抑制MAPK14通過減輕線粒體自噬改善AngⅡ誘導(dǎo)的心房顫動

【摘要】目的 探討絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的大鼠心房顫動（AF）中的作用及潛在機(jī)制。方法 構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF易感模型，使用SB203580抑制MAPK14的表達(dá)，采用彩色超聲顯像儀器評估左心房內(nèi)徑和左室射血分?jǐn)?shù)等；電生理儀檢測心房有效不應(yīng)期、AF誘發(fā)率及AF平均持續(xù)時間等電生理指標(biāo)；透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)；Masson染色檢測左心房纖維化程度；免疫組織化學(xué)染色檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3表達(dá)；Western blot檢測MAPK14、p-MAPK14和線粒體自噬標(biāo)志parkin及P62的表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，AngⅡ組大鼠心房組織中MAPK14和p-MAPK14表達(dá)上調(diào)（P均lt;0.005）。與AngⅡ組相比，抑制MAPK14能夠改善AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時間（P均lt;0.000 5），并減輕大鼠心房組織的線粒體自噬（P均lt;0.05），且顯著改善心臟和線粒體結(jié)構(gòu)受損（P均lt;0.05）。結(jié)論 抑制MAPK14可通過減輕線粒體自噬改善AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF。

【關(guān)鍵詞】心房顫動；線粒體自噬；絲裂原激活蛋白激酶14；血管緊張素Ⅱ

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.04.019

Inhibition of MAPK14 Improves AngⅡ-Induced Atrial Fibrillation

by Reducing Mitophagy

WANG Lu¹，SANG Wanyue¹，JIAN Yi¹，HAN Yafan²，WANG Feifei¹，LI Yaodong¹

（1.Department of Pacing and Electrophysiology，Xinjiang Key Laboratory of Cardiac Electrophysiology and Remodeling，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China；2.Shandong First Medical University Affiliated Provincial Hospital，Jinan 250117，Shandong，China）【Abstract】Objective To explore the role and potential mechanism of mitogen-activation protein kinase 14（MAPK14） in angiotensin Ⅱ（AngⅡ）-induced atrial fibrillation （AF） in rats.Methods To establish a rat model of AF susceptibility induced by Ang Ⅱ，SB203580 was used to inhibit the expression of MAPK14.The left atrial dimension and left ventricular ejection fraction were evaluated by color Doppler ultrasound.Electrophysiological indexes such as atrial effective refractory period，AF induction rate and average duration of AF were measured by electrophysiological instrument.The structure of mitochondria was observed by transmission electron microscope.The degree of left atrial fibrosis was detected by Masson staining.The expression of LC3 was detected by immunohistochemical staining.The expression levels of MAPK14，p-MAPK14，mitophagy markers parkin and P62 were detected by Western blot.Results Compared with the control group，the expression of MAPK14 and p-MAPK14 in atrial tissue of AF rats was up-regulated in Ang Ⅱ group （Plt;0.005）.Compared with Ang Ⅱ group，inhibition of MAPK14 could improve the induction rate of AF and the duration of AF （Plt;0.000 5），reduce mitophagy in rat atrium （Plt;0.05），and significantly improve the structural damage of heart and mitochondrial （Plt;0.05）.Conclusion Inhibition of MAPK14 could improve AngⅡ-induced AF of rats by reducing mitophagy.

【Keywords】Atrial fibrillation；Mitophagy；Mitogen-activation protein kinase 14；Angiotensin Ⅱ

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是一種全球流行性心律失常，其逐年上升的發(fā)病率、致殘率和死亡率加重了家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)^[1-2]。眾所周知，心肌細(xì)胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、自噬、線粒體自噬和自主神經(jīng)功能障礙終將導(dǎo)致心律失常，這對AF的發(fā)生發(fā)展具有重要意義^[3]。線粒體自噬是一種自噬反應(yīng)，專門針對因受損而具有潛在細(xì)胞毒性的線粒體，它在線粒體質(zhì)量控制和線粒體功能維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用^[4-5]。雖然線粒體自噬和AF間的關(guān)系已有少量研究，但研究結(jié)果仍存在爭議。有研究^[6-7]表明，AF時線粒體自噬受損導(dǎo)致毒性產(chǎn)物積累、線粒體膜電位崩潰，最終使心肌細(xì)胞死亡。相反，也有研究^[8-10]表明，線粒體過度自噬繼發(fā)的氧化應(yīng)激、能量代謝失調(diào)及鈣穩(wěn)態(tài)失衡等效應(yīng)促進(jìn)了AF的發(fā)展。因此，本研究擬進(jìn)一步探討二者間的關(guān)系。

絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）14，又稱p38α-MAPK，是MAPK家族中的一員，也被稱為細(xì)胞因子抑制性抗炎藥物結(jié)合蛋白，是一種滲透調(diào)節(jié)蛋白激酶，其激活受多種類型的細(xì)胞應(yīng)激刺激^[11-12]。既往研究^[13-15]表明，MAPK14一旦受細(xì)胞外刺激而激活，即可磷酸化多種底物從而調(diào)節(jié)線粒體自噬、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞功能，使線粒體自噬靶標(biāo)帕金蛋白（parkin）和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）表達(dá)上調(diào)的同時使自噬選擇性底物P62降解。

本課題組前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在AF樣本中被顯著富集和激活，同時發(fā)現(xiàn)MAPK14在AF風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的構(gòu)成中起重要作用，提示其可能是AF進(jìn)展的潛在靶標(biāo)^[16]。盡管已有部分研究^[17-20]證實(shí)，MAPK14通過介導(dǎo)心房纖維化、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與AF進(jìn)程，但其介導(dǎo)的線粒體自噬在AF中的潛在作用目前尚無報(bào)道。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）作為主要的纖維原性細(xì)胞膜受體，可通過直接激活成纖維細(xì)胞合成并釋放促纖維化介質(zhì)，也可通過誘導(dǎo)線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）從而激活促纖維化的信號分子，直接參與AF、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)^[21-22]。目前，利用AngⅡ構(gòu)建的大鼠AF易感模型已得到廣泛認(rèn)可^[23-24]，因此，本研究擬利用此模型探索MAPK14在AF中的作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

本研究遵從《美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物研究指南》，并通過中國新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（批號：A2310-20）。40只（5±1）周齡的健康成年雄性Sprague Dawley大鼠購自中國新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，體重（230±20）g，隨機(jī)分為4組（每組10只）：對照（CT）組、CT+MAPK14抑制劑SB203580（CS）組、AngⅡ誘導(dǎo)AF（AngⅡ）組和AngⅡ+SB203580（AS）組。AngⅡ組和AS組采用AngⅡ（0.15 mg·kg^-1·d^-1，腹腔注射持續(xù)3周）誘導(dǎo)的大鼠AF易感模型^[23-24]，另外兩組注射同等劑量的生理鹽水；造模結(jié)束后CS組和AS組注射MAPK14抑制劑SB203580（0.5 mg·kg^-1·d^-1，腹腔注射持續(xù)2周）進(jìn)行干預(yù)治療^[25-26]，另外兩組注射同等劑量的生理鹽水。

1.2 材料與試劑

多道生理記錄儀（LEAD7000，四川錦江電子），呼吸機(jī)（R407，深圳瑞沃德），多集電極（Millar 1.1F，美國美敦力），自動研磨儀（Tissvelyser-24L，上海凈信），電子壓片成像儀（e-BLOT，上海易孛特光電）。一抗：抗MAPK14抗體（1：1 000，14064-1-AP，武漢三鷹），抗磷酸化的MAPK14（p-MAPK14）抗體（1：2 000，28796-1-AP，武漢三鷹），抗parkin抗體（1：4 000，66674-1-Ig，武漢三鷹），抗P62抗體（1：1 000，sabbiotech，abcam），抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（1：10 000，AB-P-R 001，杭州賢至），抗LC3抗體（1：100，14600-1-AP，武漢三鷹）。山羊抗兔二抗（1：10 000，A0208，上海碧云天）及山羊抗鼠二抗（1：10 000，SA00001-1，武漢三鷹）。

1.3 超聲心動圖評估

使用新鮮配制的2%戊巴比妥鈉以腹腔注射（劑量50 mg/kg）的方式麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，使用彩色超聲顯像儀器（HD11XE，美國飛利浦）。探頭（L15-7io、S12-4）置于胸骨旁左室長軸切面，在二維超聲引導(dǎo)下，行M型超聲觀察其心臟結(jié)構(gòu)，分別于基線期和5周末測量心率（heart rate，HR）、左心房內(nèi)徑（left atrial dimension，LAD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESd），左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），由Teichholz校正公式計(jì)算^[27]。每一結(jié)果均連續(xù)測量3個心動周期取平均值。

1.4 在體電生理檢測

先將大鼠麻醉后進(jìn)行有創(chuàng)呼吸通氣（仰臥位），隨后開胸暴露心臟，使用LEAD-7000電生理儀檢測心房有效不應(yīng)期（atrial effective refractory period，AERP）、AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時間等電生理參數(shù)^[28]。通過高于基礎(chǔ)HR 20%頻率起搏的S1S1刺激誘導(dǎo)，S1S2間期從120 ms逐次遞減（步長5 ms），直至達(dá)到不能被奪獲的最長S1S2間期稱為AERP。短陣快速脈沖刺激（burst刺激）10次（S1S1=50 ms，持續(xù)10 s）出現(xiàn)AF的次數(shù)占總刺激次數(shù)的百分比定義為AF誘發(fā)率。根據(jù)每只動物10次突發(fā)起搏后累積的AF次數(shù)計(jì)算AF持續(xù)時間。AF定義為具有f波和RR間期絕對不規(guī)則的快速房性心律失常持續(xù)時間≥1 s。

1.5 組織學(xué)研究

開胸后迅速取心臟，用含肝素的生理鹽水沖洗殘余血液，部分左心房組織使用戊二醛固定后用于透射電鏡觀察。部分左心房組織用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后用于Masson染色和免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，使用Image J軟件定量分析膠原容積分?jǐn)?shù)及LC3在心房組織中的表達(dá)情況。

1.6 Western blot檢測

取綠豆大小的各組心房肌組織，加入配好的放射免疫沉淀分析裂解液，研磨成勻漿置于冰上30 min后離心5 min，提取上清并使用二喹啉甲酸試劑盒進(jìn)行蛋白定量，提取的蛋白上清中加入上樣緩沖液煮沸10 min備用，凝膠電泳并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉的封閉液室溫水平搖床封閉2 h（磷酸化蛋白用1%的牛血清白蛋白封閉液），加入一抗并4 ℃孵育過夜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液+吐溫20溶液充分洗滌后加入二抗室溫?fù)u床孵育2 h，使用顯色工作液顯影條帶，使用Image J軟件分析灰度值，最終以各組目的蛋白與GAPDH的灰度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異，采用單因素方差分析比較多組間差異，隨后對總體有差異的采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。以頻數(shù)和百分比（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，并使用Bonferroni法進(jìn)行校正。所有統(tǒng)計(jì)分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 抑制MAPK14改善AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時間

課題組前期通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MAPK14在AF犬和小鼠心房肌細(xì)胞AF模型中表達(dá)顯著上調(diào)^[16]。隨后檢測了MAPK14和p-MAPK14在4組大鼠心房組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在AngⅡ組中的表達(dá)（0.79±0.03和0.63±0.08）均明顯高于CT組（0.54±0.05和0.21±0.05）（t=7.74和7.95，P均lt;0.005），AS組中的表達(dá)（0.64±0.02和0.38±0.03）均明顯低于AngⅡ組（0.79±0.03和0.63±0.08）（t=7.09和5.22，P均lt;0.05）（圖1A～C）。在體電生理檢測結(jié)果表明，與CT組相比，Ang Ⅱ組AERP縮短，而AF持續(xù)時間延長，AF誘發(fā)率增高；與Ang Ⅱ組相比，AS組AERP延長，相應(yīng)地，AF持續(xù)時間縮短，AF誘發(fā)率降低（P均lt;0.000 5）（圖1D～G）。因此，抑制MAPK14可能對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的AF具有保護(hù)作用。

2.2 抑制MAPK14顯著改善心臟和線粒體結(jié)構(gòu)受損

心臟超聲結(jié)果顯示，各組基線數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=3.592，P=0.065 8）。5周末時，相較于CT組，AngⅡ組HR加快，LAD擴(kuò)大，LVEF值下降，LVEDd和LVESd值升高（t=4.30、4.21、5.66、3.18、5.23，P均lt;0.05）；相較于AngⅡ組，AS組HR減慢，LAD減小，LVEF值升高，LVEDd和LVESd值下降（t=8.78、3.09、5.55、12.36、7.46，P均lt;0.05）；同時，AngⅡ組各指標(biāo)與同組基線相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=4.34、5.04、6.13、6.69、5.99，P均lt;0.05），見表1。組織透射電鏡結(jié)果顯示，相較于CT組，AngⅡ組線粒體數(shù)量明顯減少，排列紊亂，空泡增多；AS組線粒體輕微腫脹，自噬較AngⅡ組有所緩解（圖2A）。Masson染色結(jié)果顯示AngⅡ組膠原蛋白沉積（29.11±2.22）較CT組（8.72±0.90）增多（t=14.73，P=0.000 1），而AS組膠原蛋白沉積（11.79±1.57）較AngⅡ組（29.11±2.22）減少（t=11.03，P=0.000 4）。這些結(jié)果表明MAPK14可能在AngⅡ誘導(dǎo)的AF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.3 抑制MAPK14減輕線粒體自噬

為評估MAPK14參與AF進(jìn)程的情況，檢測了線粒體自噬靶標(biāo)parkin和P62在4組心房組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)parkin在AngⅡ組中的表達(dá)（0.86±0.11）明顯高于CT組（0.42±0.09）（t=5.51，P=0.005 3），P62在AngⅡ組中的表達(dá)（0.31±0.11）明顯低于CT組（0.66±0.07）（t=4.76，P=0.008 9）；與AngⅡ組相比，AS組的parkin表達(dá)水平（0.61±0.01）下調(diào)且P62表達(dá)水平（0.10±0.16）上調(diào)（t=4.02、6.03，P均lt;0.05）（圖3A～C）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也表明LC3在AngⅡ組中的表達(dá)（0.25±0.01）明顯高于CT組（0.12±0.01）（t=16.95，Plt;0.000 1）；相較于AngⅡ組，AS組的LC3表達(dá)水平（0.19±0.01）下調(diào)（t=10.86，P=0.000 4）（圖3D～E）。這些結(jié)果表明MAPK14可能通過影響大鼠心房組織的線粒體自噬參與AngⅡ誘導(dǎo)的AF發(fā)生發(fā)展。

3 討論

本研究創(chuàng)新性地將MAPK14介導(dǎo)的線粒體自噬與AngⅡ誘導(dǎo)的AF聯(lián)系起來?；谡n題組前期的生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究成功構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF易感模型，并證明MAPK14表達(dá)的上調(diào)。通過在體電生理檢測，證實(shí)了抑制MAPK14可改善AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時間；通過心臟超聲、組織透射電鏡、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色和Western blot，證明抑制MAPK14可能通過抑制線粒體過度自噬來減輕線粒體結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而改善心臟結(jié)構(gòu)和功能。

MAPK14在心肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，大多數(shù)研究^[29-32]表明，MAPK14的激活參與心律失常的發(fā)生發(fā)展，所涉及的機(jī)制包括心肌纖維化、鈣處理紊亂以及心肌細(xì)胞中縫隙連接的調(diào)節(jié)，但其在AF中的作用機(jī)制研究較少。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF易感模型中，MAPK14表達(dá)上調(diào)，抑制MAPK14后AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時間得到改善，同時，AngⅡ組左心房纖維化加重，抑制MAPK14后左心房纖維化程度有所減輕。MAPK家族既可直接與線粒體外膜相互作用，也可通過影響ROS和鈣信號進(jìn)而影響線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡^[33-34]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ組線粒體自噬相關(guān)蛋白parkin顯著增加的同時自噬選擇性底物P62降解，且電鏡下結(jié)構(gòu)顯著受損，而抑制MAPK14后，上述蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)，心臟結(jié)構(gòu)和功能也顯著好轉(zhuǎn)，這與上述MAPK家族的蛋白功能相吻合，說明了MAPK14在AngⅡ誘導(dǎo)的AF進(jìn)展中的重要作用。

線粒體功能障礙與多種心血管疾病有關(guān)^[35-36]，線粒體功能障礙的病理生理作用是通過部分阻斷或下調(diào)線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和SS31（一種改善線粒體生物能量學(xué)的化合物）來防止線粒體鈣內(nèi)流增加，從而減弱AF結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)^[8]。Yuan等^[37-38]和Wiersma等^[39]的研究表明自噬的激活通過影響鈣穩(wěn)態(tài)來誘導(dǎo)心房電重構(gòu)，然而Zhu等^[7]的研究得出不同的結(jié)論，他們的研究表明促進(jìn)線粒體自噬有助于防止線粒體功能障礙并抑制心房纖維化，因此線粒體自噬在AF中的作用仍存在爭議。即便如此，本研究結(jié)果顯示抑制MAPK14可減輕AngⅡ誘導(dǎo)的AF心臟組織的線粒體自噬，故筆者推測抑制MAPK14改善AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF可能通過減輕線粒體過度自噬而發(fā)揮作用，線粒體不論是過度自噬還是自噬抑制均為線粒體功能障礙的表現(xiàn)，這有助于加深對MAPK14在AF中的作用機(jī)制的理解。

不足之處，首先，MAPK14家族亞型之間具有高度的相似性，本研究使用的是非特異性MAPK14抑制劑。這種非亞型特異性抑制劑可能促進(jìn)毒性次級效應(yīng)的發(fā)展，并可能觸發(fā)調(diào)節(jié)反饋回路，因此需要轉(zhuǎn)基因動物模型的進(jìn)一步研究來明確MAPK14的復(fù)雜作用。其次，本研究檢測的線粒體自噬靶標(biāo)偏少，后續(xù)研究將增加相關(guān)檢測以提供更多依據(jù)。

綜上所述，抑制MAPK14改善AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠AF的機(jī)制可能與減輕線粒體自噬有關(guān)，其抗心律失常效應(yīng)可能是開發(fā)潛在AF治療策略的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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收稿日期：2023-10-18