定量核磁共振氫譜法測定肺炎球菌莢膜多糖中C多糖雜質的含量

摘要 建立了核磁共振氫譜（1H NMR）法測定肺炎球菌莢膜多糖中C 多糖雜質（C-polysaccharide， C-Ps）含量的方法。通過二維1H-15N 異核多鍵相關（HMBC）譜確定δH 3.24 為C-Ps 的特征峰。以3 種血清型肺炎球菌莢膜多糖6A、6B 和10A 為樣品、二甲基亞砜為內標物，建立了C-Ps 絕對定量分析方法，并進行了方法學驗證。結果表明， C-Ps 濃度在2.5～198 μg/mL 范圍內線性關系良好（R2gt;0.999），檢測方法的定量限為2.5 μg/mL；加標回收率在102%～109%之間；重復性相對標準偏差（RSD）小于3%， 5 d 內穩定性RSD 小于1%。本分析方法操作簡單，重復性和普適性良好，可作為肺炎球菌莢膜多糖研發和生產中C-Ps 雜質的檢測方法，為質檢控制提供了新方法和新思路。

關鍵詞 定量核磁共振氫譜；肺炎球菌莢膜多糖；C多糖雜質；磷酸膽堿；質量控制

肺炎球菌是引起全球不同年齡人群，尤其是幼兒和老年人肺炎、中耳炎、支氣管炎、腦膜炎和敗血癥等嚴重疾病的重要病原菌，其中，侵襲性肺炎球菌疾病具有很高的致死率[1-2]。肺炎球菌莢膜多糖是肺炎球菌細胞壁外莢膜的主要組成成分，具有免疫原性，可在人體內誘導產生特異性抗體，阻止肺炎球菌的感染。目前，接種以肺炎球菌莢膜多糖為主要抗原成分的疫苗是預防肺炎球菌性疾病的有效措施[3-4]。根據莢膜多糖組成結構的不同，已鑒別出96 種不同血清型肺炎球菌。針對成人使用的23 價肺炎球菌莢膜多糖疫苗由常見的致病率高的23 種血清型肺炎球菌的莢膜多糖組成。

目前，肺炎球菌莢膜多糖主要通過不同肺炎球菌菌株進行發酵生產純化制備。肺炎球菌的C 多糖（C-polysaccharide， C-Ps）是所有肺炎球菌共有的細胞壁組成成分，經由核糖醇磷酸二酯鍵與莢膜多糖及細胞壁肽聚糖相連。C-Ps 由重復的五糖單元組成，其分子結構和大小與肺炎球菌莢膜多糖類似。因此，在肺炎球菌莢膜多糖的生產純化過程中很難將C-Ps 完全去除[5]，甚至可能會含有大量的C-Ps。C-Ps 具有高度的免疫原性，但是C-Ps 抗體并不具有保護性[6]。當使用蒽酮硫酸這類顯色方法對肺炎球菌莢膜多糖進行含量測定時，并不能區分肺炎球菌莢膜多糖與C-Ps 的顯色差別，給準確評價有效抗原含量帶來困難。C-Ps 在肺炎球菌莢膜多糖疫苗生產中被視為雜質項，世界衛生組織（WHO）目前也將C-Ps 列為肺炎球菌莢膜多糖疫苗的雜質[7]。因此， C-Ps 雜質的定性和定量檢測在肺炎球菌莢膜多糖疫苗研發和生產過程中具有重要意義。

C-Ps 是由β-D-葡萄糖（A）、2-氮乙酰-4-氨基-2，4，6-三脫氧-α-D-半乳糖（B）、2-氮乙酰-2-脫氧-α-D-半乳糖（C）、2-氮乙酰-2-脫氧-β-D-半乳糖（D）和磷酸核糖醇（E）五糖重復單元組成，重復單元間由磷酸二酯鍵連接。C-Ps 區別于肺炎球菌莢膜多糖最主要的特征是在重復單元的C、D 單糖殘基6 位上含有磷酸膽堿基團（Phosphocholine， P-Cho）。磷酸膽堿基團主要以兩種取代方式存在[8]，一種是僅在C 單糖殘基上的單取代，另一種是在C、D 單糖殘基上的雙取代（見圖1）。

目前，關于C-Ps 定量檢測方法的文獻報道很少，在實際的研發和生產過程中，多采用離子色譜法和酶聯免疫吸附分析（ELISA）法。其中， HPAEC-PAD 離子色譜法利用C-Ps 中存在的核糖醇片段（E），采用酸對C-Ps 進行多次水解，然后檢測水解產物中核糖醇的含量，以此間接計算C-Ps 的含量。該方法前處理復雜，而且6A、6B 和10A 這3 種血清型莢膜多糖結構中本身也含有核糖醇片段，因此無法準確檢測C-Ps含量[5，9]。此外，還有研究者采用C-Ps 單克隆抗體，利用速率比濁法檢測C-Ps 含量[10]；或者采用ELISA法，利用抗體與抗原的特異性結合檢測C-Ps 含量。這兩種生物學方法都存在檢測時間長、成本高、專一性和重復性差等問題。