基于黏性末端鏈置換擴增的電化學發光/電化學比率傳感器用于miRNA檢測

摘要 基于黏性末端鏈置換（TMSD）非酶擴增技術構建了一種簡單、高靈敏的電化學發光/電化學比率傳感方法用于miRNA 的檢測。本方法以修飾在電極上的亞甲基藍（MB）產生的EC 信號作為內參比信號，并將Ru（phen）32+嵌入到通過分支雜交鏈式反應（bHCR）產生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標物存在時，MB 脫離電極表面并使ECL 信標修飾在電極上，從而使EC 信號減弱， ECL 信號增強，采用ECL 和EC 信號比值（ECL/EC）作為輸出信號，降低了潛在干擾，提高了傳感器的重現性和靈敏度。體系的ECL/EC 比值與miRNA-21 的濃度在10 fmol/L～500 pmol/L 范圍內具有良好的響應，檢出限為6.5 fmol/L。與單一使用ECL 信號的方法相比，在測定1 pmol/L 的miRNA 目標物時，響應信號的相對標準偏差從8.2%下降到4.1%。本方法成功應用于復雜細胞樣品中miRNA-21 的檢測。

關鍵詞 電化學；電化學發光；比率傳感器；黏性末端鏈置換；miRNA

液體活檢作為體外診斷方法的重要分支，在臨床中的應用日趨成熟，可用于腫瘤的早期診斷以及治療效果的動態監測與預后判斷[1-3]。miRNA 是臨床檢測中的重要的標志物，經典的miRNA 檢測方法為逆轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-qPCR），具有良好的靈敏度[4]，然而其操作步驟相對繁瑣，并且需要嚴格精確的控溫設備以及專業的操作人員，限制了其在臨床中的廣泛應用[5]。因此，開發靈敏度高、可靠且簡單方便的miRNA 檢測技術在腫瘤分子診斷方面具有重要的意義。

電化學發光（Electrochemiluminescence， ECL）具有高信噪比、高靈敏度、設備簡單以及操作簡便等優勢[6-7]，廣泛應用于疾病標志物的分析檢測，將ECL 與信號放大技術相結合的傳感器展現出極高的檢測靈敏度[8-9]。傳統的ECL 核酸生物傳感器的構建通常需在電極表面修飾DNA 探針，因此，傳感器的重現性受到傳感界面的有效面積、DNA 探針的分布和密度、電極界面的性質以及相關試劑用量等因素的影響[10]。比率傳感器通過利用內部或外部參比信號校正，能有效消除非特異性干擾所引起的信號偏差，進而提高傳感器的重現性[11-12]。Zhu 等[13]將ECL 信號與電化學（Electrochemistry， EC）信號的比值作為讀出信號，制備了一種高精度、高重復性的比率生物傳感器，用于miRNA-133a 的超靈敏檢測。其中，亞甲基藍（MB）的EC 信號與目標物miRNA 的濃度無關，僅用于監測電極表面的實時狀態，以此校正信號干擾。該傳感器具有良好的分析性能，對急性心肌梗塞（AMI）的早期診斷具有良好的應用潛力。

本研究基于一種典型的非酶依賴且不需精確控溫的核酸擴增技術—黏性末端鏈置換擴增（Toeholdmediatedstrand displacement， TMSD）技術[14-15]，構建了一種簡單、靈敏和重現性良好的電化學發光/電化學比率傳感器用于miRNA 檢測。此傳感器采用電極上修飾的MB 產生的EC 信號作為內部參比信號，以校正電極表面探針修飾的不均勻性；以MB 修飾的DNA 作為EC 探針，并將Ru（phen）32+ 嵌入到通過分支雜交鏈式反應（Branched hybridization chain reaction， bHCR）產生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標物存在時， EC 信號減弱， ECL 信號增強， ECL 和EC 信號比值（ECL/EC）與目標物濃度具有相關性。采用ECL/EC 信號比值作為輸出信號，可以減少干擾、提高傳感器的靈敏度和重現性。TMSD 作為一種非酶信號放大技術，可以有效地放大目標信號，同時避免了酶基方法易受環境變化影響的問題。