骨髓細胞形態學、免疫組化、PCR診斷淋巴瘤骨髓侵犯的價值

【摘要】 目的：探討骨髓細胞形態學、免疫組化、聚合酶鏈反應（PCR）診斷淋巴瘤骨髓侵犯的價值。方法：選取贛州市腫瘤醫院2021年1月—2023年8月收治的81例淋巴瘤患者，均接受骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化、PCR檢測，分析三者單獨及聯合檢出骨髓侵犯的價值。結果：81例患者中，骨髓活檢檢出21例、骨髓細胞形態學檢出32例、骨髓涂片免疫組化檢出36例，PCR檢出19例。其中，聯合檢測與骨髓活檢的一致性最好，Kappa值為0.875；以骨髓活檢為參考標準，骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化、PCR及聯合檢測的敏感度分別為80.95%、90.48%、71.43%、95.24%，特異度分別為75.00%、71.67%、93.33%、95.00%，準確率分別為76.54%、76.54%、87.65%、95.06%，陽性預測值分別為53.13%，52.78%、78.95%、86.96%，陰性預測值分別為91.84%、95.56%、90.32%、98.28%。聯合檢測的敏感度高于PCR單項檢測，特異度、準確率、陽性預測值均高于骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化單項檢測（P<0.05）。結論：淋巴瘤患者骨髓細胞形態學檢查聯合骨髓涂片免疫組化、PCR檢查可明顯提高對骨髓侵犯的診斷效能。

【關鍵詞】 淋巴瘤 骨髓侵犯 骨髓細胞形態學 免疫組化 聚合酶鏈反應

Value of Bone Marrow Cell Morphology， Immunohistochemistry and PCR in Diagnosing Lymphoma with Bone Marrow Involvement/LIAO Weilian. //Medical Innovation of China， 2024， 21（24）： -158

[Abstract] Objective： To explore the value of bone marrow cell morphology， immunohistochemistry and polymerase chain reaction （PCR） in the diagnosis of lymphoma with bone marrow involvement. Method： A total of 81 patients with lymphoma in Ganzhou Cancer Hospital were selected from January 2021 to August 2023. All patients underwent bone marrow cell morphology， bone marrow smear immunohistochemistry and PCR detection， and the value of the three alone and combined detection on bone marrow involvement were analyzed. Result： Among 81 patients， 21 cases were detected by bone marrow biopsy， 32 cases were detected by bone marrow cell morphology， 36 cases were detected by bone marrow smear immunohistochemistry and 19 cases were detected by PCR. The consistency between combined detection and bone marrow biopsy was the best， with Kappa value of 0.875. Taking bone marrow biopsy as the reference standard， the sensitivities of bone marrow cell morphology detection， bone marrow smear immunohistochemistry， PCR and combined detection were 80.95%， 90.48%， 71.43% and 95.24%， the specificities were 75.00%， 71.67%， 93.33% and 95.00%， accuracy rates were 76.54%， 76.54%， 87.65% and 95.06%， the positive predictive values were 53.13%， 52.78%， 78.95% and 86.96%， and the negative predictive values were 91.84%， 95.56%， 90.32% and 98.28% respectively. The sensitivity of combined detection was higher than that of PCR single detection， and the specificity， accuracy rate and positive predictive value were higher than those of bone marrow cell morphology and bone marrow smear immunohistochemistry （P<0.05）. Conclusion： Bone marrow cell morphology examination combined with bone marrow smear immunohistochemistry and PCR can significantly improve the diagnostic efficiency on bone marrow involvement in patients with lymphoma.

[Key words] Lymphoma Bone marrow involvement Bone marrow cell morphology Immunohistochemistry Polymerase chain reaction

First-author's address： Department of Pathology， Ganzhou Cancer Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.24.035

淋巴瘤是起源于淋巴結、淋巴組織的惡性腫瘤，表現為淋巴結無痛性進行性腫大，至疾病后期淋巴瘤細胞常通過淋巴系統擴散到肝、肺、骨髓等其他部位，其中骨髓是較常見的受累部位，可發展為淋巴瘤細胞白血病，預后較差[1-3]。因此，需重視淋巴瘤患者骨髓情況評估，以便準確判斷病理分型及臨床分期，指導臨床醫師針對性調整治療方案。目前，臨床對淋巴瘤骨髓侵犯情況的評估方法多種多樣，但尚無統一診斷金標準，通常采用以多種診斷方式聯合檢測的方式對骨髓侵犯程度進行鑒別與診斷[4-5]。骨髓形態學檢查、骨髓組織免疫組化及聚合酶鏈反應（PCR）等是常用診斷方法，但上述幾種方法單獨診斷及聯合診斷的效能比較研究較少[6-8]。因此本研究旨在探討淋巴瘤骨髓侵犯患者骨髓細胞形態學特征及聯合免疫組化、PCR的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取贛州市腫瘤醫院2021年1月—2023年8月收治的81例淋巴瘤患者，男35例，女46例；年齡31～61歲，平均（43.98±6.29）歲；其中霍奇金淋巴瘤8例，非霍奇金淋巴瘤73例；卡氏功能狀態評分：>60分56例，≤60分25例。納入標準：（1）均確診為淋巴瘤[9]；（2）疑似骨髓侵犯，Ann Arbor分期為Ⅳ期；（3）年齡≥18歲；（4）均接受骨髓涂片、骨髓活檢、免疫組化、PCR檢查；（5）初治。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤疾病；（2）存在血液系疾病或凝血功能障礙；（3）存在全身性感染性疾病或免疫系疾病；（4）哺乳期或妊娠期。患者均簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 于髂前上棘或髂后上棘穿刺，穿刺針垂直進入骨面，接觸骨質后將穿刺針左右旋轉推進至針入骨質，穿刺針固定在骨內時拔出針芯，用10 mL注射器抽取3 mL骨髓液，其中0.2 mL快速涂片10張，5張行骨髓細胞形態學檢查，另5張經95%乙醇固定后行骨髓涂片免疫組化檢查；另外2.8 mL置入EDTA抗凝管中進行PCR檢測。在同一穿刺部位，使用骨髓活檢組織檢查針進行骨髓活檢穿刺術，順時針進針至固定，拔出針芯，連上接柱后再插入針芯，仍順時針進針，約進針1 cm后，順時針旋轉3周后再逆時針旋轉2～3周至骨髓組織離斷，再順時針退針，取出骨髓組織置入10%的甲醛溶液中固定，進行病理檢查。消毒穿刺點后使用無菌紗布覆蓋。

1.2.2 骨髓細胞形態學 待涂片干燥后用瑞氏-吉姆薩染色法染色，在高倍油鏡下進行形態學檢查。陽性判斷標準：5%<淋巴瘤細胞<20%[10]。

1.2.3 骨髓涂片免疫組化 應用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色法，將已經95%乙醇固定骨髓涂片放入蒸餾水中浸泡5 min，再用雙氧水浸泡10 min，后再浸于蒸餾水3 min，取出、擦干，用蠟筆圈出組織，滴加PBS沖洗至細胞被完全覆蓋，擦干周圍PBS后滴加一抗，1 h后取出玻片用PBS沖洗3遍，滴加二抗至完全覆蓋組織，30 min后用PBS沖洗至洗脫未能與一抗結合的二抗，滴加DAB（依據標本量配制），室溫下放置10 min，用自來水沖洗1 min，使用蘇木精染色2 min，流水沖洗，分化，返藍，再流水沖洗4 min，80%乙醇浸泡5 s后用無水乙醇浸泡5 s，晾干，加蓋玻片。B細胞來源：CD10、CD19、CD20、CD79a、PAX-5，T、NK細胞來源：CD3、CD5、CD7。

1.2.4 PCR 將標本以2 000 r/min的速度離心10 min去除上清液，混勻后加入紅細胞低滲液15 mL，室溫下放置30 min，再次以相同的速率離心2 min后去除紅細胞低滲液，再依次加入裂解液及蛋白沉淀液，最后提取DNA，以β-Actin檢測確認有效，采用半巢式PCR方法檢測基因克隆性重排，引物序列根據PCR引物設計原則利用PP 5.0和Oligo 6.0系統自行設計。任一反應陽性即為骨髓標本DNA存在基因克隆性重排，判定為淋巴瘤骨髓侵犯陽性。

1.2.5 骨髓活檢 骨髓活檢組織在10%的甲醛溶液中固定4 h后水洗，常規脫鈣、脫水、浸蠟、包埋，切片（厚度3～4 μm），烤片，脫蠟，行Harris氏蘇木素-吉姆薩-伊紅染色，脫水透明后用樹膠封片。鏡檢觀察，按文獻[11]《血液病診斷及療效標準》，骨髓正常結構被破壞，見異形淋巴細胞（胞體小、胞質少、核圓）或伴有少量幼稚淋巴細胞則為骨髓侵犯陽性。

以兩項及以上檢測陽性為聯合檢測的陽性標準。本研究以骨髓活檢結果為診斷參考標準。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件統計數據。計數資料以率（%）表示，骨髓細胞形態學檢測、骨髓涂片免疫組化等各檢測結果與骨髓活檢結果的一致性分析采用配對四表格字2檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同診斷方法結果比較

81例患者中，骨髓細胞形態學檢測的陽性率為39.51%（32/81），骨髓涂片免疫組化檢測陽性率為44.44%（36/81），PCR檢測陽性率為23.46%（19/81），骨髓活檢的陽性率為25.93%（21/81）。骨髓細胞形態學檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.478；骨髓涂片免疫組化檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.504；PCR檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.668；上述三種診斷方法聯合檢測與骨髓活檢的一致性最好，Kappa值為0.875。見表1。

2.2 不同診斷方法的診斷效能比較

以骨髓活檢為參考標準，聯合檢測的敏感度高于PCR單項檢測（字2=4.286，P=0.038），特異度、準確率、陽性預測值均高于骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化單項檢測（字2特異度=9.412、11.760，P特異度=0.002、0.001；字2準確率=11.401、11.401，P準確率=0.001、0.001；字2陽性預測值=6.957、7.316，P陽性預測值=0.010、0.007），見表2。

3 討論

淋巴瘤是臨床常見惡性腫瘤疾病，近年來發病率呈逐年增高趨勢，病因尚不明晰，可能與病毒感染因素、免疫功能低下、遺傳因素、環境因素等相關[12-13]。該病不同的病理類型、不同的臨床分期有不同的治療方案，在疾病早期，依據其病理分型及時進行針對性治療，預后較好。但若淋巴瘤累及骨髓則可能進展為淋巴瘤細胞白血病造成死亡。因此，及時對淋巴瘤患者骨髓累及情況進行評估具有重要臨床意義。

目前，淋巴瘤骨髓侵犯的診斷方法較多，有研究認為計算機斷層顯像可用于淋巴瘤骨髓侵犯情況的診斷[14]，也有部分研究認為血小板計數、乳酸脫氫酶等實驗室指標可指導淋巴瘤骨髓侵犯的臨床診斷[15]，但研究更多的還是骨髓涂片、骨髓活檢等檢查[16]。本研究81例患者中，骨髓細胞形態學觀察顯示骨髓侵犯陽性率為39.51%，可見淋巴瘤骨髓侵犯患者存在骨髓細胞形態改變或淋巴細胞數異常增多，骨髓液涂片能從骨髓細胞形態改變評估骨髓累及情況，且陽性率較高，優點在于涂片均勻，胞體舒展，使得異型細胞易于識別，且可量化，但細胞成分較單一，且邊界不清，可能造成假陽性、假陰性。對于部分淋巴瘤細胞還需免疫組化進行鑒別，本研究對同一病例標本進行骨髓涂片免疫組化檢查，免疫組化聯合抗原抗體反應、呈色反應，或能提高陽性率，結果顯示檢測陽性率為44.44%，但在標本的制備過程中重復的染色、沖洗等步驟可能破壞細胞，影響結果準確率，因此筆者認為上述兩項檢測結合或能提高診斷效能。另外，在標本制備過程中，骨髓涂片需快速以免骨髓液凝固，同時避免反復涂片，以防造成細胞破壞。

淋巴瘤屬于一種克隆性疾病，PCR技術檢測基因克隆性重排對檢測骨髓累及情況也有重要價值[17-18]。本研究中PCR檢查結果顯示骨髓侵犯陽性率為23.46%，較骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化的陽性率低，但其與骨髓活檢的一致性更好，這可能因為骨髓形態學及骨髓涂片免疫組化均會有不同比例的假陽性，而PCR檢測提取骨髓液相對較多，用快速提取法提取DNA，質量好，濃度高，因此準確率較高[19]。但在DNA提取過程中仍會有DNA流失，造成假陰性。結果中骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化、PCR聯合診斷與骨髓活檢的一致性最高，且聯合檢測的敏感度高于PCR單項檢測，特異度、準確率、陽性預測值均高于骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化單項檢測，證實聯合檢測可提高診斷效能，減少假陽性率、假陰性率。上述可見骨髓細胞形態學、骨髓涂片免疫組化、PCR單項檢測均各有優缺點導致誤診、漏診，而三項聯合檢測則可一定程度上互補，進而可減少誤診、漏診率，提高診斷效能。

綜上所述，淋巴瘤骨髓侵犯患者存在骨髓細胞形態改變或淋巴細胞數異常增多；淋巴瘤患者骨髓細胞形態學檢查聯合骨髓涂片免疫組化、PCR檢查可明顯提高對骨髓侵犯的診斷效能。本研究的局限在于樣本量較少，可能存在選擇偏倚，后續會繼續收集樣本數據以證實研究結論。

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（收稿日期：2024-01-22） （本文編輯：白雅茹）

①贛州市腫瘤醫院病理科 江西 贛州 341000

通信作者：廖偉蓮