缺氧誘導基因1C在牦牛隱睪中的表達及其調控機制研究

摘 要：旨在探究缺氧誘導基因1C（HIG1hypoxia inducible domain family member1C，HIGD1C）對牦牛睪丸支持細胞凋亡的影響。本研究分別選擇3頭3～6歲齡健康狀況良好的公牦牛和隱睪癥公牦牛，以其睪丸組織作為研究材料。通過HE染色、牦牛睪丸支持細胞分離培養、間接免疫熒光、RT-qPCR、Western blot、HIGD1C過表達與干擾載體構建及體外細胞轉染等技術，探究HIGD1C對牦牛睪丸支持細胞凋亡的調控機制。結果顯示：正常睪丸基底膜及間質組織完整，曲細精管、管周肌細胞及支持細胞等排列緊密，隱睪中曲細精管斷裂萎縮且HIGD1C在牦牛隱睪組織中轉錄及蛋白的表達水平極顯著于高于正常睪丸組織（Plt;0.01）；HIGD1C蛋白主要分布在睪丸間質細胞和支持細胞；成功分離培養出牦牛睪丸支持細胞且HIGD1C蛋白定位于原代睪丸支持細胞胞核；HIGD1C過表達支持細胞后，Bcl-2mRNA表達水平顯著上調（Plt;0.05），蛋白表達水平極顯著上調（Plt;0.01），Bax和Caspase-3mRNA和蛋白表達水平均極顯著上調（Plt;0.01），流式細胞術結果顯示過表達HIGD1C組支持細胞凋亡率極顯著上升（Plt;0.01）；反之，HIGD1C敲除后，Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA和蛋白表達水平均極顯著下調（Plt;0.01），流式細胞術結果顯示HIGD1C敲除組支持細胞凋亡率極顯著下調（Plt;0.01）。本研究結果表明：正常睪丸組織結構完整，隱睪間質疏松，且HIGD1C在牦牛隱睪組織中高表達。體外細胞試驗表明上調HIGD1C，可以激活促凋亡蛋白，促進牦牛支持細胞凋亡；反之，下調HIGD1C表達水平會抑制支持細胞凋亡。提示HIGD1C參與調控牦牛睪丸支持細胞的凋亡，為揭示牦牛隱睪的發生機制提供了參考。

關鍵詞：HIGD1C；隱睪癥；支持細胞；凋亡；牦牛

中圖分類號：S823.85

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2983-12

收稿日期：2023-11-06

基金項目：甘肅省動物生殖生理及繁殖調控重點實驗室（省科技計劃）（20JR10RA563）；中央引導地方科技發展資金專項（22ZY1QA004）

作者簡介：馬密蘭（1996-），女，甘肅天水人，碩士生，主要從事獸醫產科學研究，E-mail：18419142205@163.com

*通信作者：趙興緒，主要從事獸醫產科學研究，E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn

Expression of HIG1Hypoxia Inducible Domain Family Member1C in Cryptorchidism of

Yak and Its Regulatory Mechanism

MAMilan¹，WANGQi¹，YANQiu¹，LITianan¹，ZHAOXingxu^1，2*，ZHANGYong^1，2

（1.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou730070，China;

2.Gansu Provincial Key Laboratory of Animal Reproductive Physioiogy and

Reproductive Regulation，Lanzhou730070，China）

Abstract：The study aimed to investigate the effect of HIG1hypoxia inducible domain family member1C（HIGD1C）on apoptosis of sertoli cells in yak testis.In this study，3healthy male yaks aged3-6years and male yaks with cryptorchidism were selected，respectively as research materials，and their testis was collected.The regulation mechanism of HIGD1C on apoptosis of yak testicular sertoli cells was explored by HE staining，isolation and culture of yak testicular sertoli cells，indirect immunofluorescence，RT-qPCR，Western blot，HIGD1C overexpression and interference vector construction and in vitro cell transfection.The results showed that the basement membrane and interstitial tissue of normal testis were intact，the seminiferous tubules，peritubular muscle cells and sertoli cells were closely arranged，the seminiferous tubules in cryptorchidism were broken and atrophied，and the transcription and protein expression level of HIGD1C in yak cryptorchidism was significantly higher than that in normal testis（Plt;0.01）; HIGD1C protein was mainly distributed in leydig cells and sertoli cells; yak sertoli cells were successfully isolated and cultured; and HIGD1C protein was located in the nucleus of primary sertoli cells; after overexpression of HIGD1C，the mRNA expression level of Bcl-2was up-regulated（Plt;0.05），the protein expression level was significantly up-regulated（Plt;0.01），and the mRNA expression levels and protein expression levels of Bax and Caspase-3were significantly up-regulated（Plt;0.01），the results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of sertoli cells in HIGD1C overexpression group was significantly increased（Plt;0.01）.On the contrary，after HIGD1C knockout，the mRNA and protein expression levels of Bax，Bcl-2and Caspase-3were significantly down-regulated（Plt;0.01），the results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of sertoli cells in HIGD1C knockout group was significantly down-regulated（Plt;0.01）.The results of this study show that the normal testicular tissue structure is complete，the cryptorchidism stroma is loose，and HIGD1C is highly expressed in the cryptorchidism of yak.In vitro cell experiments showe that up-regulation of HIGD1C could activate pro-apoptotic proteins and promote apoptosis of yak sertoli cells.On the contrary，down-regulation of HIGD1C expression level will inhibit the apoptosis of sertoli cells.It is suggested that HIGD1C is involved in the regulation of apoptosis of yak testicular sertoli cells，which provides areference for revealing the mechanism of cryptorchidism in yak.

Key words：HIGD1C; cryptorchidism; sertoli cells; apoptosis; yak

*Corresponding author：ZHAO Xingxu，E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn

牦牛是青藏高原地區寶貴的畜禽資源之一，有“高原之舟”的美譽^[1]。未降睪丸稱之為隱睪^[2-3]，是一種雄性生殖系統常見的先天性畸形疾病，是導致公牦牛不育的重要原因之一。隱睪可引起睪丸組織發生缺血缺氧，從而使得生殖細胞發生凋亡、睪丸生精上皮紊亂，嚴重時可引起睪丸鈣化等改變^[4-5]。目前對牦牛等高海拔地區大型珍惜動物關于隱睪引起不育的研究很少，主要集中于一些試驗動物^[1]。支持細胞（sertoli cells，SCs）被認為是精原干細胞龕的關鍵組成部分^[6]，為生精細胞清除有害物質、提供一個穩定的生態微環境^[7]。確認精子正常發生的基本條件是保證支持細胞的數量^[8]。研究表明，在低氧誘導的動物模型中，睪丸支持細胞高度空泡化，與生殖細胞的連接受到破壞，生殖細胞與精子數量減少^[9-10]。

細胞凋亡（apoptosis）是一種遺傳性細胞主動死亡的過程，是維持多細胞生物組織穩態的關鍵機制^[11-13]。細胞凋亡的途徑主要分為外在途徑和內在途徑。細胞凋亡外在途徑是由死亡受體與細胞外死亡配體結合時啟動的^[14]。內在途徑又叫線粒體凋亡通路^[15]，Bcl-2蛋白家族成員把控著線粒體凋亡途徑，該家族包含約20種蛋白，能使細胞色素C釋放到機體細胞質中與Caspase-2/7/9共同激活Caspase-3^[16]，從而啟動導致細胞死亡的半胱天冬酶級聯反應^[17-18]。Bcl-2家族由3個亞家族組成：1）促進細胞凋亡效應的蛋白如Bax、Bak、Bcl-Xs、Bok等，參與了線粒體外膜的滲透，能夠增加細胞色素C的釋放；2）抗凋亡的Bcl-2家族成員如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、A1和Mcl-1等存活蛋白抑制了細胞凋亡^[19]；3）Bcl-2同源結構域3硼烷（BH3），如Bim、Bid、Puma等，能夠使抗凋亡蛋白失活。正常情況下，Bcl-2定位于線粒體外膜，并且抑制Bak和Bax構成寡聚體。而在細胞凋亡誘導后，抗凋亡蛋白降解，只釋放BH3蛋白，進而激活Bax^[20]。Bax促使細胞色素C釋放增多與Apaf-1結合以ATP的方式形成聚合物。最終，細胞死亡會在線粒體通透和ATP釋放后發生^[21]。研究表明，凋亡是在隱睪中導致生精細胞死亡的主要原因^[22]。在大鼠和成年小鼠中^[23-25]，隱睪促進促細胞凋亡蛋白表達量增加。阻斷大鼠睪丸內Caspase-2/7/9的激活，致使抑制凋亡蛋白表達量升高從而抑制細胞凋亡^[26]。而鄭航等^[27]的研究也提示，Bcl-2、Bax的表達在睪丸生殖細胞凋亡中扮演重要角色，表明Bcl-2和Bax蛋白可能與隱睪生精細胞的凋亡有密切關聯，為揭示高原物種隱睪的發生提供理論依據。

缺氧誘導基因1超家族（HIG1hypoxia inducible domain family member1，HIGD1）包括HIGD1A、HIGD1B、HIGD1C，均受缺氧誘導因子轉錄水平的調控^[28]。HIGD1C作為HIGD1家族的一員，是HIGD1A基因的同源基因^[29]，主要表達在腎臟和結腸^[30]。

在前期的研究中通過轉錄組測序發現，牦牛單側隱睪中HIGD1C基因的轉錄水平極顯著高于正常睪丸，推測HIGD1C可能參與了睪丸發育和隱睪的發生過程。然而關于HIGD1C調控隱睪發生的機制尚不完全清楚，為此本研究以牦牛睪丸支持細胞為研究材料，通過體外細胞模型探究HIGD1C對牦牛支持細胞凋亡的影響，進而揭示其對隱睪發生的調控機制，為揭示高原物種隱睪的發生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 牦牛睪丸樣品采集

本研究分別選用3頭3～6歲健康狀況良好的公牦牛和隱睪癥牦牛睪丸組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗睪丸組織表面，除去睪丸周圍的結締組織，將正常睪丸和隱睪組織分別快速切成小塊，一部分存于固定液中，用于病理組織學分析。另一部分置于液氮中，返回實驗室后轉移到-80 ℃冰箱冷凍，用于RNA和蛋白分析。

1.2 牦牛睪丸支持細胞體外培養

細胞培養的睪丸來自于健康成年牦牛，將牦牛睪丸迅速切除取下，使用PBS沖洗后低溫保存迅速帶回實驗室，立即用生理鹽水沖洗3次，再用含雙抗的PBS（37 ℃預熱）沖洗3次，將組織表面的血液去除干凈，剝掉鞘膜，使用PBS溶液沖洗之后通過傳遞倉將睪丸移入細胞間內間。在生物安全柜內剪開睪丸，剪下睪丸中心組織放置于無菌培養皿內，使用消毒剪刀將組織剪碎至糊狀，將膠原酶Ⅳ（1mg·mL^-1，索萊寶）與胰酶（0.25%，Gibco胰蛋白酶-EDTA）以1∶1的比例混勻加入糊狀組織中，放入37 ℃培養箱靜置30min直至有澄清出現。通過細胞篩將糊狀液體過篩移入離心管，1200r·min^-1離心8min，去除上清，加入完全培養基，混勻，1200r·min^-1離心8min。去除上清，使用完全培養基重懸細胞，接種至T25細胞培養瓶中，混勻，置于50mL·L^-1CO₂、37 ℃常規培養。待細胞生長貼壁后，24h更換完全培養基（10%FBS，89%DMEM，1%雙抗），待瓶中細胞密度達到80%后，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA進行反復多次純化，純化后的細胞繼續保持在50mL·L^-1CO₂、37 ℃繼續培養，純化后的支持細胞用Wilms腫瘤蛋白1（Wilms tumor protein-1，WT1）進行鑒定。

1.3 HE染色檢測睪丸和隱睪形態結構

取睪丸和隱睪組織，使用固定液固定，酒精脫水后包埋、切片，將石蠟切片經過二甲苯脫蠟和乙醇清洗后，蘇木素染色液染色8min，乙醇清洗后使用伊紅染色液染色3min。經脫水、透明和封片后，于顯微鏡下觀察染色結果。

1.4 間接免疫熒光染色鑒定蛋白分布

石蠟切片：取睪丸和隱睪組織石蠟切片，二甲苯脫蠟后使用乙醇清洗，檸檬酸鈉抗原修復液修復抗原；待冷卻至室溫再用5%的BSA溶液封閉1h，過夜孵育一抗（Rabbit Anti-HIGD1C，1∶200）、二抗（羊抗兔IgG，1∶200），再用3～5μg·mL^-1的DAPI染細胞核，PBS清洗切片，使用封片液封片，熒光顯微鏡觀察采集圖像。

細胞免疫熒光檢測WT1蛋白：體外培養的睪丸支持細胞用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化后，將細胞懸液接種至12孔板；待其恢復正常生長狀態，棄掉廢液，PBS清洗數次；使用固定液固定30min，PBS清洗數次；加入0.1%TritonX-100室溫通透細胞膜30min，封閉，過夜孵育一抗（Rabbit Anti-WT1，1∶200）、二抗（羊抗兔IgG，1∶200）；經DAPI復染細胞核，清洗，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 RT-qPCR測定mRNA表達水平

將牦牛睪丸和隱睪組織及細胞樣品根據TransZol UP RNA試劑盒說明書分別提取各組織和細胞總RNA；每個樣品取1μL Total RNA測定濃度，按EvoM-MLV反轉錄試劑盒操作說明中的兩步法進行第一鏈cDNA合成：第一步，gDNA Clean Reaction Mix Ver.22μL+Total RNA1 μL+RNase free water7μL，（42 ℃，2min；4 ℃，∞）；第二步，第一步反應液+5×EvoM-MLVRT Reaction Mix Ver.24 μL+RNase free water6 μL（37 ℃，15min，85 ℃，5s；4 ℃，∞）。

擴增程序采用兩步法：94 ℃30s，4 ℃5s，60 ℃30s，共40個循環；72 ℃延伸10s。引物序列見表1。所有PCR反應均重復3次，使用比較閾值循環（2^-ΔΔCT）方法計算，數值以相對表達值“平均值±標準差”表示，*表示Plt;0.05，**表示Plt;0.01。

1.6 Western blot檢測蛋白表達量

將睪丸和隱睪組織樣品經液氮研磨成粉末，稱取適量組織粉末并加入裂解液，在渦旋儀上迅速渦旋振蕩，12000r·min^-1離心10min后吸取上清保存于－80℃冰箱。將待用蛋白與蛋白變性液混勻，金屬浴12min變性后保存于－20 ℃冰箱；取適量總蛋白（組織或細胞樣品），12%SDS-PAGE分離蛋白，電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h，4 ℃過夜孵育一抗，GAPDH（1∶5000，博士德）、HIGD1C（1∶500，百奧譜芯）、Bax（1∶800，武漢三鷹）、Bcl-2（1∶800，武漢三鷹）、Caspase-3（1∶1000，武漢三鷹）。洗膜6次，每次5min，加羊抗兔二抗（Goat Anti-Rabbit IgG Hamp;L/HRP，1∶5000，博奧森）；37 ℃孵育1h，洗膜5次，每次6min，化學發光法ECL顯影。

1.7 HIGD1C過表達載體構建及沉默序列的合成

pIRES2-EGFP-HIGD1C過表達載體構建：用限制性內切酶（EcoR I）和（BamH I）分別對pMD18-HIGD1C及pIRES2-EGFP進行雙酶切，并進行瓊脂糖凝膠電泳以及膠回收，回收產物連接雙酶切的空載體，將連接體系轉化入大腸桿菌后，接種于LB平板上，37 ℃過夜，篩選發育優良的菌株進行酶切及測序鑒定。將含有pIRES2-EGFP-HIGD1C的菌株擴大培養，大量提取質粒，所有操作方法均按試劑盒說明書進行。質粒提取后進行酶切鑒定驗證，pIRES2-EGFP-HIGD1C的載體大小為306bp，用內切酶（（EcoR I、BamH I））37 ℃雙酶切2～4h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物；siRNA-HIGD1C序列由廣州銳博生物公司合成。

1.8 睪丸支持細胞體外轉染

轉染前將體外培養的牦牛睪丸支持細胞均勻接種至6孔板，過表達細胞轉染密度達80%～90%（siRNA轉染細胞密度約30%～50%），轉染前30min將6孔板中的廢液吸取干凈，更換新鮮的基礎培養基繼續培養。按照PolyJet^TM（美國，SignaGen）和LipoJet^TM（美國，SignaGen）說明書分組配制轉染試劑，輕輕混勻，靜置孵育30min，將配制好的轉染試劑均勻轉圈滴入6孔板中，晃動混勻，置于37 ℃、50mL·L^-1CO₂進行培養，10～14h后去除6孔板中的混合試劑，更換為新鮮完全培養基，將培養板置于培養箱中繼續培養至48h后可用于后續試驗。

1.9 流式細胞術檢測睪丸原代支持細胞凋亡率

PBS提前放入4 ℃冰箱中預冷。將轉染后的睪丸支持細胞消化，1000r·min^-1離心3min；使用預冷的PBS清洗細胞3次，1000r·min^-1離心3min，棄去PBS；加入100μL預冷的1×Binding Buffer，移液槍輕吹細胞，混勻，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PE，輕輕混勻。室溫孵育10min，結束后再每管加入400μL1×Binding Buffer，混勻，盡量在短時間內上機檢測（Annexin V-FITC/PE細胞凋亡檢測試劑盒）。

1.10 數據統計分析

利用Image-Pro Plus6.0軟件掃描測定條帶的灰度值，采用2^-△△CT方法計算蛋白表達量，采用SPSS26.0軟件進行分析，均數比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）方法，組間兩兩比較選用LSD-T檢驗法，*Plt;0.05表示差異顯著，**Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 HIGD1C功能分析

通過HE染色檢測形態結構分析顯示，正常睪丸基底膜及間質組織完整，曲細精管、管周肌細胞及支持細胞等排列緊密，而隱睪中曲細精管斷裂萎縮，伴發彌漫性壞死變性，精子生成細胞稀少分散（圖1A）。測序結果顯示：6個樣本組織重復性較好，與正常睪丸相比，HIGD1C在隱睪組織中的mRNA極顯著上調（Plt;0.01），且樣品重復性好（圖1B-D）。

2.2 HIGD1C在睪丸和隱睪組織中的表達及分布

以GAPDH為內參對牦牛睪丸和隱睪組織中HIGD1C表達量進行矯正，通過RT-qPCR及Western blot檢測轉錄及蛋白水平。RT-qPCR結果顯示，與正常睪丸相比，隱睪中HIGD1C mRNA水平極顯著升高（Plt;0.01）（圖2A）。Western blot結果顯示，蛋白表達水平與mRNA表達趨勢一致，隱睪中HIGD1C蛋白表達水平極顯著高于睪丸組織（Plt;0.01）（圖2B-C）。同時，為檢測HIGD1C蛋白在睪丸及隱睪中的分布情況，采用免疫熒光染色進行定位分析得到，在牦牛睪丸和隱睪組織中均能檢測到HIGD1C，其主要在間質細胞和支持細胞存在陽性表達，在生精細胞中幾乎不表達（圖2D）。

2.3 睪丸支持細胞鑒定、過表達載體HIGD1C驗證及轉染效率的檢測

酶切鑒定結果（圖3B）顯示雙酶切條帶明亮，經觀察對比發現，酶切后的質粒片段與預期大小相符（306bp），表明目的基因HIGD1C成功連入載體。將純化后的支持細胞利用WT1進行免疫熒光鑒定，結果如圖3A所示，WT1蛋白在細胞核中特異性表達（紅色），HIGD1C蛋白定位于細胞核（綠色）表明原代睪丸支持細胞可以用于后續試驗。RT-qPCR結果顯示，轉染過表達載體后，與對照組（NC）相比，HIGD1C的mRNA水平極顯著升高（Plt;0.01）（圖3C）；Western blot結果顯示，轉染過表達載體后，HIGD1C蛋白水平極顯著高于對照組（Plt;0.01，圖3D-E）。

2.4 過表達HIGD1C對細胞凋亡的影響

RT-qPCR結果顯示，與NC組相比，轉染過表達載體后，Bax、Bcl-2和Caspase-3基因mRNA表達水平均有升高，其中Bcl-2基因mRNA水平顯著高于對照組（Plt;0.05），Bax和Caspase-3基因mRNA表達水平極顯著高于對照組（Plt;0.01，圖4A-C）。Western blot結果與RT-qPCR結果一致，Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白均極顯著上調（Plt;0.01，圖4D-G）；流式細胞術結果顯示，與NC組相比，過表達HIGD1C組睪丸支持細胞凋亡率極顯著升高（Plt;0.01，圖4H-J）。以上結果表明過表達HIGD1C促進睪丸支持細胞凋亡的發生。

2.5 HIGD1C基因敲除效率的檢測

RT-qPCR結果顯示，與對照組（NC siRNA）相比，轉染HIGD1C-siRNA之后，HIGD1C mRNA水平顯著降低（Plt;0.05，圖5A）；Western blot結果顯示，與NC siRNA組相比，蛋白表達豐度與mRNA水平表達趨勢一致，呈極顯著下調（Plt;0.01，圖5B-C）。

2.6 HIGD1C基因敲除對細胞凋亡的影響

通過RT-qPCR和Western blot檢測敲除HIGD1C后凋亡相關標志分子（Bax、Bcl-2和Caspase-3）的變化。RT-qPCR結果顯示，與NC siRNA組相比，轉染HIGD1C-siRNA后，Bax、Bcl-2和Caspase-3基因mRNA表達水平均極顯著下調（Plt;0.01，圖6A-C）。Western blot結果表明，與NC siRNA組相比，轉染HIGD1C-siRNA后Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白均極顯著下調（Plt;0.01，圖6D-G）；流式細胞術結果顯示，轉染HIGD1C-siRNA組睪丸支持細胞凋亡率極顯著降低（Plt;0.01，圖6H-J）。以上結果表明HIGD1C基因敲除抑制睪丸支持細胞凋亡的發生。

3 討 論

支持細胞作為微環境中必不可少的細胞，為生殖細胞提供營養支持，引導雄性生殖細胞的發育和精子發生^[31-32]。基于支持細胞在雄性動物中的重要性，體外細胞試驗可以清楚的闡述支持細胞調控雄性生殖障礙的發生機制，為分子治療提供新的參考價值^[33-34]。本試驗基于前期的研究基礎，借助轉錄組測序及生物信息學分析等方法篩選發現HIGD1C基因的轉錄水平在隱睪中異常高表達。為此，利用RT-qPCR對HIGD1C的mRNA水平進行驗證，發現隱睪中的轉錄水平極顯著上調（Plt;0.01），進一步驗證發現隱睪組織HIGD1C的蛋白水平亦極顯著高于正常睪丸組織（Plt;0.01）。然而，關于HIGD1C相關的研究較少，在牦牛生殖中尚未見報道。眾所周知，HIGD1C是一種缺氧誘導相關基因，大量研究表明HIGD1C是一種與線粒體電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）復合體IV（complex IV，CIV）相關的新型線粒體蛋白，在介導小鼠缺氧時氧傳感和小鼠對缺氧的代謝反應中起關鍵作用^[35]，而對于HIGD1C與生殖細胞及細胞凋亡等相關研究目前甚少。本研究中，免疫熒光結果顯示HIGD1C在正常睪丸及隱睪中均有表達，且主要分布于間質細胞及支持細胞中。研究表明，睪丸間質細胞中含有大量線粒體，這些線粒體主要為雄激素合成提供場所^[36]。支持細胞對維持精子形成過程中的生態微環境起關鍵作用，其發育異常會導致不同程度精子生成細胞數量下降，使得雄性生殖產生障礙，而細胞異常凋亡就是其中之一。

Bcl-2和Caspase家族主要協調控制哺乳動物生殖細胞的凋亡^[37-38]。為了進一步驗證HIGD1C的功能，本研究構建HIGD1C過表達載體和siRNA序列，通過體外細胞轉染發現，上調HIGD1C的表達水平，Bcl-2mRNA表達水平顯著上調（Plt;0.05），蛋白表達豐度極顯著上調（Plt;0.01），Bax、Caspase-3轉錄和蛋白表達水平均極顯著上調（Plt;0.01），流式細胞術結果顯示過表達HIGD1C組支持細胞凋亡率極顯著上調（Plt;0.01）。Bax是Bcl-2家族重要的促細胞凋亡的蛋白，其能在線粒體中滴定Bcl-2等蛋白的抑制凋亡作用從而誘導細胞凋亡的發生^[39]。Bcl-2家族介導的細胞凋亡失調是很多疾病發生的基礎^[40]。本研究結果表明，過表達HIGD1C之后，Caspase及Bcl-2家族被激活，誘導睪丸支持細胞凋亡速率加快，流式細胞術的結果進一步證明了此推測。反之，HIGD1C敲除后，Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達水平和蛋白表達水平均極顯著下調（Plt;0.01），流式細胞術結果顯示HIGD1C敲除組支持細胞凋亡率極顯著下調（Plt;0.01）。故而在隱睪發生后，睪丸微環境的破壞導致HIGD1C的表達上調，異常表達的HIGD1C反過來促進支持細胞的凋亡。

高表達HIGD1C可能通過上調促凋亡蛋白Bax的表達量以及Caspase-3活化進而促進睪丸支持細胞凋亡，低表達HIGD1C可能通過抑制Caspase-3的釋放，進而影響睪丸支持細胞凋亡的進程。缺氧可引起線粒體發生變形腫脹^[41]。推測在牦牛隱睪中，睪丸微環境被破壞，睪丸支持細胞HIGD1C表達量增加，大量線粒體受到破壞導致細胞色素C泄漏與Caspase-9結合且激活Caspase-3導致支持細胞凋亡。有研究報道，HIGD1A基因是缺氧誘導因子1（HIF-1）的一種亞型，推測HIGD1C基因也可能是其亞型之一。而大量文獻報道，隱睪是由于睪丸長期處于低氧高溫等環境，導致其生殖能力發生障礙，而HIF是細胞在低氧環境中重要的適應性轉錄調節因子^[42]。在缺氧條件下，HIF-1信號通路直接或間接調控細胞凋亡、代謝和腫瘤的發生。有研究表明，當睪丸缺氧時，細胞凋亡相關基因有可能受到HIF-1的調控^[43]。HIF-1可能通過下調抑制凋亡蛋白的表達從而促進細胞凋亡的發生^[44]，引起生精細胞減少、睪丸組織纖維化等病理性改變^[45]。因此推測，HIGD1C與HIF-1可能存在密切關聯且將在后期有序進行相關研究。

4 結 論

前期的轉錄組測序發現牦牛隱睪中HIGD1C異常高表達。HE染色表明，正常睪丸組織結構完整，隱睪間質疏松，曲精細管發育不良并出現收縮，各級生殖細胞減少。RT-qPCR、Western blot及免疫熒光揭示HIGD1C在隱睪中高表達，主要分布在間質和支持細胞中。體外細胞試驗表明，上調HIGD1C可以促進支持細胞凋亡，下調HIGD1C表達水平會抑制細胞凋亡，揭示HIGD1C參與調控牦牛隱睪發生過程及支持細胞的凋亡，為揭示牦牛隱睪的發生及適應性提供理論基礎。

參考文獻（References）：

[1]張天留，高 雪，徐凌洋，等.高原家養動物環境適應性的研究進展[J].畜牧獸醫學報，2020，51（7）：1475-1487.

ZHANG TL，GAO X，XU LY，et al.Research progress on environment adaptation of plateau domestic animals[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2020，51（7）：1475-1487.（in Chinese）

[2]AMANN RP，VEERAMACHANENI DN R.Cryptorchidism in common eutherian mammals[J].Reproduction，2007，133（3）：541-561.

[3]GURNEY JK，MCGLYNN KA，STANLEY J，et al.Risk factors for cryptorchidism[J].Nat Rev Urol，2017，14（9）：534-548.

[4]PINART E，BONET S，BRIZ M，et al.Morphological and histochemical characteristics of the lamina propria in scrotal and abdominal testes from postpubertal boars：correlation with the appearance of the seminiferous epithelium[J].J Anat，2001，199（4）：435-448.

[5]SHARMA S，MANCHANDA V，GUPTA R.Testicular microlithiasis in aunilateral undescended testis：a rare phenomenon[J].Malays JPathol，2013，35（2）：181-183.

[6]PENG YJ，TANG XT，SHU HS，et al.Sertoli cells are the source of stem cell factor for spermatogenesis[J].Development，2023，150（6）：dev200706.

[7]MERONI SB，GALARDO MN，RINDONE G，et al.Molecular mechanisms and signaling pathways involved in sertoli cell proliferation[J].Front Endocrinol（Lausanne），2019，10：224.

[8]JOHNSON L，THOMPSON DL，VARNER DD.Role of sertoli cell number and function on regulation of spermatogenesis[J].Anim Reprod Sci，2008，105（1-2）：23-51.

[9]FARIAS JG，BUSTOS-OBREGóN E，ORELLANA R，et al.Effects of chronic hypobaric hypoxia on testis histology and round spermatid oxidative metabolism[J].Andrologia，2005，37（1）：47-52.

[10]ZHANG DC，CHEN R，CAI YH，et al.Hyperactive reactive oxygen species impair function of porcine sertoli cells via suppression of surface protein ITGB1and Connexin-43[J].Zool Res，2020，41（2）：203-207.

[11]RIWALDT S，CORYDON TJ，PANTALONE D，et al.Role of apoptosis in wound healing and apoptosis alterations in microgravity[J].Front Bioeng Biotechnol，2021，9：679650.

[12]NALLURI S，GHOSHAL-GUPTA S，KUTIYANAWALLA A，et al.TIMP-1inhibits apoptosis in lung adenocarcinoma cells via interaction with Bcl-2[J].PLoS One，2015，10（9）：e0137673.

[13]張勤麗，牛 僑.細胞凋亡機制概述[J].環境與職業醫學，2007，24（1）：102-107.

ZHANG QL，NIU Q.Mechanism of cell apoptosis[J].Journal of Environmental and Occupational Medicine，2007，24（1）：102-107.（in Chinese）

[14]IVANISENKO NV，SEYREK K，HILLERT-RICHTER LK，et al.Regulation of extrinsic apoptotic signaling by c-FLIP：towards targeting cancer networks[J].Trends Cancer，2022，8（3）：190-209.

[15]LAUBACH V，KAUFMANN R，BERND A，et al.Extrinsic or intrinsic apoptosis by curcumin and light：still amystery[J].Int JMol Sci，2019，20（4）：905.

[16]張聰慧.人工隱睪誘發小鼠睪丸組織的自噬與凋亡[D].楊凌：西北農林科技大學，2016.

ZHANG CH.Cryptorchidisminduce autophagy and apoptosis in the mouse testis[D].Yangling：Northwest Aamp;F University，2016.（in Chinese）

[17]GUO Y，TAN J，MIAO YY，et al.Effects of microvesicles on cell apoptosis under hypoxia[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：5972152.

[18]陳韋任，杜 輝，錢 賡，等.Bax抑制因子1通過促進視神經萎縮蛋白1表達抑制小鼠動脈血管鈣化[J].南方醫科大學學報，2022，42（3）：330-337.

CHEN WR，DU H，QIAN G，et al.Bax inhibitor1inhibits vascular calcification in mice by activating optic atrophy1expression[J].Journal of Southern Medical University，2022，42（3）：330-337.（in Chinese）

[19]CAO XY，FU MY，BI RC，et al.Cadmium induced BEAS-2B cells apoptosis and mitochondria damage via MAPK signaling pathway[J].Chemosphere，2021，263：128346.

[20]EISENBERG-LERNER A，BIALIK S，SIMON HU，et al.Life and death partners：apoptosis，autophagy and the cross-talk between them[J].Cell Death Differ，2009，16（7）：966-975.

[21]范小瑞.豬隱睪睪丸精子發生障礙的分子機制研究[D].太谷：山西農業大學，2021.

FAN XR.Study on the molecular mechanism of spermatogenesis disorder in cryptorchidism boars[D].Taigu：Shanxi Agricultural University，2021.（in Chinese）

[22]KOCAK I，DUNDAR M，HEKIMGIL M，et al.Assessment of germ cell apoptosis in cryptorchid rats[J].Asian JAndrol，2002，4（3）：183-186.

[23]TEKAYEV M，BOSTANCIERI N，SAADAT KA SM，et al.Effects of Moringa oleifera lam extract（MOLE）in the heat shock protein70expression and germ cell apoptosis on experimentally induced cryptorchid testes of rats[J].Gene，2019，688：140-150.

[24]STAUB C，JOHNSON L.Review：spermatogenesis in the bull[J].Animal，2018，12（S1）：S27-S35.

[25]WANG J，GAO WJ，DENG SL，et al.High temperature suppressed SSC self-renewal through Sphase cell cycle arrest but not apoptosis[J].Stem Cell Res Ther，2019，10（1）：227.

[26]JOHNSON C，JIA Y，WANG C，et al.Role of caspase2in apoptotic signaling in primate and murine germ cells[J].Biol Reprod，2008，79（5）：806-814.

[27]鄭 航，鄭新民，李世文，等.Bcl-2/Bax基因表達對隱睪生殖細胞凋亡的影響[J].中國男科學雜志，2000，14（2）：81-82，85.

ZHENG H，ZHENG XM，LI SW，et al.Bcl-2/Bax expression and testicular germ cell apoptosis in experimental cryptorchidism[J].Chinese Journal of Andrology，2000，14（2）：81-82，85.（in Chinese）

[28]BEDóG，VARGAS M，FERREIRO MJ，et al.Characterization of Hypoxia induced gene1：expression during rat central nervous system maturation and evidence of antisense RNA expression[J].Int JDev Biol，2005，49（4）：431-436.

[29]CHIRICOSTA L，GUGLIANDOLO A，DIOMEDE F，et al.Moringin pretreatment inhibits the expression of genes involved in mitophagy in the stem cell of the human periodontal ligament[J].Molecules，2019，24（18）：3217.

[30]ZHU JY，CHEN M，MU WJ，et al.The functional role of higd1a in mitochondrial homeostasis and in multiple disease processes[J].Genes Dis，2023，10（5）：1833-1845.

[31]OATLEY MJ，RACICOT KE，OATLEY JM.Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis[J].Biol Reprod，2011，84（4）：639-645.

[32]ZHENG Y，GAO Q，LI TJ，et al.Sertoli cell and spermatogonial development in pigs[J].J Anim Sci Biotechnol，2022，13（1）：45.

[33]WEN YJ，MA XX，WANG XL，et al.HnRNPU in sertoli cells cooperates with WT1and is essential for testicular development by modulating transcriptional factors Sox8/9[J].Theranostics，2021，11（20）：10030-10046.

[34]LIU B，CUI YH，CHEN W，et al.Hsa-mir-100-3p controls the proliferation，DNA synthesis，and apoptosis of human sertoli cells by binding to SGK3[J].Front Cell Dev Biol，2021，9：642916.

[35]TIMóN-GóMEZ A，SCHARR AL，WONG NY，et al.Tissue-specific mitochondrial HIGD1C promotes oxygen sensitivity in carotid body chemoreceptors[J].Elife，2022，11：e78915.

[36]DOBASHI M，FUJISAWA M，YAMAZAKI T，et al.Inhibition of steroidogenesis in leydig cells by exogenous nitric oxide occurs independently of steroidogenic acute regulatory protein（star）mRNA[J].Arch Androl，2001，47（3）：203-209.

[37]XU YR，DONG HS，YANG WX.Regulators in the apoptotic pathway during spermatogenesis：Killers or guards？[J].Gene，2016，582（2）：97-111.

[38]ALLAN LA，CLARKE PR.A mechanism coupling cell division and the control of apoptosis[J].SEB Exp Biol Ser，2008，59：257-265.

[39]YEE YH，CHONG SJ F，PERVAIZ S.The anti-oxidant and pro-oxidant dichotomy of Bcl-2[J].Biol Chem，2016，397（7）：585-593.

[40]KVANSAKUL M，CARIA S，HINDS MG.The Bcl-2family in host-virus interactions[J].Viruses，2017，9（10）：290.

[41]葉超群，黃會芝.線粒體HIGD1A在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的研究進展[J].中國醫學創新，2022，19（32）：184-188.

YE CQ，HUANG HZ.Research progress of mitochondrial higd1a in hypoxic-ischemic brain damage in newborn[J].Medical Innovation of China，2022，19（32）：184-188.（in Chinese）

[42]周克文，鄭新民.單側隱睪對側睪丸損害與HIF-1α和VEGF的關系[J].醫學新知雜志，2006，16（5）：283-285.

ZHOU KW，ZHENG XM.Relationship of the damage of contralateral testis of unilateral cryptorchidism to the expression of hypoxia inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor[J].New Medicine，2006，16（5）：283-285.（in Chinese）

[43]POWELL JD，ELSHTEIN R，FOREST DJ，et al.Stimulation of hypoxia-inducible factor-1alpha（HIF-1α）protein in the adult rat testis following ischemic injury occurs without an increase in HIF-1α messenger RNA expression[J].Biol Reprod，2002，67（3）：995-1002.

[44]IIDA T，MINE S，FUJIMOTO H，et al.Hypoxia-inducible factor-1α induces cell cycle arrest of endothelial cells[J].Genes Cells，2002，7（2）：143-149.

[45]柴思敏.哺乳動物睪丸位置的演化和健康“隱睪”的分子進化機制[D].南京：南京師范大學，2021.

CHAI SM.The evolution of mammalian testis position and the molecular evolutionary mechanism of healthy cryptorchidism[D].Nanjing：Nanjing Normal University，2021.（in Chinese）

（編輯 郭云雁）