U251 cell line was transfected with siRNA to construct a glioma cell line with downregulated BSN expression. Western blotting was used to measure the influence of BSN on the expression levels of the proliferation-related protein PCNA and the migration-related protein CD44 in glioma cells. ResultsThe mRNA expression level of BSN was downregulated in glioma tissue compared with normal brain tissue （Plt;0.001）， and the abnormally low expression of BSN was significantly associated with the poor prognosis of glioma patients （Plt;0.001）. The mRNA expression level of BSN gradually decreased with the increase in the grade of glioma. In addition， the protein expression level of BSN in high-grade glioma was significantly lower than that in the normal group （Plt;0.001）. Western blotting showed that knockdown of BSN significantly upregulated the protein expression levels of PCNA and CD44 in U251 cells （F=14.56，164.90;Plt;0.01）. ConclusionBSN expression is downregulated in glioma and is associated with tumor prognosis. Knockdown of BSN can promote the expression of proliferation and migration-related proteins in glioma cells， and BSN may play the role of a tumor suppressor gene in the development and progression of glioma.

［Key words］glioma; bassoon presynaptic cytomatrix protein; receptors， presynaptic; glioblastoma; gene knockdown techniques; prognosis

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，約占惡性腦腫瘤的81%，具有浸潤性生長、難以完全切除、易復發、預后不良等特點[1]。世界衛生組織根據膠質瘤的惡性程度，將膠質瘤分為4個等級[2]。目前臨床上，通常采用手術切除結合放化療等的治療方法，但由于腫瘤的彌漫侵襲性生長、血-腦脊液屏障限制等因素，高級別膠質瘤（WHO分級Ⅳ級）如膠質母細胞瘤（GBM），中位生存期僅約為14個月[3]。近年來，越來越多的分子治療靶點被發現，這些分子標記物對于腫瘤診斷、預后評估和個性化治療有重要意義[4]。巴松管突觸前細胞基質蛋白（BSN）基因（OMIM*604020）位于3q21.31，編碼Bassoon蛋白，該蛋白在哺乳動物大腦中表達豐富[5]。Bassoon參與突觸囊泡運輸和活躍區細胞基質的建立，協助谷氨酸能神經元釋放神經遞質，在維持突觸完整性方面起重要作用[6]。另外，BSN還能夠促進tau蛋白的傳播，因此參與了阿爾茲海默病的發生[7]。然而，有關BSN在膠質瘤中的表達及其作用仍是未知的。本研究利用癌癥基因組圖譜（TCGA）、中國腦膠質瘤圖譜（CGGA）、膠質瘤基因組數據庫（GEO）和臨床蛋白質組腫瘤分析數據庫（CPTAC）分析了BSN在膠質瘤中的表達及其對病人預后的影響，并初步探討其對人膠質母細胞瘤U251細胞增殖和遷移相關蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用的細胞人膠質母細胞瘤U251細胞購于中國科學院上海研究院細胞庫，高糖DMEM細胞培養液購于以色列Biological Industries公司，胎牛血清購于北京全式金生物技術有限公司，青霉素-鏈霉素混合液購于北京索萊寶公司，增殖細胞核抗原（PCNA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購于美國CST公司，白細胞分化抗原44（CD44）抗體購于美國Proteintech公司，siRNA-BSN病毒購于蘇州吉瑪基因公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養從液氮罐中取出凍存的U251細胞，迅速放置于37 ℃水浴鍋至完全溶解，將細胞懸液轉移至裝有5 mL溫熱細胞培養液的離心管中。以1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入5 mL完全培養液，用吸管吹打混勻后將上述細胞懸液接種至25 cm2細胞培養瓶中，置于37 ℃、體積分數0.05的CO2細胞培養箱中培養，每3 d傳代1次。

1.2.2細胞轉染以5×107/ L細胞密度接種6孔板，每孔加入2 mL細胞懸液，待細胞生長至70%～80%融合時用于實驗。分別取Lipofectamine 2000和120 pmol/L的siRNA-BSN病毒各6 μL，用無血清無抗生素培養液稀釋至200 μL，混勻后室溫靜置5 min，將兩者混合形成RNA-脂質體復合物，室溫靜置15～20 min。細胞分組如下：①siRNA-NC，②siRNA-BSN#1，③siRNA-BSN#2，④siRNA-BSN#3。將6孔板中的2 mL細胞培養液換成1 mL新的無血清無抗生素的基礎培養液，然后每孔分別逐滴加入400 μL的RNA-脂質體復合物。將各組細胞放入CO2細胞培養箱中，37 ℃培養8 h后棄去培養液，換成含血清和抗生素的完全培養液繼續培養48 h。

1.2.3Western blotting檢測方法將U251細胞在6孔板中轉染48 h后從培養箱中取出，每孔加入100 μL裂解液，在冰上裂解30 min后提取以不同siRNA轉染的細胞蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。每孔加入10 μg 蛋白樣品，恒壓80 V，電泳2 h。恒流300 mA，轉膜90 min。用100 g/L的奶粉封閉液封閉2 h。加入CD44抗體（1∶1 000）、PCNA抗體（1∶1 000）及GAPDH抗體（1∶10 000）置4 ℃搖床過夜。一抗孵育結束后，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。加二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。二抗孵育結束后，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。用ECL化學發光試劑顯影，Image J軟件分析條帶，結果以目的蛋白與GAPDH條帶的灰度值的比值表示。

1.2.4生物信息學方法臨床數據分別來自GEO、TCGA、CGGA和CPTAC數據庫，網址為http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/、https：//portal.gdc.cancer.gov、http：//www.cgga.org.cn/和https：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/CPTAC-Result.pl？genenam=bsnamp;ctype=GBM。使用Kaplan-Meier Plotter 分析OTUD7A的表達與病人生存的相關性，對應網址為：http：//kmplot.com/analysis/。

1.3統計學方法

應用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料數據均采用±s表示，兩組間均數比較采用 Student’s t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），然后以Student-Newman-Keuls法進行組間兩兩比較。以Plt;0.05表示差別具有統計學意義。

2結果

2.1膠質瘤和正常腦組織中BSN表達比較

通過GEO（主要包括GSE7696、GSE55918和GSE59612）數據庫下載膠質瘤的轉錄組數據和臨床樣本資料。利用Graph Pad Prism 8.0 軟件整合分析BSN在膠質瘤和正常腦組織中的mRNA表達水平。研究結果顯示，與正常腦組織相比較，膠質瘤中BSNmRNA表達均異常降低，差異均有顯著意義（tGSE7696、GSE55918、GSE59612=5.937，Plt;0.001）。見圖1。

2.2BSN表達與膠質瘤預后的關系

通過GEPIA分析TCGA的數據，采用對數秩檢驗（Log-rank test）的結果顯示，BSN表達更低組別的膠質瘤病人，其總生存期和無病生存期均更短（Plt;0.001）。見圖2A、B。進一步利用CGGA數據庫進行驗證，Kaplan-Meier生存分析顯示，BSN mRNA低表達水平與病人的不良預后呈顯著正相關（Plt;0.001），得到了與TCGA分析一致的結論。見圖2C。因此，BSN mRNA的低表達與膠質瘤的不良預后相關。

2.3BSN表達與膠質瘤不同等級的關系

通過下載TCGA和CGGA數據庫膠質瘤轉錄組數據和臨床樣本資料，利用Graph Pad Prism 8.0 軟件整合分析了不同級別膠質瘤中BSN mRNA的表達水平。結果顯示，隨著膠質瘤等級的增加，BSNmRNA的表達水平逐漸降低（FTCGA=93.79，FCGGA=71.80，Plt;0.001）。見圖3A、B。進一步通過分析CPTAC數據庫蛋白表達數據的結果表明，高級別的GBM中BSN的蛋白表達顯著低于正常組（Plt;0.001）。見圖3C。因此，BSN在高級別膠質瘤中具有更顯著的異常低表達。

2.4敲低BSN對U251細胞PCNA和CD44蛋白表達影響

BSN mRNA的表達水平隨膠質瘤惡性程度的增加而逐漸降低。見圖3A。定量PCR檢測結果顯示，相較于陰性對照組，實驗組BSN的mRNA水平顯著下調。見圖4A。Western blotting技術檢測敲低BSN后PCNA和CD44蛋白表達結果顯示，對照組及敲低BSN各組的灰度值分別為0.77±0.06、1.04±0.11、1.39±0.15和1.07±0.11，與對照組相比較，敲低BSN各組U251細胞中PCNA蛋白和CD44蛋白表達水平均明顯升高，差異具有統計學意義（FPCNA=164.9，FCD44=14.56，Plt;0.01）。見圖4B、C。

3討論

GBM是目前最常見的成人腦腫瘤，容易復發且預后很差，5年生存率僅為5%[11-13]，它表現為對正常腦組織的破壞，對常規治療的抵抗以及廣泛侵襲整個大腦[14-16]。因此，手術切除結合放化療的傳統治療方案預后效果不佳[17-18]。分子靶向技術在惡性腫瘤治療過程中發展迅速，也是膠質瘤新療法研發的重要方向[19-20]。目前，貝伐珠單抗已在全球80多個國家或地區獲批用于復發性GBM病人的靶向治療，臨床試驗結果顯示貝伐株單抗僅能延長病人無病生存期，而對總生存期沒有影響[21-22]。而最新的研究結果表明，貝伐株單抗治療前神經元型的GBM可顯著延長病人的總生存期[23-25]。盡管貝伐株單抗等藥物已在臨床試驗中初見成效，但是靶向藥物研發進展仍相對緩慢，這與惡性膠質瘤的高度異質性和獲得性耐藥機制等原因有關。因此，有必要深入研究膠質瘤發生發展的基因調控機制，以明確發現新的分子治療靶點[26-30]。

本文討論了膠質瘤中的一個潛在的分子標志物BSN，這可能為膠質母細胞瘤研究帶來新思路。首先，我們分析了TCGA、CGGA、GEO和CPTAC數據庫的相關數據。本文的研究結果顯示，與正常腦組織相比，膠質瘤中BSN表達水平下調，其異常低表達與膠質瘤病人的不良預后顯著相關。PCNA只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞中，與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動過程中發揮重要作用，是反映細胞增殖狀態的良好指標。CD44則是上皮-間質轉化關鍵調節因子，能夠驅動癌癥相關的信號傳導，促進腫瘤的轉移過程。而進一步敲低BSN可顯著上調U251細胞中PCNA和CD44蛋白的表達水平。因此，敲低BSN可能增強U251細胞的增殖能力與遷移能力，BSN有可能是抑制膠質瘤發生發展的關鍵基因。但敲低BSN對U251細胞增殖與遷移能力的影響及具體機制還不夠明確，后續研究將對此進行深入探討，以期為靶向治療膠質瘤提供實驗數據。

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（本文編輯于國藝）