LncRNA PVT1對彌漫大B細胞淋巴瘤細胞活性的影響及其機制

［摘要］目的探究長鏈非編碼RNA（LncRNA）漿細胞瘤變體異位基因1（PVT1）對彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）細胞生物學行為的影響，并分析其潛在機制。方法收集41例DLBCL病人和15例淋巴結反應性增生（RLH）病人的組織標本，體外培養人正常B淋巴細胞GM12878和人DLBCL細胞（OCI-Ly3、U2932、TMD8），對TMD8細胞進行轉染，將其分為control組（只轉染Lipofectamine-2000）、si-NC組（轉染si-NC）、inhibitor-NC組（轉染inhibitor-NC）、si-PVT1組（轉染si-PVT1）、miR-145-5p inhibitor組（轉染miR-145-5p inhibitor）、si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組（轉染si-PVT1和miR-145-5p inhibitor）。應用qRT-PCR方法檢測各組細胞PVT1 mRNA和miR-145-5p表達，Western Blot方法檢測CDK6蛋白表達，CCK-8法檢測TMD8細胞增殖，流式細胞術檢測TMD8細胞周期變化，Transwell實驗檢測TMD8細胞遷移和侵襲能力，RNA pull down和雙熒光素酶報告基因法驗證PVT1、miR-145-5p與細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）的靶向關系。結果DLBCL組織PVT1 mRNA、CDK6蛋白的表達水平高于RLH組織，miR-145-5p表達低于RLH組織（t=14.264～24.445，Plt;0.05）。與GM12878細胞比較，OCI-Ly3、U2932、TMD8細胞中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達均增加，miR-145-5p表達均減少（F=69.557～234.718，Plt;0.05）。6組細胞PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白表達及增殖率、G0/G1期細胞比例、S期細胞比例、遷移和侵襲細胞數差異有統計學意義（F=25.589～319.150，Plt;0.05）；與control組比較，si-PVT1組細胞PVT1 mRNA、CDK6蛋白、增殖率、S期細胞比例、遷移和侵襲數量降低，miR-145-5p表達、G0/G1期細胞比例升高（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組呈相反變化（Plt;0.05）；下調miR-145-5p表達可減弱敲低PVT1對TMD8細胞惡性生物學行為的抑制作用（Plt;0.05）。過表達PVT1 mRNA增高CDK6蛋白表達、細胞增殖率、S期細胞比例、遷移和侵襲數量，降低miR-145-5p表達、G0/G1期的細胞比例（F=38.025～327.887，Plt;0.05）。miR-145-5p是PVT1的靶基因，且miR-145-5p可靶向下調CDK6表達。結論敲低PVT1可抑制DLBCL細胞惡性生物學行為，其作用機制可能與調控miR-145-5p/CDK6軸有關。

［關鍵詞］淋巴瘤，大B細胞，彌漫性；RNA，長鏈非編碼；漿細胞瘤變體異位基因1；miR-145-5p；細胞周期蛋白依賴激酶6

［中圖分類號］R733.4［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0381-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.102［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240730.1613.008;2024-07-3111：35：43

Effect of long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation gene 1 on the viability of diffuse large B-cell lymphoma cells and its mechanismLU Xiaohui， LI Wenyong， WANG Menglin， CHEN Xiangli（Lymphoma Hematopoietic Stem Cell Transplantation Center， Jiaozuo People’s Hospital， Jiaozuo 454150， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA （LncRNA） plasmacytoma variant translocation gene 1 （PVT1） on the biological behavior of diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） cells and its potential mechanism.MethodsTissue specimens were collected from 41 patients with DLBCL and 15 patients with lymph node reactive hyperplasia （RLH）， and normal human B lymphocytes GM12878 and human DLBCL cells （OCI-Ly3， U2932， TMD8） were cultured in vitro. TMD8 cells were transfected and divided into control group （transfected with Lipofectamine-2000 alone）， si-NC group （transfected with si-NC）， inhibitor-NC group （transfected with inhibitor-NC）， si-PVT1 group （transfected with si-PVT1）， miR-145-5p inhibitor group （transfected with miR-145-5p inhibitor）， and si-PVT1+miR-145-5p inhibitor group （transfected with si-PVT1 and miR-145-5p inhibitor）. The qRT-PCR method was used to measure the mRNA expression levels of PVT1 and miR-145-5p in each group of cells; Western Blot was used to measure the protein expression level of cyclin-dependent kinase 6 （CDK6）; CCK-8 assay was used to measure the proliferation of TMD8 cells; flow cytometry was used to measure the change in cell cycle of TMD8 cells; Transwell assaywas used to measure the migration and invasion abilities of TMD8cells; RNA pull-down and dual-luciferase reporter assay were used to verify the targeting relationship between PVT1， miR-145-5p， and CDK6.ResultsThe mRNA expression level of PVT1 and the protein expression level of CDK6 in DLBCL tissue were significantly higher than those in RLH tissue， and the expression level of miR-145-5p in DLBCL tissue was significantly lower than that in RLH tissue （t=14.264-24.445，Plt;0.05）. Compared with GM12878 cells， OCI-Ly3， U2932， and TMD8 cells had significant increases in the mRNA expression level of PVT1 and the protein expression level of CDK6 and a significant reduction in the expression level of miR-145-5p （F=69.557-234.718，Plt;0.05）. There were significant differences between the six groups of cells in PVT1， miR-145-5p， CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in G0/G1 phase， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion （F=25.589-319.150，Plt;0.05）. Compared with the control group， the si-PVT1 group had significant reductions in PVT1， CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion， as well as significant increases in the expression of miR-145-5p and the proportion of cells in G0/G1 phase（Plt;0.05）， while the miR-145-5p inhibitor group showed opposite changes （Plt;0.05）. Down regulating the expression of miR-145-5p could weaken the inhibitory effect of PVT1 knockdown on the malignant biological behavior of TMD8 cells （Plt;0.05）. Overexpression of PVT1 increased the protein expression level of CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion and reduced the expression of miR-145-5p and the proportion of cells in G0/G1 phase （F=38.025-327.887，Plt;0.05）. This study showed that miR-145-5p was a target gene of PVT1， and miR-145-5p could down regulate the expression of CDK6.ConclusionPVT1 knockdown can inhibit the malignant biological behavior of DLBCL cells， possibly by regulating the miR-145-5p/CDK6 axis.

［Key words］lymphoma， large B-cell， diffuse; RNA， longnoncoding; plasmacytoma variant translocation gene 1; miR-145-5p; cyclin-dependent kinase 6

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）約占所有淋巴瘤病例的40%[1]。隨著化療和新的DLBCL藥物的發展，大部分病人治療后處于長期緩解，但有些病人臨床結果不佳[2]。因此，明確DLBCL的發病機制，對改善DLBCL的預后有重要意義。非編碼RNA（LncRNA）是包括DLBCL在內的癌癥診斷和預后判斷的有希望的標志物[3-4]。LncRNA漿細胞瘤變體異位基因1（PVT1）在DLBCL中表達升高，可促進DLBCL惡性進展，且與病人不良預后相關[5]。但關于其分子機制的研究較少。LncRNA可以海綿化miRNA保護其下游靶mRNA免被降解[6]。miR-145-5p被證實在DLBCL中表達降低，作為抑癌基因發揮作用[7]。細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）在包括DLBCL在內的多種惡性腫瘤中異常高表達[8]。有研究顯示，CDK6為miR-145-5p的靶基因，而PVT1又可以作用于miR-145-5p[9-10]。推測LncRNA PVT1可能通過調節miR-145-5p/CDK6軸在DLBCL中發揮致癌作用。本研究探討PVT1對DLBCL細胞生物學活性的影響及其潛在機制，為DLBCL的治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1實驗材料

收集2017年1月—2020年12月焦作市人民醫院病理科診斷為DLBCL病人的組織標本41例，另取15例淋巴結反應性增生（RLH）病人的組織標本作為對照組。人正常B淋巴細胞GM12878和人DLBCL細胞OCI-Ly3、U2932、TMD8購自上海康朗生物科技公司。靶向PVT1的siRNA（si-PVT1）及其陰性對照（si-NC）、miR-145-5p模擬物（mimic）及其陰性對照（mimic-NC）、miR-145-5p抑制劑（inhibitor）及其陰性對照（inhibitor-NC）、PVT1野生型（PVT1-WT）質粒、PVT1突變型（PVT1-MUT）質粒、CDK6-WT質粒、CDK6-MUT質粒均購自上海吉瑪制藥公司；PVT1、miR-145-5p、GAPDH、U6引物由武漢金開瑞生物工程公司設計合成；Lipofectamine-2000、Trizol（上海玉博生物科技公司）；反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（Takara公司）；兔源一抗CDK6、β-actin和山羊抗兔二抗（Abcam公司）；CCK-8試劑盒、碘化丙啶（PI）（上海Beyotime公司）。

1.2細胞培養與轉染

GM12878、OCI-Ly3、U2932、TMD8細胞均在添加含體積分數0.10胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養液中培養。將TMD8細胞以5×104個/孔接種至24孔板內，待細胞密度達80%時應用Lipofectamine-2000進行轉染，實驗分為control組（A組，只轉染Lipofectamine-2000）、si-NC組（B組，轉染si-NC）、inhibitor-NC組（C組，轉染inhibitor-NC）、si-PVT1組（D組，轉染si-PVT1）、miR-145-5p inhibitor組（E組，轉染miR-145-5p inhibitor）、si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組（F組，轉染si-PVT1和miR-145-5p inhibitor），轉染48 h后收集各組TMD8細胞，通過qRT-PCR方法檢測PVT1mRNA、miR-145-5p表達，以鑒定轉染效率。

1.3檢測指標及方法

1.3.1qRT-PCR檢測PVT1 mRNA、miR-145-5p表達采用Trizol法提取各組織及細胞中總RNA，反轉錄制備cDNA，以GAPDH、U6為內參，利用qRT-PCR試劑盒擴增cDNA。反應條件為：95 ℃ 10 min，然后在95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min下進行40個循環。應用ABI 7500 qRT-PCR儀檢測PVT1、miR-145-5p水平，2-△△CT法分析結果。引物及其序列見表1。

1.3.2Western Blot方法檢測CDK6蛋白表達分別向各組織、細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，定量、熱變性后，分離蛋白、轉膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育兔源一抗CDK6、β-actin（1∶1 000，過夜），次日室溫孵育山羊抗兔二抗（1∶2 000，2 h），滴加ECL發光液后置于WD-9413A凝膠成像分析儀中拍照，用Image J軟件分析目的條帶灰度值。以β-actin為內參對CDK6的表達進行定量。

1.3.3CCK-8法檢測TMD8細胞的增殖情況TMD8細胞在96孔板（10 000個/孔）中培養24 h，加入CCK-8試劑（10 μL/孔）培養2 h后，酶標儀測定波長450 nm處吸光度（OD），計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.3.4流式細胞術檢測TMD8細胞周期的變化TMD8細胞用RNase A（0.1 g/L）孵育30 min后，3 000 r/min離心5 min，重懸，4 ℃乙醇固定4 h，棄上清液，與PI（50 mg/L）避光孵育30 min，流式細胞儀分析細胞各周期比例。

1.3.5Transwell實驗檢測TMD8細胞遷移、侵襲能力TMD8細胞用不含FBS的培養液重懸（1×108個/L），Transwell上室加入200 μL懸液，下室加入600 μL含血清的培養液，孵育24 h后收集下室細胞，40 g/L多聚甲醛固定，1 g/L結晶紫染色，計數細胞遷移數量。在侵襲實驗中，Matrigel包被到Transwell上室，其余操作同遷移實驗，計數著色的細胞數量，即為侵襲數量。

1.3.6RNA pull down法和雙熒光素酶報告基因（DLR）法驗證PVT1與miR-145-5p的作用及其關系將5×105個/孔TMD8細胞在24孔板中培養，待細胞密度達80%時分別將生物素（biotin）標記的miR-145-5p mimic（biotin-miR-145-5p mimic組）、mimic-NC（biotin-mimic-NC組）轉染至細胞中，24 h后，裂解細胞，然后向細胞裂解液中加入鏈霉親和素瓊脂糖磁珠孵育30 min，提取RNA并檢測PVT1富集量。

在DLR實驗中，通過RNA相互作用百科全書（ENCORI）數據庫（https：//rnasysu.com/encori/）對miR-145-5p和PVT1的互補位點進行預測，根據結合位點構建PVT1-WT質粒、PVT1-MUT質粒。將TMD8細胞接種至24孔板，待細胞密度達到80%時用Lipofectamine-2000進行轉染并分組：PVT1-WT+mimic-NC組（共轉染PVT1-WT和mimic-NC）、PVT1-WT+miR-145-5p mimic組（細胞共轉染PVT1-WT和miR-145-5p mimic）、PVT1-MUT+mimic-NC組（細胞共轉染PVT1-MUT和mimic-NC）、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組（細胞共轉染PVT1-MUT和miR-145-5p mimic），轉染24 h后利用DLR試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.3.7DLR方法驗證miR-145-5p與CDK6的作用關系利用ENCORI數據庫預測miR-145-5p與CDK6的結合位點，根據結合位點構建CDK6-WT質粒、CDK6-MUT質粒。將TMD8細胞接種至24孔板中（5×104個/孔），待細胞密度達80%時進行轉染分組：CDK6-WT+mimic-NC組（細胞共轉染CDK6-WT和mimic-NC）、CDK6-WT+miR-145-5p mimic組（細胞共轉染CDK6-WT和miR-145-5p mimic）、CDK6-MUT+mimic-NC組（細胞共轉染CDK6-MUT和mimic-NC）及CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組（共轉染CDK6-MUT和miR-145-5p mimic），轉染24 h后檢測各組熒光素酶活性。

1.4統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料結果以±s，兩組間比較應用t檢驗，3組及以上的組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。采用Spearman秩相關分析PVT1與miR-145-5p及miR-145-5p與CDK6的相關性。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1DLBCL組織和細胞中PVT1 mRNA、miR-145-5p及CDK6蛋白表達

DLBCL組織中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達高于RLH組織，miR-145-5p表達低于RLH組織（t=14.264～24.445，Plt;0.05），見圖1和表2。相關性分析顯示，DLBCL組織中PVT1 mRNA表達與miR-145-5p呈負相關關系（r=-0.405，P=0.009），miR-145-5p與CDK6蛋白表達呈負相關（r=-0.457，P=0.003），見圖2。與GM12878細胞比較，OCI-Ly3、U2932、TMD8細胞中CDK6蛋白、PVT1 mRNA表達均增加，miR-145-5p表達均減少（F=69.557～234.718，Plt;0.05），且TMD8細胞中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達最高，miR-145-5p表達最低。見圖1和表3。

2.2PVT1 mRNA、miR-145-5p轉染效率鑒定

control組、si-NC組、si-PVT1組細胞PVT1 mRNA表達分別為0.29±0.02、1.00±0.05、0.99±0.03，與control組、si-NC組相比較，si-PVT1組PVT1 mRNA的表達顯著下降（F=523.262，Plt;0.05），說明si-PVT1轉染成功。inhibitor-NC組、miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達分別為0.25±0.03、1.01±0.05，兩組比較差異有顯著性（t=26.068，Plt;0.05），說明miR-145-5p inhibitor轉染成功。

2.3敲低PVT1 mRNA或者下調miR-145-5p對TMD8細胞中PVT1 mRNA、miR-145-5p及CDK6蛋白表達的影響

本文6組細胞的PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白表達差異有統計學意義（F=25.589～319.150，Plt;0.05）。與control組比較，si-PVT1組PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達降低，miR-145-5p表達升高（Plt;0.05）；miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達降低，CDK6蛋白表達升高（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組TMD8細胞中miR-145-5p表達降低，CDK6蛋白表達升高（Plt;0.05）。見圖3、表4。

2.4敲低PVT1 mRNA或下調miR-145-5p對細胞增殖的影響

本文6組細胞增殖率及G0/G1期、S期細胞比例差異有統計學意義（F=66.037～213.482，Plt;0.05）。與control組比較，si-PVT1組TMD8細胞增殖率、S期的細胞比例降低，G0/G1期的細胞比例升高（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組上述指標呈相反變化（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組TMD8細胞增殖率、S期細胞比例升高，G0/G1期細胞比例降低（Plt;0.05）。見圖4和表5。

2.5敲低PVT1或下調miR-145-5p對TMD8細胞遷移、侵襲的影響

本文6組細胞遷移和侵襲細胞數差異有統計學意義（F=64.630、57.457，Plt;0.05）。與control組比，si-PVT1組細胞的遷移和侵襲數量降低（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組細胞遷移數、侵襲數均升高（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組細胞遷移數、侵襲數均升高（Plt;0.05）。見圖5和表6。

2.6過表達PVT1對TMD8細胞增殖、遷移和侵襲的影響

control組（轉染Lipofectamine-2000）、pcDNA-NC組（轉染pcDNA-NC）、pcDNA-PVT1組（轉染pcDNA-PVT1）細胞PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白、細胞增殖率、G0/G1期及S期細胞比例、遷移和侵襲細胞數比較差異有統計學意義（F=38.025～327.887，Plt;0.05）；與control組、pcDNA-NC組比較，pcDNA-PVT1組PVT1 mRNA、CDK6表達升高，miR-145-5p表達降低，細胞增殖率、S期的細胞比例增高，G0/G1期的細胞比例降低，細胞的遷移和侵襲數量增高（Plt;0.05）。見圖6、7和表7。

2.7PVT1與miR-145-5p作用關系驗證

應用ENCORI數據庫預測PVT1與miR-145-5p的結合位點見圖8。與biotin-mimic-NC組比較，biotin-miR-145-5p mimic組PVT1富集量較高（3.17±0.09比1.02±0.05；t=41.765，Plt;0.05）。PVT1-WT+mimic-NC組、PVT1-MUT+mimic-NC組、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組以及PVT1-WT+miR-145-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.02±0.04、0.99±0.04、1.01±0.03、0.26±0.05，差異具有統計學意義（F=338.263，Plt;0.05）；與PVT1-WT+mimic-NC組、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組相比較，PVT1-WT+miR-145-5p mimic組熒光素酶活性降低（Plt;0.05）。

2.8miR-145-5p與CDK6作用關系驗證

通過ENCORI數據庫預測到miR-145-5p序列與CDK6互補的結合位點見圖9。CDK6-WT+mimic-NC組、CDK6-MUT+mimic-NC組、CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組和CDK6-WT+miR-145-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.03±0.05、1.00±0.06、1.01±0.05、0.32±0.04，差異有統計學意義（F=188.758，Plt;0.05）；與CDK6-WT+mimic-NC組、CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組比較，CDK6-WT+miR-145-5p mimic組熒光素酶活性降低（Plt;0.05）。

3討論

目前，大部分DLBCL病人接受化療后預后較好，但仍有約1/3的病人在初步緩解后發生復發，預后較差，由此需要開發新的靶向治療方法[2，11]。相關研究顯示，LncRNA參與調控腫瘤的發生和轉移[12-13]。PVT1是一種促癌基因，在膽囊癌、乳癌、卵巢癌中表達升高，可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為[14-15]。近期研究顯示，PVT1在DLBCL中呈高表達，敲低PVT1能降低DLBCL細胞的增殖能力[16]。本研究結果顯示，PVT1在DLBCL組織和細胞中均高表達，與上述研究結果一致[16]。選取表達最高的TMD8細胞敲低PVT1表達，觀察細胞增殖、細胞周期、細胞遷移和侵襲變化，結果顯示，與control組比較，si-PVT1組TMD8細胞增殖率、S期比例、遷移數、侵襲數均減少，G0/G1期比例增加，pcDNA-PVT1組各指標變化則相反，表明敲低PVT1表達能夠誘導TMD8細胞G0/G1期阻滯，抑制其增殖、遷移和侵襲，而過表達PVT1則促進TMD8細胞的增殖、遷移和侵襲。以上結果說明，PVT1在DLBCL進展中發揮促進作用。

LncRNA通過充當miRNA的海綿調控腫瘤細胞生物學過程。本研究應用RNA pull down和DLR實驗證實了PVT1可靶向miR-145-5p，并負調控其表達；此外，DLBCL組織和細胞中PVT1高表達的同時，miR-145-5p呈低表達；敲低PVT1后，miR-145-5p的表達上調。這些結果表明，PVT1可充當miR-145-5p海綿促進TMD8細胞的惡性生物學行為。本研究生物學預測顯示，miR-145-5p是CDK6的上游調控因子，DLR實驗證實了miR-145-5p與CDK6之間存在直接相互作用。本研究結果顯示，DLBCL組織和細胞中CDK6表達升高，敲低PVT1后，CDK6表達下調，且下調miR-145-5p可促進CDK6表達。以上結果表明，PVT1可通過調節miR-145-5p/CDK6軸影響DLBCL細胞的生物學活性。

綜上所述，敲低PVT1可抑制DLBCL細胞惡性生物學行為，其作用機制可能與miR-145-5p/CDK6有關。未結合動物體內實驗進一步驗證是本研究的不足之處，這是我們未來研究的重點。

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（本文編輯黃建鄉）