黑茶渥堆發(fā)酵過程中微生物的研究進展

摘要：黑茶屬于六大茶類之一，渥堆發(fā)酵是其核心工序。黑茶渥堆發(fā)酵的關鍵就在于茶葉在濕熱條件下經(jīng)微生物作用，最終形成其獨特風味與品質。為了解黑茶發(fā)酵過程中不同種類微生物所起的作用，文章就黑茶渥堆過程中微生物的種類及數(shù)量變化、不同黑茶的微生物種類組成差異、黑茶渥堆發(fā)酵中微生物種群的分析鑒定技術、重要菌種添加發(fā)酵對黑茶品質變化的影響，以及黑茶中有害微生物的產生條件及對安全生產的指導意義等進行了綜述。

關鍵詞：黑茶；發(fā)酵；微生物

中圖分類號：TS272.5；Q936 文獻標識碼：A 文章編號：1000－3150（2024）09-21-7

Research Progress of Microorganisms during Fermentation of Dark Tea

WANG Guiyou1， WANG Zhaoyue2， LIANG Siwei1， ZHANG Yan1*

1. Angel Yeast Co.， Ltd./The National Key Laboratory of Agricultural Microbial Resources Exploitation and Utilization/The Key

Laboratory of Yeast Function in Hubei， Yichang 443000， China; 2. Xinding Biotechnology Co.， Ltd.， Yichang 443000， China

Abstract： Dark tea is one of the six major tea categories in China. Pile-fermentation is its core process， and the key of fermentation lies in the fusion of tea and microorganisms under hot and humid conditions， which ultimately forms the unique flavor and quality of dark tea. In order to understand the role of different kinds of microorganisms in the fermentation process of dark tea， the paper summarized the changes in the varieties and quantities of microorganisms in the pile-fermentation process of dark tea， the differences in the composition of microbial population of different kinds of dark tea， the analysis and identification techniques of microbial populations in the pile-fermentation of dark tea， the influence of the addition of important strains on the change of tea quality. This paper also introduced the production conditions of harmful microorganisms in dark tea and their guiding significance for safe production.

Keywords： dark tea， fermentation， microorganism

黑茶生產歷史悠久，主要包括普洱茶、青磚茶、茯磚茶、康磚茶等，黑茶磚茶以磚體勻整、香氣濃郁、滋味醇和、湯色橙紅透亮、葉底棕褐等特點著稱。黑茶不僅能生津止渴，還具有降血糖、降血脂、抗氧化的保健功效。隨著社會的發(fā)展以及研究技術的進步，微生物群落結構以及功能研究在黑茶發(fā)酵領域逐漸開展，但目前大部分文獻報道中多是對普洱茶的研究，而對其他黑茶類的研究甚少，尤其是黑茶菌種添加發(fā)酵生產領域還存在一定的技術空白，而菌種添加發(fā)酵的前提是對渥堆中已有微生物種群的分析確定及提取、鑒定、大規(guī)模培養(yǎng)技術的進步，因此，筆者收集相關黑茶文獻，對此領域內的研究進展進行綜述。

1 黑茶渥堆過程中微生物的種類及變化

研究表明，黑茶渥堆發(fā)酵過程中的微生物群落主要有霉菌、細菌、酵母菌和放線菌（Actinomycetes），隨著渥堆程度的加深，不同種類黑茶的微生物種群及數(shù)量也發(fā)生著變化。

1.1 黑茶渥堆過程中霉菌的種類及變化

青磚茶在渥堆過程中，黑曲霉（Aspergillus niger）數(shù)量占絕對優(yōu)勢，且分離頻率高，是青磚茶渥堆過程中的優(yōu)勢菌[1-2]。在普洱茶渥堆發(fā)酵前期，黑曲霉數(shù)量增加迅速，中后期逐漸衰減[3-4]，但在整個發(fā)酵過程中，曲霉屬（Aspergillus）依舊是優(yōu)勢菌屬[5]。同樣，黑曲霉也是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，但發(fā)酵后期的數(shù)量比前期要多，渥堆完成后進入發(fā)花期時，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的數(shù)量逐漸超過黑曲霉[6]。

由此可見，黑曲霉是黑茶渥堆發(fā)酵的主要優(yōu)勢菌，同時也是普洱茶發(fā)酵早期的主要產香微生物[7]。除此之外，如表1所示，不同種類的黑茶在渥堆過程中都有豐富的霉菌，且由于產地及環(huán)境的不同，霉菌的種類也有所差別，從而也形成了各自獨特的滋味品質。

1.2 黑茶渥堆過程中酵母菌的種類及變化

青磚茶在渥堆過程中酵母菌種類偏少，渥堆前期酵母菌的數(shù)量平穩(wěn)，到第九天時數(shù)量開始大幅度下降，第十天進行翻堆，改變了茶堆環(huán)境，酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)出與翻堆之前相似的規(guī)律，并在渥堆后期（渥堆第十九天）急劇下降，而此時細菌數(shù)量卻急速上升。渥堆過程中微生物的生長代謝及不同種群之間的競爭關系會導致種群的此消彼長，數(shù)量差異大[8]。在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中，酵母菌早期數(shù)量較少，隨著發(fā)酵時間的增加，酵母菌的數(shù)量緩慢增加，到發(fā)酵后期較其他種類真菌數(shù)量增多。而茯磚茶渥堆發(fā)酵過程中，酵母菌始終處于主要地位，數(shù)量較黑曲霉和青霉多，由于酵母菌的活性大，渥堆后期的茶葉呈現(xiàn)出香甜的氣味[6，11]。

表2統(tǒng)計了目前研究人員已分離的部分菌落，發(fā)現(xiàn)茯磚茶渥堆過程中酵母菌的種類豐富，豐富的酵母菌株可以明顯改善茶葉發(fā)酵后的口感。

1.3 黑茶渥堆過程中細菌的種類及變化

黑茶渥堆過程中，細菌種類繁多（表3），徐倩等[8]利用高通量測序技術對青磚茶渥堆第九天及第十九天茶樣鑒定發(fā)現(xiàn)，青磚茶細菌種類繁多，渥堆初期，細菌數(shù)量呈上升趨勢，當渥堆進行到第九天時，細菌的數(shù)量達到一個閾值后又開始下降，并在末期反轉爆發(fā)至高峰。整個渥堆期間，細菌的數(shù)量明顯高于其他種類微生物，其中發(fā)酵中期以泛菌屬（Pantoea gavini）、伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）數(shù)量居多，發(fā)酵末期以克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）居多，并且在渥堆第十九天茶樣中檢測出了耐熱性強的芽孢桿菌屬（Bacillus）和脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus），這表明耐熱菌可能更適應長期的高溫環(huán)境而快速繁殖。

在普洱茶發(fā)酵微生物研究中發(fā)現(xiàn)，普洱茶渥堆過程中細菌種類繁多，且隨著渥堆程度的增加，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、赫氏埃希菌（Escherichia hermannii）等開始消失，而芽孢桿菌屬在整個發(fā)酵過程中自始至終都存在，數(shù)量隨著渥堆時間的延長而增長，成為后期發(fā)酵的優(yōu)勢菌群[4，12]。

不同于普洱茶和青磚茶，茯磚茶渥堆過程中細菌種類稀少，目前已報道的只有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），從原料毛茶一直到渥堆完成，枯草芽孢桿菌的數(shù)量處于相對平穩(wěn)狀態(tài)，同曲霉屬和冠突散囊菌共同作用，成為茯磚茶渥堆過程中的主要微生物[6]。

1.4 黑茶渥堆過程中放線菌的種類及變化

放線菌能產生多種抗生素，特別是鏈霉菌屬（Streptomyces），能夠抑制部分有害菌的生長，對于茶葉發(fā)酵有良好的促進作用，放線菌在青磚茶渥堆的前期、中期、后期都有被發(fā)現(xiàn)，從渥堆的第六天至后期第十六天數(shù)量呈直線增長，渥堆結束后數(shù)量有所下降[8]。已報道的普洱茶發(fā)酵過程中放線菌種類豐富，渥堆二十一天之前出現(xiàn)的放線菌只有微桿菌屬（Microbacterium orla-jensen）和紅球菌屬（Rhodococcus），而在渥堆第二十一天至渥堆結束，出現(xiàn)的放線菌種類偏多，包括短小桿菌屬（Curtobacterium yamada）、考克氏菌屬（Kocuria）、鏈霉菌屬等（表4），其中未鑒定的表皮菌和考克氏菌屬分離次數(shù)較多，是普洱茶發(fā)酵后期的優(yōu)勢微生物[5]。

目前對于茯磚茶渥堆發(fā)酵中放線菌的研究較少，暫未發(fā)現(xiàn)鑒定的具體種類。

1.5 黑茶渥堆過程中微生物種類多樣性

由于微生物對溫度耐受程度不同在不同的環(huán)境溫度條件下必將產生種類及數(shù)量上的差異[9]。同理，不同地區(qū)黑茶在加工過程中溫度條件和渥堆時間等工藝參數(shù)不一樣，導致茶坯理化條件不一致，在渥堆過程中，微生物的含量及種類也會有所差別。

在普洱茶的渥堆過程中，酵母菌和霉菌是其中最為突出的優(yōu)勢菌株，曲霉菌和青霉菌在黑茶加工的各個環(huán)節(jié)均有發(fā)現(xiàn)，是黑茶加工過程中不可或缺的微生物，對茶葉中各物質之間的轉化起著舉足輕重的作用。

2 黑茶渥堆發(fā)酵過程中微生物群落研究技術

2.1 傳統(tǒng)研究技術

傳統(tǒng)的微生物群落研究方法主要是采用平板梯度稀釋法對樣品中的真菌進行分離純化，根據(jù)純化菌的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》觀察菌株的生長情況，對菌落大小、形態(tài)、顏色等進行比對，并在光學顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)，初步確定菌種類型。

發(fā)酵微生物種群的組成、功能特性等對黑茶的品質形成具有決定性影響，僅僅依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定方式具有很大的局限性。很多微生物在人工培養(yǎng)基上無法生長，且采用形態(tài)鑒定帶有一定的主觀性，無法鑒定到種的分類層級，微生物多樣性的研究還是需要借助現(xiàn)代分子生物學技術。

2.2 分子生物學研究技術

與傳統(tǒng)研究技術相比，分子生物學研究技術可靠性強、準確度高，能夠檢測群落中90%～99%的微生物。目前利用分子生物學研究微生物群落的技術包括熒光原位雜交技術（FISH）、基于16S/18S rRNA/rDNA的變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長度多態(tài)性技術、宏基因組技術、宏轉錄組技術等，經(jīng)過研究人員不斷探索和挖掘，已經(jīng)能夠對特定環(huán)境、特定時期微生物群落的功能、結構及代謝的多樣性進行分析。

楊曉蘋等[4]通過聚合酶鏈式反應－變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術，對普洱茶渥堆過程中的微生物進行研究，分離出茶葉中的細菌和真菌，并進行克隆測序，建立了基因指紋圖譜，完整地分析出渥堆發(fā)酵過程中微生物的群落結構及動態(tài)變化。劉石泉等[10]也采用DGGE技術，對茯磚茶中真菌群落的18S rDNA高變區(qū)進行擴增，最終完成了茯磚茶真菌群落的結構及多樣性變化。該技術在1993年首次應用于微生物群落結構研究，目前對于PCR-DGGE技術的應用已經(jīng)趨于成熟。

相比DGGE法，高通量測序操作簡便，覆蓋范圍廣。楊吉霞等[13]在茯磚茶微生物的研究中，采用16S rRNA基因和真菌ITS基因對樣本進行高通量測序，利用生物信息分析技術，對茯磚茶微生物的群落結構進行了全面分析，高效準確地反映了茯磚茶在發(fā)酵過程中微生物多樣性的變化。相較而言，DGGE僅能夠反映有限的優(yōu)勢微生物類型，在很大程度上極可能低估微生物的物種組成并高估其豐度。

目前，對黑茶發(fā)酵過程中微生物群落的研究，大多是基于宏基因組的高通量測序及基于16S/18S rRNA/rDNA的DGGE技術。呂昌勇[14]采用宏基因組學技術，對普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的某一茶樣進行了高通量測序，初步獲得了微生物群落及其功能信息，增加了對普洱茶微生物發(fā)酵的認識。雖然宏基因組技術能夠詳細展示黑茶微生物群落中的所有遺傳信息，但已經(jīng)死亡卻尚未被分解的微生物遺傳信息也會被檢測到，這些微生物本身已經(jīng)不主動參與到黑茶發(fā)酵中，從而會對研究結果產生一定影響。因此，結合代謝組學、轉錄組學的方法研究黑茶發(fā)酵過程中的微生物，才能精確地了解黑茶在發(fā)酵環(huán)境中正在發(fā)生的代謝過程，包括微生物群落、代謝產物、酶等[15]，研究其微生物基因轉錄情況及轉錄調控規(guī)律，從而真正了解黑茶渥堆發(fā)酵過程中不同微生物的功能及相互關系。

2.3 微生物的非培養(yǎng)鑒定技術

微生物的非培養(yǎng)鑒定技術迅速發(fā)展，通過利用微生物生物化學活性特征，相應衍生出了各種微生物群落多樣性的研究方法，包括脂質分析技術、蛋白質體學研究技術及Biolog-Eco技術[16]，其中Biolog-Eco被廣泛用于微生物群落代謝活性多樣性的研究[17]。但上述技術尚未發(fā)現(xiàn)用來分析黑茶渥堆發(fā)酵過程中微生物群落的狀態(tài)，若將這些技術應用在茶葉發(fā)酵微生物群落的研究中，可能會有不一樣的發(fā)現(xiàn)。

3 菌種添加發(fā)酵對黑茶品質的影響

研究表明，人工添加菌種發(fā)酵黑茶能夠大大縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵效率。付秀娟等[18]將單一霉菌、酵母菌、細菌分別加入普洱茶發(fā)酵工藝中發(fā)現(xiàn)，霉菌對黑茶品質影響較大，酵母菌次之，細菌影響不大，且將霉菌和酵母菌混菌發(fā)酵黑茶效果更佳。彭翠珍等[19]對云南普洱茶進行人工接種菌種發(fā)酵研究表明，將黑曲霉和酵母組合，以及青霉和酵母組合分別發(fā)酵5 d后，和未添加菌種以及單一霉菌添加的茶葉相比，組合菌種處理的茶堆內部菌絲生長豐茂，發(fā)酵啟動快；對不同菌種發(fā)酵28 d后感官及理化評估發(fā)現(xiàn)，組合菌種發(fā)酵的黑茶湯色、葉底較好，茶紅素和茶褐素含量較其他處理高，滋味醇和，接近陳化3年的特級普洱茶。

除了霉菌和酵母組合發(fā)酵外，霉菌和細菌的組合對發(fā)酵也有一定的促進作用，研究表明，煙曲霉和枯草芽孢桿菌是黑茶發(fā)酵過程中的核心微生物，煙曲霉能夠轉化多酚類化合物，而枯草芽孢桿菌能增強煙曲霉的生物轉化能力。Xu等[20]在青磚茶發(fā)酵工藝中同時添加煙曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，渥堆6 d的茶葉品質與傳統(tǒng)發(fā)酵35 d的品質一致，說明同時添加這兩種真菌能夠縮短發(fā)酵周期，提高生產效率；另外，研究人員在普洱茶中分離出產黃青霉，將其添加到普洱茶原料中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其能改變發(fā)酵過程中的真菌群落，使得成茶口感更醇厚，陳化程度更深[21]。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，在黑茶發(fā)酵過程中添加功能性菌株能夠開發(fā)功能性黑茶。Wang等[22]利用塔賓曲霉進行液態(tài)發(fā)酵，可生產出高茶褐素速溶普洱茶，該茶中的活菌及微生物毒素相對來說偏少，各種元素低于權威機構推薦的安全限量，茶味溫和順滑、醇厚飽滿，用此菌液態(tài)發(fā)酵黑茶安全、快速。茶葉不同香氣特征形成在于關鍵香氣化合物和核心功能微生物的作用，針對茯磚茶獨特的“真菌花”香氣，Zheng等[23]采用GC-MS和GC-O分析方法從茯磚茶中共鑒定出43種揮發(fā)物和38種氣味活性化合物，進一步驗證了這些氣味活性化合物可以成功地模擬茯磚茶的整體香氣特征；Li等[24]采用HS-SPME/GC-MS和Illumina MiSeq對六堡茶3種香氣類型的香氣譜和真菌群落進行了分析，基于O2PLS分析，真菌屬被確定為影響揮發(fā)性特征變化的核心功能微生物。Ling等[25]從茶葉中分離GFs（Golden flowers），GFs的游離氨基酸和多糖含量較高，微生物作用改變了GF中的黃酮類化合物的結構，降低了茯磚茶的苦味，產生了特有的果香和花香。此外，研究還表明，簡青霉（Penicillium simplicissimum）和聚多曲霉（Polyporus versicolor）都具有降解黑茶中咖啡堿的能力。Zhou等[26]將聚多曲霉添加至普洱茶干毛茶中發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，咖啡堿的降解效果顯著，去甲基化是聚多曲霉次生代謝中咖啡堿降解的主要途徑。另外，Yu等[27]將簡青霉添加至青磚茶曬青毛茶中渥堆發(fā)酵，結果表明除咖啡堿下降了近50%外，毛茶經(jīng)菌種發(fā)酵后其大部分品質成分與傳統(tǒng)發(fā)酵相似，部分內含物質含量高于傳統(tǒng)發(fā)酵。目前，利用菌株發(fā)酵茶葉開發(fā)新品還需深入研究，以期能夠探索出更多復合口味及功能的茶產品。

4 黑茶有害微生物的產生

黑茶的工廠化生產在各個環(huán)節(jié)已基本實現(xiàn)標準化，農藥殘留和重金屬超標的問題也已引起了高度關注，但對于有害微生物問題還沒有引起足夠重視。微生物既有有益菌也有有害菌，有益菌對改善茶葉質量和促進人體健康都有積極的作用，而有害菌不僅影響茶葉品質，還會有損人體健康。

黑茶屬后發(fā)酵茶，黑茶的加工需要大量微生物的參與，黑茶生產中不可避免地會在特定階段產生一些有害微生物[28]，如在茶園種植過程中，未經(jīng)處理的有機糞肥、菌肥中可能有致病菌、產毒真菌等；鮮葉人工采摘過程中可能存在接觸污染，運輸工具和盛裝器具污染等；初制過程中，加工機械存在未清理干凈的殘存物污染，手工揉捻存在操作人員和器具污染，渥堆時長時間高水分和濕熱條件，有利于霉菌和細菌大量繁殖；精制過程中，風選時從環(huán)境中抽取的風中可夾帶真菌和細菌等；另外，茶葉包裝、倉儲、運輸過程中都有可能因為人員、器具、環(huán)境管理疏忽，導致霉菌、大腸菌群等污染。

黑茶消費方式主要是沖泡和煮沸飲用，也有在茶葉中添加其他食品成分進行混合使用，消費者在這些消費過程中也可能造成有害微生物的污染。

黑茶加工和飲用過程中，由細菌產生毒素的污染是重大危害，如渥堆發(fā)酵或半成品沒有及時加工干燥而產生霉菌，以及一些耐受高溫的嗜熱性芽胞桿菌都會帶來危害風險。

5 結語

黑茶渥堆發(fā)酵時微生物的變化直接影響著產品品質的好壞，目前有關普洱茶、青磚茶和茯磚茶渥堆微生物種類及變化的研究數(shù)據(jù)文獻雖然頗多，但由于茶原料、生產地域、發(fā)酵環(huán)境及發(fā)酵工藝方面的差異，對各種茶的優(yōu)勢菌、微生物種群差異和有害微生物的區(qū)別等還不足以形成一致的結論。此外，對于渥堆過程中未培養(yǎng)菌的開發(fā)，以及菌株的代謝及功能研究亦存在一定的空白。利用宏基因組學、轉錄組學及代謝組學技術將能很好地彌補這些空缺，可為黑茶的高品質穩(wěn)定生產提供幫助，并為黑茶風味發(fā)酵、功能菌株發(fā)酵等多元化產品提供菌種篩選依據(jù)。

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