漢黃芩素調節Hippo/YAP信號通路對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

摘要目的：探究漢黃芩素調節Hippo/Yes相關蛋白（YAP）信號通路對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌纖維化的影響。方法：采用腹腔注射阿霉素的方式構建大鼠CHF模型，成功造模36只大鼠，將其隨機分為模型組、漢黃芩素組（漢黃芩素100 mg/kg）、漢黃芩素＋維替泊芬組（100 mg/kg 漢黃芩素＋100 mg/kg 維替泊芬），每組12只。剩余12只大鼠作為對照組。采用彩色多普勒超聲系統檢測各組大鼠心功能參數：左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室收縮末期內徑（LVESD）；稱重并計算各組大鼠心臟質量指數（HMI）和左心室質量指數（LVMI）；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測心肌組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；Masson染色法檢測大鼠心肌膠原容積分數（CVF）和血管周圍纖維面積和血管管腔面積比值（PVCA/LA）；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織病理學變化；蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠心肌組織Hippo/YAP信號通路相關蛋白、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、結締組織生長因子（CTGF）表達。結果：與對照組相比，模型組大鼠LVEF、LVFS、心肌組織SOD水平及哺乳動物ste-20樣激酶（MST）1/2、大型腫瘤抑制因子（LATS）1/2磷酸化水平明顯降低（P＜0.05），LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌組織MDA水平、CVF、PVCA/LA、心肌組織YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯升高（P＜0.05），心肌組織出現大量膠原纖維沉積和損傷。與模型組相比，漢黃芩素組LVEF、LVFS、心肌組織SOD水平、MST1/2、LATS1/2磷酸化水平明顯升高（P＜0.05），LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌組織MDA水平、CVF、PVCA/LA、心肌組織YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯降低（P＜0.05），心肌組織膠原纖維沉積和損傷減少。維替泊芬增強了漢黃芩素對CHF大鼠心肌纖維化的改善作用。結論：漢黃芩素可能通過激活Hippo/YAP信號通路、抑制YAP表達來減輕CHF大鼠心肌纖維化。

關鍵詞慢性心力衰竭；心肌纖維化；漢黃芩素；Hippo/YAP信號通路；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.15.008

Effect of Wogonin on Myocardial Fibrosis in Rats with Chronic Heart Failure by Regulating Hippo/YAP Signaling Pathway

HUO Yujia， YANG Yuanzhou， ZOU Chengli， JIANG Zhongyong， LIU Quanwei

The Second People′s Hospital of Neijiang， Neijiang 641100， Sichuan， China

Corresponding AuthorLIU Quanwei， E-mail： dianyingc7@163.com

AbstractObjective：To explore the effect of Wogonin on myocardial fibrosis in rats with chronic heart failure（CHF） regulating Hippo/Yes associated protein（YAP） signaling pathway.Methods：The rat CHF model was established by intraperitoneal injection of adriamycin.Thirty-six rats were successfully modeling and randomly divided into model group，wogonin group（100 mg/kg baicalein） and wogonin ＋ vetipofen group（100 mg/kg baicalein ＋100 mg/kg vetipofen），with 12 rats in each group.The remained 12 rats served as the control group.Left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular brachyaxis shortening rate（LVFS），left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD） and left ventricular end-systolic diameter（LVESD） were measured by color Doppler ultrasound.Heart mass index（HMI） and left ventricular Mass index（LVMI） were detected.The levels of superoxide dismutase（SOD） and malondialdehyde（MDA） in myocardial tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Masson staining was used to detect myocardial collagen volume fraction（CVF） and the ratio of perivascular fiber area to vascular lumen area（PVCA/LA）.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the histopathological changes of rat myocardium.The expressions of Hippo/YAP signaling pathway related proteins，matrix metalloproteinase（MMP-2），MMP-9 and connective tissue growth factor（CTGF） were detected by Western Blot.Results：Compared with the control group，LVEF，LVFS，SOD in myocardial tissue and the phosphorylation levels of STE-20-like kinase（MST） 1/2 and large tumor suppressor factor（LATS）1/2 in the model group significantly decreased（P＜0.05），LVEDD，LVESD，HMI，LVMI，MDA，CVF，PVCA/LA，YAP，MMP-2，MMP-9，and CTGF protein expressions in myocardial tissue significantly increased（P＜0.05），and a large number of collagen fiber deposition and injury appeared in myocardial tissue.Compared with the model group，LVEF，LVFS，SOD，MST1/2 and LATS1/2 phosphorylation in myocardial tissue in the wogonin group significantly increased（P＜0.05），LVEDD，LVESD，HMI，LVMI，MDA，CVF，PVCA/LA，YAP，MMP-2，MMP-9，and CTGF protein expressions in myocardial tissue significantly decreased（P＜0.05），and collagen fiber deposition and injury in myocardial tissue decreased.Vitipofen enhanced the ameliorative effect of wogonin on myocardial fibrosis in CHF rats.Conclusion：Wogonin might reduce myocardial fibrosis in CHF rats by activating Hippo/YAP signaling pathway and inhibiting the expression of YAP.

Keywordschronic heart failure; myocardial fibrosis; Wogonin; Hippo/YAP signaling pathway; experimental study

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種心室結構和功能異常引起的心室射血功能減少的綜合征，主要由于冠心病、高血壓等心血管疾病進展而誘發，是各種心血管疾病的終末階段［1-2］。CHF的臨床表現為心肌收縮功能和心排血量下降，機體組織血液供應減少，病人自理能力降低，嚴重影響著病人的健康和生活質量［3］。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是CHF的重要病理學基礎之一，是指心臟基質內膠原纖維大量聚集、膠原含量增加或膠原成分發生變化的現象，可導致CHF的發生發展和心功能的惡化［4-5］。因此，減輕CHF病人的心肌纖維化進程，可能是治療CHF的有效方式之一。漢黃芩素（Wogonin）是從黃芩中提取出的一種重要的黃酮類化合物，研究發現漢黃芩素具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、心血管保護等作用［6-8］。Shi等［9］研究發現，漢黃芩素作為一種抗氧化劑可治療心肌肥厚。但漢黃芩素是否能減輕CHF病人的心肌纖維化還尚不清楚。Hippo/Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）信號通路是一個高度保守的絲氨酸激酶級聯通路，能夠調節癌細胞等的存活和生長［10］。YAP是其下游關鍵的效應器和信號調節介質，在細胞增殖、凋亡等過程中發揮重要作用［11］。近年來，研究發現Hippo/YAP信號通路在肝纖維化的發生發展和進展期具有重要調節作用，但是否參與CHF病人心肌纖維化進程尚未明確。本研究通過構建大鼠CHF模型，觀察漢黃芩素對CHF大鼠心肌纖維化的影響，并分析其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

48只無特定病原體（SPF）級SD大鼠，雄性，8～10周齡，體質量180～220 g，購自湖南遠泰生物技術有限公司，許可證號為SYXK（湘）2020-0004。所有大鼠飼養在溫度20～23 ℃、相對濕度45%～60%、12 h光/暗循環的通風實驗室中，標準大鼠顆粒飼料喂養，大鼠自由獲取食物和水，適應性飼養1周后用于實驗。本實驗經內江市第二人民醫院動物倫理委員會審核批準，實驗操作符合《實驗動物管理條例》相關要求和3R原則。

1.2主要試劑與儀器

漢黃芩素（純度≥98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；YAP抑制劑維替泊芬（verteporfin）購自美國MedChemExpress公司；注射用鹽酸阿霉素購自浙江海正藥業股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondial dehyde，MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海科匯生物技術有限公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自美國EMD Millipore公司；哺乳動物ste-20樣激酶（mammalian sterile 20-like，MST）1/2、磷酸化MST1/2（p-MST1/2）、大型腫瘤抑制因子（large tumor suppressor，LATS）1/2、磷酸化LATS1/2（p-LATS1/2）、YAP、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和相應二抗購自Abcam公司。小動物彩色多普勒超聲影像系統（Vevo2100）購自加拿大Visualsonics公司。

1.3建立大鼠CHF模型

采用腹腔注射阿霉素的方式構建大鼠CHF模型［12］。每只大鼠腹腔注射鹽酸阿霉素注射液，劑量為4 mg/kg，連續注射6周，每周注射1次。末次注射后采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經彩色多普勒超聲測定每只大鼠左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），當LVEF≤60%時，說明大鼠CHF模型建立成功。

1.4動物分組與給藥

本實驗共成功造模36只大鼠，將其隨機分為模型組、漢黃芩素組（漢黃芩素100 mg/kg［13］）、漢黃芩素＋維替泊芬組（100 mg/kg 漢黃芩素＋100 mg/kg 維替泊芬［14］），每組12只。剩余12只大鼠作為對照組。造模成功后漢黃芩素組灌胃給藥漢黃芩素100 mg/kg，每日1次，共給藥4周；漢黃芩素＋維替泊芬組灌胃給藥漢黃芩素100 mg/kg，每日1次，腹腔注射維替泊芬100 mg/kg，隔天給藥，共給藥4周。對照組、模型組灌胃和腹腔注射等量生理鹽水。

1.5檢測指標及方法

1.5.1心功能參數

末次給藥后，使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥固定，局部剃毛后涂抹超聲耦合劑，使用彩色多普勒超聲系統檢測大鼠心功能參數。包括LVEF、左室短軸縮短率（left ventricular shortening fraction，LVFS）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）。測定3個心動周期取平均值。

1.5.2心臟質量指數（heart mass index，HMI）和左心室質量指數（left ventricular mass index，LVMI）

測定心功能參數后，脫頸處死所有大鼠。解剖取出心臟，采用4 ℃的生理鹽水清洗干凈心臟殘血，用濾紙吸干水分。稱重心臟和左心室的質量，計算HMI和LVMI。HMI＝心臟質量（mg）/體質量（g）；LVMI＝左心室質量（mg）/體質量（g）。

1.5.3ELISA法檢測大鼠心肌組織SOD、MDA水平

稱重后的心臟，一半立即放入4%多聚甲醛中固定48 h，另一半置于－80 ℃凍存。取凍存的心肌組織制備組織勻漿。根據SOD、MDA ELISA試劑盒說明書，測定各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平。

1.5.4Masson染色觀察大鼠心肌組織纖維化程度

取4%多聚甲醛固定的大鼠心肌組織，進行乙醇脫水、常規的石蠟包埋，切片（5 μm），根據Masson染色試劑盒進行Masson染色，在顯微鏡下進行觀察，檢測大鼠心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）及血管周圍纖維面積和血管管腔面積比值（perivascular collagen area/lumen area，PVCA/LA）［15］。CVF＝心肌間質膠原面積/心肌組織總面積（視野內）×100%；PVCA/LA＝血管周圍纖維面積/血管管腔面積×100%。

1.5.5HE染色觀察大鼠心肌組織病理學變化

取4%多聚甲醛固定的大鼠心肌組織，進行乙醇脫水、常規的石蠟包埋，切片（5 μm），進行HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組織的病理學變化。

1.5.6蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠心肌組織Hippo/YAP信號通路相關蛋白、MMP-2、MMP-9、CTGF表達

取凍存的大鼠心肌組織，加入RIPA裂解液提取組織的總蛋白。根據BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白的濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在37 ℃下用5%脫脂奶粉封閉2 h，將膜與一抗MST1/2（1∶1 000）、p-MST1/2（1∶1 000）、LATS1/2（1∶1 000）、p-LATS1/2（1∶1 000）、YAP（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、CTGF（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）于4 ℃下孵育過夜，之后加入相應二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h后，加入增強化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL），觀察拍照，利用Image Lab軟件計算目標蛋白的灰度值。

1.6統計學處理

采用Graph Pad Prism 9.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠心功能參數比較

與對照組相比，模型組大鼠LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05），LVEDD、LVESD明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，漢黃芩素組、漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.05），LVEDD、LVESD明顯降低（P＜0.05）；與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.05），LVEDD、LVESD明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2各組大鼠HMI、LVMI比較

與對照組相比，模型組大鼠HMI、LVMI明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢黃芩素組、漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠HMI、LVMI明顯降低（P＜0.05）；與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠HMI、LVMI明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平比較

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織SOD水平明顯降低（P＜0.05），MDA水平明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，漢黃芩素組、漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠MDA水平明顯降低（P＜0.05），SOD水平明顯上升（P＜0.05）；與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠MDA水平明顯降低（P＜0.05），SOD水平明顯上升（P＜0.05）。詳見表3。

2.4各組大鼠CVF和PVCA/LA比較

Masson染色觀察大鼠心肌組織的膠原纖維沉積，對照組大鼠心肌組織未見明顯的膠原纖維沉積，模型組大鼠心肌細胞和血管周圍可見有大量的被染成藍色的膠原纖維。與模型組相比，漢黃芩素組大鼠心肌組織中可見少量的膠原纖維沉積。與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠心肌細胞和血管周圍的膠原纖維減少。詳見圖1。

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織CVF、PVCA/LA明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢黃芩素組、漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠心肌組織CVF、PVCA/LA明顯降低（P＜0.05）；與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組心肌組織CVF、PVCA/LA明顯降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.5漢黃芩素對大鼠心肌組織病理學的影響

對照組大鼠心肌組織細胞排列整齊、結構正常完整，橫紋正常；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，出現腫脹、心肌橫紋消失溶解，胞漿空泡樣變，心肌組織纖維化明顯，有明顯炎性細胞浸潤；與模型組相比，漢黃芩素組個別心肌細胞出現腫脹，心肌纖維排列較整齊，心肌纖維化減輕，炎性細胞浸潤減輕；與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組心肌組織結構清楚、排列整齊，炎性細胞浸潤和心肌纖維化減輕。詳見圖2。

2.6各組大鼠心肌組織Hippo/YAP信號通路相關蛋白、MMP-2、MMP-9、CTGF表達比較

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織p-MST1/2/MST1/2、p-LATS1/2/LATS1/2明顯降低（P＜0.05），YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，漢黃芩素組、漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠心肌組織p-MST1/2/MST1/2、p-LATS1/2/LATS1/2明顯升高（P＜0.05），YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。與漢黃芩素組相比，漢黃芩素＋維替泊芬組大鼠心肌組織p-MST1/2/MST1/2、p-LATS1/2/LATS1/2差異無統計學意義（P＞0.05），YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。詳見表5、圖3。

3討論

CHF是導致心血管疾病病人死亡的主要原因之一，主要的病理特征為心肌纖維化、心肌細胞肥大、心肌細胞凋亡等，其中心肌纖維化是CHF病人心室重構的重要組成［16］。當病人發生心肌纖維化時，心肌組織間質的膠原纖維合成增加，降解減少，進而促進膠原大量合成和分泌，使CVF明顯增加且排列紊亂，過量的心肌膠原沉積，導致心室順應性降低或充盈異常，心肌的舒張和收縮功能出現障礙［17］。LVEF、LVESD和LVEDD常用于評價心肌局部或整體的收縮功能。SOD是抗氧化酶，可以清除機體自由基，當發生CHF時，氧化應激反應增強，SOD含量可以間接反映心肌纖維化的發生［4］。研究發現，MMP是反映心肌纖維化的重要標志物，當MMP表達增加后，可能引起細胞外基質中膠原蛋白的過度降解，加重心肌纖維化［18］。CTGF具有絲裂原性和趨化性，能夠誘導成纖維細胞的增殖，在心肌纖維化的發生發展中發揮重要作用，其表達一定程度反映心肌纖維化的進展。本研究通過連續腹腔注射阿霉素建立大鼠CHF模型，結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠LVEF、LVFS、心肌組織SOD水平明顯降低，LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌組織MDA水平及CVF、PVCA/LA、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯升高，心肌組織出現大量膠原纖維沉積，心肌細胞排列紊亂，出現腫脹、心肌橫紋消失溶解，胞漿空泡樣變，有明顯炎性細胞浸潤。說明大鼠CHF模型建立成功。

漢黃芩素是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，目前已有研究證實漢黃芩素能夠干預各種心血管疾病和細胞纖維化等。李曼等［19］研究發現，漢黃芩素能夠抑制類風濕關節炎的成纖維樣滑膜細胞增殖，誘導細胞凋亡，下調炎性因子白細胞介素-6（IL-6）等。瞿晶田等［20］研究發現，漢黃芩素可能通過促進血管內皮細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達和一氧化氮（NO）的產生，增強乙酰膽堿對血管的舒張作用。Wei等［21］研究發現，漢黃芩素可以通過線粒體釋放細胞色素C，減少心肌細胞凋亡，減輕阿霉素誘導的心臟毒性。本研究結果顯示，與模型組相比，漢黃芩素組LVEF、LVFS、心肌組織SOD水平明顯升高，LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌組織MDA水平及CVF、PVCA/LA、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表達明顯降低，個別心肌細胞出現腫脹，心肌纖維排列較整齊，心肌纖維化減輕，炎性細胞浸潤減輕。說明漢黃芩素可以減輕CHF大鼠的心肌纖維化。

Hippo/YAP信號通路主要參與細胞的增殖、分化和遷移，當心臟處于應激狀態，該通路被激活，從而磷酸化MST1，磷酸化的MST1可以磷酸化下游激酶LATS1/2，最后使下游轉錄激活因子YAP磷酸化，磷酸化后的YAP滯留在細胞質中，抑制了YAP的轉錄活性［21］。研究發現，Hippo信號通路的抑制與核心因子YAP的異常激活會導致炎癥、纖維化、癌癥、心血管疾病等［22-24］。Mia等［25］研究發現，YAP的異常激活增強了心肌梗死誘導的心臟纖維化和心室重建。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織p-MST1/2/MST1/2、p-LATS1/2/LATS1/2明顯降低，YAP蛋白表達明顯升高；與模型組相比，漢黃芩素組大鼠心肌組織p-MST1/2/MST1/2、p-LATS1/2/LATS1/2明顯升高，YAP蛋白表達明顯降低。說明漢黃芩素可能通過激活Hippo/YAP信號通路，抑制YAP表達來減輕CHF大鼠心肌纖維化。為了驗證此作用，本研究用YAP抑制劑維替泊芬來干預漢黃芩素組大鼠，結果發現維替泊芬增強了漢黃芩素對CHF大鼠心肌纖維化的改善作用。

綜上所述，漢黃芩素可能通過激活Hippo/YAP信號通路，抑制YAP表達來減輕CHF大鼠心肌纖維化。本研究為改善CHF病人的心肌纖維化提供了新的治療靶點，進一步豐富了對心肌纖維化分子機制的認識。然而漢黃芩素減輕CHF大鼠的心肌纖維化的具體分子機制還需進一步研究。

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（收稿日期：2023-02-06）

（本文編輯郭懷印）