甘草查爾酮A對小鼠真菌性角膜炎的抗炎作用

［摘要］目的探討甘草查爾酮A（LA）在小鼠煙曲霉菌（AF）性角膜炎中的抗炎作用。方法采用CCK-8實驗檢測不同濃度的LA溶液（12、24、36、48、60 μmol/L）對小鼠來源巨噬細胞（RAW264.7）增殖活力的影響；采用免疫熒光法檢測AF感染后第3天小鼠角膜中性粒細胞的浸潤程度；使用實時熒光定量PCR和酶聯免疫吸附試驗方法檢測各組RAW264.7細胞中白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和血紅素加氧酶（HO-1）的mRNA及蛋白表達水平。結果60 μmol/L的LA對RAW264.7細胞沒有毒性（P＞0.05），并顯著降低感染后小鼠角膜的中性粒細胞浸潤（t=5.94，P＜0.01）；60 μmol/L的LA顯著下調AF誘導的IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA和蛋白表達（F=15.35～507.53，P＜0.001）并上調HO-1 mRNA表達（F=1 633.06，P＜0.001）。結論LA能夠通過減少中性粒細胞浸潤、下調炎癥因子表達和增強HO-1表達，在AF性角膜炎中起到抗炎作用。

［關鍵詞］角膜炎；甘草；黃酮類；煙曲霉菌；血紅素加氧酶-1；小鼠

［中圖分類號］R772.21［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0388-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.105［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240730.1336.005;2024-07-3109：44：21

Anti-inflammatory effect of Licochalcone A on fungal keratitis in mice TIAN Yiran， LUAN Junjie， ZHANG Yunfeng， PENG Xudong， YANG Shanshan （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effect of Licochalcone A（LA） on Aspergillus fumigatus （AF） keratitis in mice. MethodsCCK-8 assay was used to observe the effect of different concentrations of LA solution （12， 24， 36， 48， and 60 μmol/L） on the proliferative activity of murine macrophages （RAW264.7）; immunofluorescence assay was used to measure the degree of neutrophil infiltration in the cornea of mice on day 3 of AF infection; quantitative real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were used to measure the mRNA and protein expression levels of interleukin-6（IL-6）， interleukin-1β（IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and heme oxygenase （HO-1） in RAW264.7 cells. ResultsLA at the concentration of 60 μmol/L had no toxicity to RAW264.7 cells （Pgt;0.05） and significantly reduced neutrophil infiltration in the cornea after infection （t=5.94，Plt;0.01）. LA at the concentration of 60 μmol/L significantly downregulated the mRNA and protein expression levels of IL-6， IL-1β， and TNF-α induced by AF（F=15.35-507.53，Plt;0.001） and upregulated the mRNA expression of HO-1 （F=1 633.06，Plt;0.001）.ConclusionLA exerts an anti-inflammatory effect in AF infection by reducing neutrophil infiltration， downregulating the expression of inflammatory factors， and enhancing the expression of HO-1.

［Key words］keratitis; glycyrrhiza uralensis; flavonoids; Aspergillus fumigatus; heme oxygenase-1; mice

真菌性角膜炎（FK）是一種角膜感染性疾病，嚴重時可導致失明[1-2]。濫用廣譜抗生素、糖皮質激素和過度使用角膜接觸鏡，使FK的發病率明顯增加[2]。目前治療 FK 的常用抗真菌藥物（如納他霉素和伏立康唑）普遍存在耐藥性高、角膜毒性大以及角膜滲透率低等局限性[3-4]，因此，開發更有效的抗真菌治療方法具有重要意義。固有免疫是抵抗角膜感染的重要防線，但過度的免疫反應會導致角膜結構和功能損傷[5-8]，甚至穿孔[9-10]。由此可知，抑制過度的炎癥反應有利于減輕FK中與炎癥相關的角膜損傷。甘草查爾酮A（LA）是從甘草根中提取的一種酚類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化和神經保護等多種作用[11]。最近的研究發現，LA通過抑制白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達，在結腸炎和乳腺炎中發揮抗炎作用[12-13]，并可通過激活核因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶（HO-1）途徑抑制骨關節炎的炎癥反應[14]。本研究旨在探討LA在煙曲霉菌（AF）感染中的抗炎作用，為FK的治療提供新思路。現將結果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗對象健康的8周齡C57BL/6雌鼠購于山東濟南朋悅有限公司，按照美國眼科和視覺研究協會（ARVO）標準進行處理。RAW264.7細胞購自中國科學院上海分院，在含有體積分數0.10胎牛血清的DMEM中培養。

1.1.2主要實驗試劑將1 mg的LA（MCE公司，美國）溶于148 μL的二甲基亞砜（DMSO）中，以20 mmol/L的LA儲備液凍存于-20 ℃，后續用DMEM培養液將其稀釋至所需濃度，使稀釋后的DMSO體積分數為0.004 58。CCK-8檢測試劑盒由MCE公司提供；RNAex pro reagent由艾科瑞生物公司提供；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒由Biolegend公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1AF菌絲制備AF菌株（編號3.0772）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（北京），接種于含有沙氏培養液的錐形瓶中，在37 ℃、120 r/min條件下培養4～7 d，收獲菌絲，磨碎并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌。用體積分數0.75乙醇滅活（4 ℃，48 h）、定量并稀釋至合適濃度（1×1011 CFU/L）。

1.2.2小鼠分組及處理將C57BL/6小鼠隨機分為LA處理組及DMSO對照組，每組6只小鼠。小鼠以0.4 mL/kg腹腔注射80 g/L水合氯醛麻醉，用無菌微量注射器進行基質內注射：將2.5 μL的AF分生孢子懸液（2.5×1010 CFU/L）裝入注射器后，將其斜插入右眼角膜中央的基質中層水平。感染后第1天，給予實驗眼5 μL的LA（60 μmol/L）治療，對照眼用5 μL體積分數為0.004 58的DMSO溶液點眼，每日3次，每次間隔4 h。感染后第3天，用頸椎脫臼法處死所有小鼠，將每組6個眼球分別置于OCT包埋劑中，液氮冷凍。

1.2.3細胞分組及處理首先將RAW264.7細胞接種到6孔板或12孔板中，在顯微鏡下觀察以確保細胞均勻貼壁并放置于無菌培養箱（37 ℃， 體積分數0.05 CO2）中培養。細胞在約80%匯合時進行處理。確保細胞無污染后，將細胞隨機分為空白對照組（N組）、LA處理組（LA組）、加菌組（AF組）和加菌+LA處理組（AL組），每組設置6個復孔。加菌處理各組每孔加入60 μL滅活AF菌絲刺激1 h，LA處理各組加入終濃度為60 μmol/L的LA溶液，分別在8、24 h收集細胞和細胞上清液用于后續實驗。

1.2.4CCK-8實驗將小鼠巨噬細胞（RAW264.7）接種于96孔板中，按照上述方法培養。PBS漂洗后，吸去孔內原有液體，分別加入100 μL不同濃度的LA/F12培養液（12、24、36、48、60 μmol/L），空白對照組加入100 μL的細胞培養液，溶劑對照組加入含體積分數0.004 58 DMSO的細胞培養液，每組設置6個復孔。孵育24 h后，在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8（索萊寶，北京），并在培養箱中孵育2 h，用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度。

1.2.5免疫熒光染色用冰凍切片機將小鼠眼球切成9 μm厚切片，放入甲醇中固定。冰凍切片用山羊血清封閉30 min，隨后加入抗NIMP-R14（Santa Cruz Biotechnology，1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜，次日滴加二抗（abcam，1∶500），37 ℃孵育1 h，應用PBS洗去未結合的二抗，即用型DAPI染色10 min，然后進行抗熒光衰減封片劑封片，并在熒光顯微鏡下拍照。用Image J定量分析軟件計算熒光強度。

1.2.6實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測炎癥因子及HO-1mRNA表達12孔板巨噬細胞用PBS洗滌3次后，每孔加入500 μL RNAex pro reagent裂解液裂解，用200 μL無菌黃槍頭充分研磨并收集細胞至EP管中，提取總RNA，使用HiScript Ⅲ RT Super Mix（南京諾唯贊公司）進行qRT-PCR反轉錄獲得cDNA。最后，使用qRT-PCR儀進行擴增反應。小鼠引物序列見表1。

1.2.7ELISA法檢測炎癥因子的蛋白表達收集RAW264.7細胞上清液并離心。采用ELISA試劑盒（Ramp;D Systems，美國）檢測IL-6、IL-1β和TNF-α的蛋白水平（每組6孔），根據說明書進行定量。在酶標儀450 nm波長處測定樣品的吸光度。

1.3統計學方法

使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0統計學軟件進行數據處理。所有實驗至少重復3次，所得計量資料數據以±s表示，兩組比較采用t檢驗，細胞毒性實驗結果比較采用單因素方差分析（One-way Anova），ELISA、qRT-PCR實驗結果比較采用析因設計的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1LA對RAW264.7細胞毒性的影響

為了確定LA的細胞毒性作用，將不同濃度的LA（12、24、36、48、60 μmol/L）與RAW264.7細胞孵育24 h，采用CCK-8法檢測細胞毒性。結果表明，12～60 μmol/L的 LA不會影響RAW264.7細胞的活力（P＞0.05）。見圖1。在接下來的實驗中，選用60 μmol/L作為研究濃度。

2.2LA對小鼠角膜組織中性粒細胞浸潤的影響

免疫熒光法檢測結果顯示，感染后第3天，與DMSO對照組比較，60 μmol/L的LA處理組角膜基質層中性粒細胞熒光信號顯著減少，差異具有統計學意義（t=5.94，P＜0.01）。見圖2。

Untreated為空白對照，DMSO為溶劑對照。

2.3LA對AF誘導的巨噬細胞中促炎因子以及HO-1 mRNA表達的影響

qRT-PCR檢測結果顯示，滅活菌處理（FAF=121.78～212.06，P＜0.001）、LA處理（FLA=7.58～89.80，P＜0.05）以及LA與滅活菌處理產生的交互效應（FLA×AF=7.78～89.75，P＜0.05）均影響RAW264.7細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達。滅活菌處理（FAF=1 225.95，P＜0.001）、LA處理（FLA=816.30，P＜0.001）以及LA與滅活菌處理產生的交互效應（FLA×AF=816.76，P＜0.001）也均影響HO-1 mRNA表達。單獨效應結果顯示，在未經滅活菌絲刺激時，LA處理與未處理對IL-6、IL-1β、TNF-α和HO-1 mRNA的表達沒有影響（P＞0.05）；經過滅活菌絲刺激后，LA處理組與未處理組相比，HO-1 mRNA表達水平升高（F=1 633.06，P＜0.001），炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平降低（F=15.35～179.55，P＜0.001）。在未經LA處理時，滅活菌絲刺激組IL-6、IL-1β、TNF-α和HO-1 mRNA表達較未刺激組升高，差異有統計學意義（F=20.70～216.22，P＜0.001）；經LA處理后，滅活菌絲刺激組IL-6、IL-1β、TNF-α和HO-1 mRNA表達較未刺激組明顯升高，差異有統計學意義（F=20.14～2 022.01，P＜0.001）。見表2。

2.4LA對AF誘導的巨噬細胞中促炎因子蛋白表達的影響

ELISA法檢測結果顯示，滅活菌處理（FAF=1 570.12～9 879.80，P＜0.001）、LA處理（FLA=78.46～255.38，P＜0.001）以及LA與滅活菌處理產生的交互效應（FLA×AF=79.50～252.16，P＜0.001）均影響RAW264.7細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達。單獨效應結果顯示，在未經滅活菌絲刺激時，LA處理與未處理對各炎癥因子的蛋白表達均無影響（P＞0.05）；經過滅活菌絲刺激后，LA處理組與未處理組相比，各炎癥因子的蛋白表達水平均有所下降（F=157.96～507.53，P＜0.001）。在未經LA處理時，滅活菌絲刺激組的各炎癥因子蛋白表達較未刺激組升高（F=1 284.21～5 865.91，P＜0.001）；經過LA處理后，滅活菌絲刺激組各炎癥因子蛋白表達較未刺激組升高（F=408.12～4 093.39，P＜0.001）。見表3。

3討論

AF是引起農業地區FK的最常見致病真菌之一[15]。然而，由于真菌侵襲性和毒力強、臨床診斷延遲以及長期使用抗生素誘導的耐藥性，FK的治療仍然面臨挑戰[16-17]。在真菌感染初期，致病真菌侵入角膜會促進免疫細胞（如中性粒細胞和巨噬細胞）的招募。這些細胞能夠殺死真菌，但促炎細胞因子和氧化應激的過度產生會造成角膜損傷，導致FK預后不良。因此，除了有效破壞致病真菌外，抑制過度炎癥也是有效治療FK的重要途徑[18]。

LA是甘草中的主要酚類成分，具有抗炎、抗氧化、神經保護及肝保護等特性[11，19-20]。研究發現，LA可以通過減少炎癥細胞浸潤以及抑制炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，減輕脂多糖誘導的小鼠乳腺炎的炎癥反應[13]。此外LA還可以通過阻斷NLRP3炎癥小體和減少IL-1β產生，減輕痤瘡丙酸桿菌誘導的耳組織炎癥和腫脹[21]。然而，LA在FK中的抗炎作用尚未有研究。本研究結果表明，12～60 μmol/L濃度的LA對RAW264.7細胞的活性沒有影響，故本文選擇60 μmol/L作為后續實驗的安全濃度。

角膜上皮損傷后，AF浸潤角膜上皮，大量炎癥細胞被募集到潰瘍部位釋放免疫活性物質，導致角膜炎癥、水腫和潰瘍[22]。炎癥是防御外界傷害的一種生理保護反應，但過度的炎癥反應會造成組織損傷并影響上皮愈合[23]。研究表明，LA對脂多糖誘導的小鼠肺損傷有保護作用，其機制可能與減少中性粒細胞浸潤有關[24]。本文結果顯示，與DMSO對照組相比，經LA處理的小鼠角膜在感染后第3天的中性粒細胞浸潤明顯減少。因此，LA對FK的治療作用可能是通過抑制中性粒細胞浸潤和減輕炎癥引起的角膜損傷來實現的。

HO-1在組織損傷后迅速增加，上調HO-1的表達可減輕角膜損傷后的炎癥反應[25]。本文研究結果顯示，AF刺激后，RAW264.7細胞中的HO-1 mRNA及蛋白表達量明顯升高，而LA治療后其表達水平進一步升高。提示LA可能通過上調FK中HO-1基因表達而發揮抗炎作用。IL-1β和TNF-α主要由活化的單核細胞產生，是參與角膜抗真菌免疫反應的重要促炎因子[26]。本文PCR檢測結果顯示，LA能顯著下調加菌組小鼠巨噬細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平。有研究證實，在骨關節炎模型中，LA可激活Nrf2/HO-1信號通路，從而減少下游炎癥因子IL-1β的表達[27]。這與本研究結果相一致，即與加菌組相比，LA處理組的促炎因子蛋白表達明顯下調。因此，LA也可能通過激活HO-1的表達，減少炎癥介質在FK中的過度表達，改善FK的預后。

綜上，LA能通過減少中性粒細胞浸潤、下調促炎因子和增強HO-1表達，在小鼠AF性角膜炎中發揮抗炎作用。LA對FK的具體保護作用及機制仍值得探討，LA有望成為治療FK的新型藥物。

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（本文編輯牛兆山）