日本腦炎病毒免疫逃逸分子機制研究進展

摘 要：日本腦炎（Japanese encephalitis，JE）是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種蚊媒性人獸共患傳染病，雖然已有商品化疫苗，但疫苗的預防具有一定的局限性且至今尚無有效藥物治療，一旦暴發將威脅人們的生命健康和公共安全，造成重大經濟損失。JEV含有數量眾多具有免疫逃逸功能的編碼蛋白，這些蛋白逃逸宿主免疫功能的機制多樣且復雜，但其機制仍不完全清楚。同時，JEV復雜的免疫逃逸機制可能是阻礙疫苗免疫保護效果的關鍵因素。因此，本文主要對JEV通過抑制干擾素反應，調節細胞凋亡、焦亡、自噬及宿主miRNA等多種途徑逃逸機體先天免疫和適應性免疫機制進行概述，以期為JEV致病機理的研究和疫苗研發提供思路與理論基礎。

關鍵詞：日本腦炎病毒；免疫逃逸；天然免疫；適應性免疫

中圖分類號：S852.65

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2368-11

收稿日期：2023-09-11

基金項目：貴州大學重點項目（黔科合平臺人才[2018]5781-8）；國家自然科學基金（31860716）

作者簡介：何 松（1999-），男，貴州銅仁人，碩士生，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究，E-mail：1740068560@qq.com

*通信作者：湯德元，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合研究及教學工作，E-mail：tdyuan@163.com

Advances inResearch Progress on the Molecular Mechanisms of Immune Escape of Japanese

Encephalitis Virus

HESong，TANGDeyuan^*，ZENGZhiyong，WANGBin，HUANGTao，MAOYinming，

ZHOUPiao，LIAOZhengbo，CHENXu，YUANShenglin，HUWenwen，ZHOUMin

（College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou550025，China）

Abstract：Japanese encephalitis（JE）is amosquito-borne animal disease caused by Japanese encephalitis virus（JEV），although there are commercially vaccines are availabe，however，the prevention of vaccines has certain limitations and there is no effective drug treatment so far，and once the outbreak will threatenoccurs，people′s life and health andas well as the public safety will be threatened，thus resulting in significant economic losses.JEV contains alarge number of encoded proteins with immune escape function.The mechanism of these proteins escaping host immune function is diverse and complex，and the mechanism is still not fully understoodof which still remains unclear.At the same time，the complex immune escape mechanism of JEV may be the key factor hindering the immune protection effect of vaccine.Therefore，this paper mainly summarizes the mechanism of JEV escaping innate and adaptive immunity by inhibiting interferon response，regulating apoptosis，pyroptosisdeath，autophagy and host miRNA to provide ideas and theoretical basis for the research of JEV pathogenesis and vaccine development.

Key words：Japanese encephalitis virus; immune escape; innate immunity; adaptive immunity

*Corresponding author：TANG Deyuan，E-mail：tdyuan@163.com

日本腦炎（Japanese encephalitis，JE）又稱乙腦，其病原為JE病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）。JE最先發現于日本，1934年日本學者從人和馬的腦組織中分離到了JEV，首次確定了該病的病原，我國于1939年分離到JEV^[1]。庫蚊是JEV主要的傳播媒介，豬是其主要的儲存宿主、擴增宿主和傳染源，通?？尚纬伞柏i-蚊-人”的循環傳播模式。JE屬于自然疫源性疾病，人和多種動物均可感染，其中人感染后會出現發燒并發展為腦炎，對人的致死率高達30%，即使幸存，也有近50%的幾率出現神經性后遺癥；豬群感染后可引起妊娠母豬流產、產死胎，公豬睪丸炎等繁殖障礙，其他動物多為隱性感染^[2-3]。

JEV僅有一個血清型，根據E基因序列的同源性差異，可將JEV分為5個基因型（GⅠ～GⅤ），5種基因型在地理位置分布、毒力和宿主適應性上具有一定的差異^[4]。JEV生物學特性復雜，編碼多種蛋白，目前已證實與逃逸相關的病毒蛋白有prM、E、NS1、NS1′、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等，參與抑制Ⅰ型干擾素（IFN）反應、調節細胞凋亡、焦亡、自噬及宿主miRNA等信號通路并影響獲得性細胞免疫。本文總結了JEV逃逸天然免疫和適應性免疫應答相關機制的國內外研究進展，以期為JEV的致病機理與疫苗研發提供思路。

1 JEV的結構特征及其感染與復制

1.1 JEV的結構特征

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種線性單鏈RNA病毒，基因組大小約為11kb，具有二十面體核衣殼，直徑大小40～60nm之間，外層被直徑約30nm的脂質雙層包裹^[5]。由于脂質雙層的存在，JEV很容易被有機溶劑滅活。JEV基因組在5′端具有甲基化帽結構，但缺乏3′末端聚腺苷酸尾，并以保守的CU區域終止，在兩個短但高度結構化的5′和3′非編碼區之間編碼一個超過1000個堿基的長開放閱讀框（ORF），形成長程分子內RNA-RNA相互作用，以調節JEV翻譯和RNA復制^[6]。JEV基因組被釋放到細胞質后，被翻譯成單一的多蛋白前體，多蛋白在宿主和病毒蛋白酶轉錄后被共翻譯和翻譯后加工成10種不同的產物，即3種結構蛋白（衣殼蛋白C、前膜prM和包膜蛋白E）及7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）^[7-8]。其中，JEV的衣殼蛋白C以反向平行方式二聚化，多個衣殼蛋白C二聚化形成球形核衣殼，包裹JEV基因組；多蛋白被信號肽共翻譯切割后分裂為prM，并開始在含有內質網囊泡的病毒基因組RNA處組裝，之后，囊泡從內質網中出芽并到達高爾基體網絡，prM被弗林蛋白酶切割成M蛋白，并在從宿主細胞釋放之前形成成熟的病毒顆粒；包膜蛋白E負責與宿主細胞受體結合并與宿主質膜融合，在JEV入侵宿主細胞過程中起到關鍵作用；其他7種非結構蛋白（NSP）參與了JEV生命周期各個階段，包括核酸復制、病毒顆粒組裝、免疫逃逸及病毒入侵等^[9]。此外，在感染JEV和其他JE血清群成員期間，由于NS2A密碼子8-9處發生-1核糖體移碼，額外添加52個氨基酸，還會產生NS1衍生物NS1′。

1.2 JEV的感染及復制

JEV對宿主細胞的感染是一個動態過程，包括病毒的入侵、復制、組裝和釋放，涉及多種宿主因子與病毒間的相互作用。首先，病毒顆粒在細胞表面附著受體糖氨基聚糖（GAGs）^[10]、硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）^[11]、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3（ICAM-3）^[12]等作用下在細胞周圍聚集并與靶細胞結合。隨后，病毒顆粒與熱休克蛋白（HSP）70^[13]、αvβ3^[14]、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）等進入受體相互作用，從而觸發受體介導的依賴性網格蛋白或非依賴性網格蛋白的內吞作用。內化后，病毒顆粒穿過內體成熟途徑，在酸性條件下誘導病毒E蛋白發生構象變化，從而實現病毒和內體膜之間的融合。當病毒基因組RNA釋放到細胞質中后，生成RNA復制和病毒粒子組裝所必需的結構蛋白和非結構蛋白?；蚪MRNA在結構重排的內質網（ER）衍生膜囊泡內的復制復合體中進行復制，病毒RNA復制由NS3和NS5催化，這兩種最大且最保守的非結構蛋白在負鏈和正鏈RNA合成、RNA加帽和帽甲基化方面協調其多種酶活性。在RNA復制期間或復制后不久，新合成的基因組RNA和C蛋白的復合物被ER膜上的兩種病毒糖蛋白（prM和E）包裹，產生未成熟的病毒粒子。隨后，病毒RNA與3種結構蛋白相互作用促進未成熟顆粒出芽進入ER腔并被轉運通過反式高爾基體網絡，其中prM被切割成含有M和E同二聚體的成熟病毒粒子。最后，部分和完全成熟的病毒粒子通過胞吐作用被釋放到細胞外^[15-16]。

JEV感染宿主后，首先在皮膚的樹突狀細胞（DC）中復制，通過細胞歸巢進入局部淋巴結，并隨血液循環和淋巴系統傳播至多個身體器官（如心、肝、脾和肌肉），在此過程中由受感染的遷移性免疫細胞（如朗格漢斯細胞）承擔轉運作用，引起繼發性病毒血癥。隨后，JEV穿過腦微血管內皮細胞進入中樞神經系統（CNS）。JEV侵入中樞神經系統后不會事先破壞其感染神經元的血腦屏障通透性，而是誘導受感染的神經元產生趨化因子和細胞因子（包括CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4和CCL5），這些趨化因子可以誘導神經膠質細胞的激活，進而產生大量的炎癥趨化因子和細胞因子（TNF-α、IL-6和IFN-γ）。一方面，這些炎癥介質可以通過減少緊密連接蛋白的表達來破壞血腦屏障（BBB），從而破壞微血管內皮細胞之間緊密連接的完整性；另一方面，炎癥介質可以通過誘導BBB內皮細胞上黏附分子的表達增加，進一步損害BBB屏障，從而增加炎癥細胞從外周到CNS的浸潤，加劇神經炎癥和神經元損傷^[17-19]，營造有利于自身復制的環境。此外，JEV也能感染神經干細胞，導致室管膜下區的功能損傷，但JEV感染神經干細胞能夠明顯降低細胞的增殖能力，影響損傷神經元的修復再生，這可能是JE幸存者伴隨有神經系統后遺癥的原因^[20]。

2 JEV免疫逃逸機制

2.1 JEV調節細胞凋亡

細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡（PCD），是多細胞生物用來消除衰老、受損或感染細胞的一種自我保護機制，其途徑包括：死亡受體介導凋亡、細胞線粒體介導凋亡以及內質網應激（ERS）介導凋亡。許多研究表明，細胞凋亡在病毒感染的發病機制中發揮著重要作用。細胞凋亡作為一種關鍵的先天防御機制，在抑制病毒復制并清除病毒感染的細胞和維持機體正常的免疫功能中具有重要意義。然而，許多病毒已經進化出多種機制來防止或延遲復制過程中細胞過早地發生凋亡，以促進子代病毒的產生和傳播。在感染后期，病毒則主動誘導細胞凋亡以抑制炎癥信號的產生，進而阻止免疫反應對子代病毒的清除。

C/EBP同源蛋白（CHOP）屬于轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）家族，對細胞增殖、分化和表達相關過程的調節具有重要作用。正常情況下，CHOP在細胞中的表達水平較低，但當應對ERS時，CHOP會大量表達，CHOP的過度表達不僅會引發細胞周期停滯，還會導致多種細胞凋亡^[21]。Su等^[22]研究發現，JEV感染的BHK-21細胞中CHOP表達水平顯著上調并誘導細胞凋亡，通過過表達抗凋亡蛋白Bcl-2或半胱氨酸蛋白酶（caspase）抑制劑z-VAD-fmk抑制CHOP表達，則減少了細胞凋亡，而在缺乏CHOP誘導的情況下，K562細胞在JEV感染后未出現細胞凋亡，表明JEV可通過調控CHOP的表達水平來誘導細胞凋亡進而促進自身擴散。同時，對感染JEV的神經干細胞進行蛋白質組學分析顯示，ER駐留伴侶GRP78、線粒體蛋白Prohibitin（PHB）和異質核核糖核蛋白（hnRNPC）三種蛋白與JEV RNA相互作用，進而引起ERS反應相關蛋白的表達失調，表明持續的ERS可誘導細胞凋亡^[23]。

此外，JEV編碼的蛋白在調節細胞凋亡中也發揮著重要作用。研究表明，JEV可通過其編碼的NS4B蛋白與蛋白激酶樣ER激酶（PERK）相互作用，通過觸發PERK/eIF2-α/ATF4/CHOP凋亡途徑，在體外和體內激活誘導神經元凋亡。進一步分析顯示，NS4B蛋白的LIG-FHA和LIG-WD40結構域均能誘導PERK二聚化，而JEV NS4B突變體的過度表達則不會引起細胞凋亡和腦炎，表明JEV NS4B蛋白通過不同基序與兩個PERK分子相互作用將其聚集進而誘導細胞凋亡和腦炎^[24]，提示了NS4B在JEV誘導的細胞凋亡和腦炎中起著重要作用，這為今后以NS4B作為抗JEV分子靶點提供了思路，為研發NS4B相關拮抗劑治療JEV引起的腦炎提供了一種新的方法。Guo等^[25]對受病毒感染的神經元和小鼠腦組織的轉錄組綜合分析表明，叉頭框蛋白（Foxo）可以上調凋亡蛋白Bim、抗凋亡蛋白Bcl-6和p21等凋亡相關基因的表達促進細胞存活，而在JEV感染的情況下，JEV下調STAT3表達來降低Foxo表達，從而抑制Foxo-p21/Bcl-6信號通路誘導神經元細胞凋亡，這為JEV誘發腦炎提供了新的見解。另外，低劑量的JEV（MOI=0.5）感染人腦微血管內皮細胞（THBMEC）會上調促凋亡蛋白Bax、Bid、Fas和FasL表達，激活caspase通路從而誘導細胞凋亡過程，與促凋亡蛋白相同，另一項研究表明，在JEV感染的神經母細胞瘤細胞中，信號分子p53可能發生上調，從而直接調節細胞凋亡過程，但在高劑量JEV（MOI=10）感染的THBMEC中，p53顯著下調，這說明高劑量JEV在感染細胞后未誘導細胞凋亡^[26-27]。上述結果表明，在低劑量JEV的情況下，促凋亡蛋白誘導細胞凋亡有助于阻止病毒復制并防止其產生感染性子代病毒。當JEV劑量較高時，大多數促凋亡蛋白都會減少，這意味著病毒有能力抑制宿主細胞凋亡機制，從而完成病毒生命周期以建立持續感染。除上述研究之外，在JEV蛋白中，與人髓母細胞瘤細胞中單獨表達E、NS1、NS2B或NS3蛋白酶相比，JEV NS3蛋白酶與NS2B輔因子共表達不僅能顯著誘導線粒體細胞色素C在細胞質中的釋放，引發更高的caspase3/7活性，導致更高程度的神經元凋亡，而且還刺激ASK1/ERK1/p38-MAPK通路和細胞中活性氧（ROS）的產生來介導神經元凋亡^[28-30]，這在細胞和分子水平上進一步闡釋了JEV通過誘導細胞凋亡來逃逸宿主的免疫機制。由于JEV引起的神經元凋亡是該病毒的重要發病機制中的一個主要機制，所以減少JEV感染引起的神經元凋亡，開發相關神經保護劑并與抗病毒復制劑聯用以減輕JEV引起的神經系統后遺癥或將成為今后的研究重點。

2.2 JEV調節壞死性凋亡和細胞焦亡

壞死性凋亡和焦亡是相對較新的程序性細胞死亡形式。壞死性凋亡是由死亡受體、細胞內外核酸檢測傳感器或一些其他刺激通過結合蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3和混合譜系激酶域樣蛋白（MLKL）的壞死體觸發的。RIPK3對MLKL的激活/磷酸化導致鈉離子和鈣離子的異常流動以及隨后質膜上孔的形成，提示了MLKL是壞死性凋亡的執行者^[31-32]。細胞焦亡是由炎性半胱天冬酶誘導的，它們通過蛋白水解加工Gasdermin D蛋白來啟動細胞焦亡，產生一個穿透質膜的N末端片段，導致細胞破裂^[33]，細胞破裂后導致炎性細胞因子釋放，從而加劇壞死性凋亡和細胞焦亡。這兩個過程作為宿主防御機制可被宿主細胞用來抵抗病原體感染。

JEV感染期間，在神經元和小鼠腦組織中發現了MLKL介導的壞死性凋亡，抑制MLKL可減弱炎性細胞因子的產生，緩解腦炎的進程，但目前尚不清楚JEV感染期間MLKL誘導細胞壞死性凋亡的確切機制^[34]。TNF-α是多種腦部疾病中通過TNF-α/TNFR1/RIPK1/RIPK3/MLKL通路導致壞死性凋亡的重要刺激因子。由于TNF-α也是JE的主要介質之一，因此推測MLKL可能通過TNF-α介導的機制誘導壞死性凋亡^[35-36]。所以，未來針對靶向壞死性凋亡可能為開發治療JEV引起的腦炎提供新的途徑。AXL（一種受體酪氨酸激酶）是一種跨膜蛋白，可以促進多種黃病毒的復制，然而，AXL在JEV感染宿主過程中的作用尚未確定，Xie等^[37]研究發現，JEV NS2B-3蛋白能與AXL特異性相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑促進AXL降解使其在JEV感染后期下調，AXL降解后通過破壞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號轉導來增加細胞壞死性凋亡并促進JEV釋放到上清液中，從而減少細胞裂解物中的病毒量。此外，在缺失AXL的小鼠模型中，AXL缺陷通過抑制PI3K/Akt信號通路來增強JEV感染的巨噬細胞的細胞焦亡，焦亡的巨噬細胞在血清中釋放大量IL-1α，進而通過破壞BBB介導JEV神經侵襲，并在小鼠中誘發JE^[38]。目前，人們對于JEV感染期間壞死性凋亡和細胞焦亡的作用知之甚少。因此，進一步研究壞死性凋亡和細胞焦亡的機制及不同途徑之間的相互作用可為開發相關拮抗劑防治JE提供新方法。

2.3 JEV調節細胞自噬

自噬是一個進化上相對保守的過程，其過程主要包括三個步驟，從囊泡的成核和延伸開始形成吞噬泡，然后吞噬泡的邊緣融合以組裝自噬體。最后，自噬體通過與內體（后稱為兩性體）或溶酶體膜融合而成熟為自溶酶體^[39]。在正常條件下，自噬維持細胞穩態，并且在感知到營養饑餓和病原體入侵等應激條件時可以被快速誘導^[40]。除了維持細胞穩態外，已知自噬在包括JEV在內的多種病毒的復制過程中發揮著關鍵作用，其最廣泛使用的激活指標是微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）在細胞質中的聚集，該聚集通過與磷脂酰乙醇胺的綴合進行修飾，并靶向標記自噬液泡的自噬膜。研究表明，JEV感染宿主細胞后，能上調LC3蛋白的表達以及增加自噬體/自溶酶體，而自噬體和溶酶體之間的融合對于JEV復制至關重要，并且敲低自噬相關基因（如Rab7、LAMP2、ATG5和Beclin-1）可減少JEV RNA和蛋白質水平，同時，上調I型IFN和細胞因子表達、促進干擾素調節因子3（IRF3）和線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）磷酸化以抑制JEV復制^[41]，表明JEV可利用自噬作為免疫逃避機制。聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）是PARP家族的成員，在維持基因組穩定性、轉錄和細胞能量代謝中發揮著重要作用，能通過轉錄因子FoxO調節細胞死亡和自噬，研究表明，JEV感染神經元后上調PARP1，PARP1通過增加FoxO活性負向調節Akt促進細胞自噬和JEV發病機制^[42]，表明PARP1是JEV感染的潛在治療靶點。此外，在JEV感染神經元期間，自噬與ERS途徑之間存在直接聯系，siRNA介導的對肌醇需求酶1（IRE1）和ATF6介導的ERS途徑（而非PERK/eIF2-α介導的途徑）的抑制，在JEV感染小鼠神經元細胞期間抑制了自噬并加劇了細胞凋亡^[43]。

與上述發現相反，一些報告表明，自噬與JEV復制之間存在負反饋，表明自噬是針對JEV的宿主防御機制。在缺乏ATG7蛋白的小鼠神經細胞中，觀察到感染性JEV顯著增加，并且這些細胞對病毒誘導的細胞凋亡高度敏感。進一步分析顯示，JEV復制復合物（NS1蛋白和復制中間體dsRNA）與LC3-I和ER相關降解途徑標記EDEM1（ER降解增強劑）共定位，這表明JEV復制發生在由LC3-I組成的EDEMosomes上^[44]。JEV感染小鼠神經元和成纖維細胞后誘導的ATF3與ATG5、IRF9、STAT1和ISG15基因的啟動子序列結合，從而抑制自噬和抗病毒反應^[45]。此外，JEV在人神經元細胞中誘導Nedd4（E3泛素連接酶）表達，但在非神經元細胞中則通過抑制自噬來促進JEV復制，表明Nedd4在JEV感染神經元細胞中具有重要作用，這為開發新的抗病毒拮抗劑來防治JE提供了潛在的靶標^[46]。

綜上，在不同宿主或相同宿主的不同細胞中，細胞自噬對病毒的作用不盡相同。一方面，病毒侵入宿主后通過誘導細胞自噬以逃逸宿主的免疫機制進而促進病毒自身的復制，建立持續的感染。另一方面，細胞自噬作為宿主免疫反應的一個組成部分，宿主可以利用細胞自噬來恢復受損的細胞器并靶向和降解一些病毒蛋白從而起到抗病毒的作用。但JEV感染宿主后如何調控細胞自噬以逃避宿主細胞的抗病毒反應、宿主又是怎樣利用細胞自噬防御病毒感染的確切機制仍不清楚，有待未來進一步研究。

2.4 JEV調節宿主microRNA

MicroRNA（miRNA）是一種小型非編碼RNA，miRNA的表達和靶向結合病毒基因組能夠參與細胞的抗病毒免疫反應。很多時候，宿主miRNA在病毒的生命周期中通過復雜的調控途徑來促進或抑制其對宿主的感染。miRNA也可以由病毒基因組編碼并在宿主細胞中表達，病毒miRNA可以與宿主miRNA擁有共同的序列，或者具有完全不同的序列。因此，JEV調控宿主miRNA的表達和功能對JE的發生具有極其重要的作用^[47]。

研究表明，JEV感染小膠質細胞或星形膠質細胞期間上調miR-29b、miR-19b-3p、miR-15b和miR-301a表達，并通過靶向腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（TNFAIP3）、RNF11、RNF125和NKRF的表達增強NF-κB活性，促進TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的生成并引起腦炎^[48-50]。另外，JEV誘導的miR-155通過靶向小鼠小膠質細胞中的肌醇5′-磷酸酶SHIP1正向調節NF-κB活性，而在JEV感染人小膠質細胞期間，相同的miRNA通過減弱IRF8和NF-κB通路介質來負調節先天免疫反應，這表明JEV在不同物種中利用不同機制調節宿主miRNA，具有物種特異性^[51-52]。同時，JEV JaOArS982株感染小膠質細胞后誘導miR-146a靶向腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）、白細胞介素1受體相關激酶（IRAK）1/2和STAT1以負向調節NF-κB和JAK/STAT信號傳導以逃避宿主免疫反應，而在相同細胞模型系統中，JEV P20778毒株具有相反的作用^[53]，表明不同JEV毒株在相同細胞中能誘導不同機制為自身復制創造有利環境。此外，除了神經膠質細胞外，JEV感染還可以調節神經元細胞中的miRNA的表達，如上調miR-301a抑制IRF1和SOCS5的表達量，阻斷I型IFN反應并促進小鼠神經元細胞中JEV的發病機制^[54]。

2.5 JEV抑制IFN反應

IFN系統是宿主最重要的抗病毒防御機制之一。它分為兩個主要途徑：IFN激活和IFN信號傳導。IFN激活途徑涉及模式識別受體（PRRs）對病毒RNA的識別，識別病毒RNA的PRRs主要可分為兩大類。第一類包括膜結合Toll樣受體（TLRs）（如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9），它們主要在免疫細胞中表達，可以感知胞外病原體相關分子模式（PAMPs）或體內的病毒核酸；第二類由不同的細胞內PRRs家族組成，它們在大多數哺乳動物的細胞質或細胞核中表達，如視黃酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）、黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）等，它們特異性感知細胞質中非自身病毒RNA^[55-56]。研究表明，宿主針對JEV的先天免疫反應主要是由細胞質RLRs和MDA5對病毒RNA的識別觸發，在病毒RNA傳感后，RLRs會發生構象變化，并通過與MAVS相互作用，導致IKKε和TANK結合激酶1（TBK-1）的激活，從而磷酸化NF-κB和IRF3。隨后，NF-κB和IRF3易位到細胞核中，驅動IFN-β基因的轉錄。之后，IFN-β與I型IFN受體（IFNAR）結合并刺激JAK/STAT信號轉導途徑，導致其他抗病毒基因（如干擾素刺激基因ISG）的表達，并最終表達IFN-α進而誘導抗病毒狀態^[57-58]。由于真核細胞已經進化出多種機制來區分自身和非自身核酸，JEV與許多其他病毒一樣，已經發展出不同的策略來逃避或延遲先天免疫識別。

NS5是JEV最大且最保守的NSP，其N端和C端結構域分別編碼甲基轉移酶（MTase）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）。由于JEV NS5拮抗IFN是新發現的一種功能，因此鑒定其結構域的功能具有重要意義，研究表明，刪除C端殘基763至905（包括部分RdRP結構域）并不會損害NS5對IFN的拮抗活性，而N端殘基1至83或1至166的敲除則阻斷了NS5抑制IFN誘導的JAK/STAT途徑的能力，表明NS5可能需要完整的N末端來介導其拮抗IFN的活性。同時，與JEV GIII菌株相比，GI NS5-372處的Val替換為Ala或NS5-386處的His替換為Tyr能增強GI菌株拮抗IFN-α和IFN-β介導的抗病毒反應并產生高病毒滴度，從而提高其在鳥類中的復制效率，這部分研究一定程度解釋了在鳥類中GI毒株比GIII毒株的復制效率更高的原因^[59]。另外，NS5能與核轉運蛋白KPNA2/3/4相互作用，競爭性阻斷KPNA3/4與IRF3和p65（NF-κB的亞基）的相互作用，從而抑制IRF3和NF-κB的核轉位^[60]，表明JEV NS5可通過靶向KPNA3和KPNA4抑制I型IFN的產生。HSP90是JAK活性和穩定性的調節劑，抑制HSP90的表達會使JAK1和JAK2降解，從而減弱STAT1/2對IFN-β和IFN-γ的反應。研究發現，在JEV感染期間，NS5與HSP90和HSP70相互作用，在增強病毒dsRNA和自身穩定性的同時，導致JAK1、JAK3和Tyk2降解，抑制STAT1/3/5/6酪氨酸磷酸化，進而抑制IFN的產生^[61-62]。JEV感染宿主后，要在相對較短的時間內合成大量的病毒蛋白，可能需要細胞伴侶來促進其自身蛋白的折疊過程，而HSP70作為細胞伴侶網絡的核心組成部分，經常被病毒用于蛋白質折疊。因此，抑制HSP70表達可能會降低JEV的穩定性，導致JEV蛋白酶體降解。

NS1′是一種較大的衍生蛋白，Li等^[63]研究發現NS1′可與宿主細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）相互作用，中斷CDC25C磷酸酶介導的CDK1去磷酸化，增強CDK1磷酸化，從而通過增加轉錄因子CREB和c-Rel與miR-22（MAVS表達的關鍵調節因子）啟動子區域的結合來抑制MAVS介導的IFN-β表達^[63-64]，但JEV prM不能通過上述途徑抑制IFN-I的產生。另外，在JEV感染期間，NS1與鳥苷酸結合蛋白（GBP）相互作用，在存在IFN-γ的情況下，GBP1抑制信號轉導子和STAT1的表達及磷酸化而發揮促病毒作用^[66]。NS4B是一種多功能疏水性蛋白，廣泛參與病毒復制、發病機制和宿主免疫逃逸，研究表明，TRIF（一種誘導IFN-β的包含TIR結構域的接頭）蛋白通過與TRAF3結合激活TBK1和IKKε激酶相互作用，從而促進IRF3磷酸化，但在NS4B存在的情況下，TLR3和TRIF誘導的IRF3磷酸化受到抑制，而TRAF3、TBK1和IKKε則正常表達^[67]，表明NS4B可通過靶向TLR3和TRIF抑制IRF3磷酸化和IFN-β的產生，這為深入了解JEV逃避宿主免疫機制、針對干預JEV非結構蛋白和疫苗開發提供了新思路。

3 JEV逃逸適應性免疫應答

DC是抗原呈遞細胞（APC），在啟動適應性免疫反應以及調節先天免疫方面發揮著關鍵作用，具有多種免疫功能。DC與CD4⁺T淋巴細胞之間的的串擾對于建立有效的免疫反應至關重要。研究表明，JEV在感染后誘導DC成熟標記物和程序性細胞死亡1配體1（PD-L1，也稱為CD274）及調節性T細胞（Treg）的表達增加，使用拮抗劑阻斷PD-L1后，Treg細胞擴增顯著降低并減少了Th細胞向Th1細胞表型的極化，表明JEV可以誘導DC的表型和功能成熟并通過PD-L1軸調節DC和T淋巴細胞之間的串擾來逃避宿主的免疫反應^[68]。交叉呈遞是外源抗原被主要組織相容性復合體（MHC）I類分子呈遞并導致抗病毒CD8⁺T細胞反應激活的途徑，然而在JEV感染小鼠模型中發現，JEV感染后可以抑制可溶性抗原和細胞相關抗原的體內交叉呈遞，從而產生對外源抗原的弱CD8⁺T細胞反應，如降低體內細胞毒性T淋巴細胞（CTL）殺傷活性。此外，CD8α⁺CD11c⁺DC已知在交叉呈遞可溶性抗原方面效率更高，能干擾JEV介導的外源抗原交叉呈遞抑制，而JEV則可通過TLR2/MyD88信號通路依賴性方式損害CD8α⁺CD11c⁺DC的交叉呈遞而逃逸宿主適應性免疫^[69-70]。此外，記憶T細胞反應在預防人類JE方面發揮著至關重要的作用。無癥狀個體對JEV的IFN-γ應答大多為CD8⁺，而JE康復者的IFN-γ應答大多為CD4⁺，表明CD4⁺和CD8⁺T細胞應答與JEV的不同臨床結果相關^[71]。在病毒感染期間，CD4⁺效應T細胞被認為在病毒感染期間對于激活B細胞并最終產生體液反應至關重要。JEV感染期間，運用IgM抗體反應在患者的血清和腦脊液中檢測到IgM，并且IgM水平在感染后7d內達到最高水平。然而，最近的一項研究報告稱，感染JEV的小鼠其骨髓源性抑制細胞（MDSC）數量會增加，從而抑制CD4⁺T細胞免疫反應，并降低CD19⁺、CD138⁺、總IgM和JEV特異性中和抗體水平，表明JEV可通過誘導MDSC途徑抑制CD4⁺T細胞反應，破壞宿主體液免疫，從而逃逸適應性免疫應答促進感染^[72]。

4 小結與展望

JEV侵入宿主細胞后迅速脫去衣殼并將含有遺傳物質的病毒核心釋放至胞質，這一過程中，PAMPs激活各類PRRs引起IFN反應、調節細胞凋亡、焦亡、自噬和miRNA等天然免疫信號通路激活，分泌細胞因子形成免疫應答，然而JEV可通過眾多編碼蛋白調控宿主細胞的天然免疫信號通路，抑制抗病毒反應以促進自身的復制（表1）。此外，JEV還通過抑制抗原加工和遞呈、調控趨化因子表達等方式對宿主免疫系統造成損傷，進一步影響宿主的淋巴細胞分化成熟，導致了宿主難以誘導有效的適應性免疫應答。

由于目前尚無治療JE的有效辦法，接種疫苗仍是控制JE的主要方式，而理想的疫苗應該是在施用后迅速激活B細胞，從而產生足夠水平的保護或中和抗體，如T細胞的激活，當前JE-CV、IXIARO、SA14-14-2減毒活疫苗、Vero細胞源性滅活疫苗和MB-JEV被認為對JE的防控有效，但這些疫苗存在一定副作用，接種后會在局部引起紅斑、腫脹和疼痛，導致輕度發燒、咳嗽和腹瀉等全身不良反應^[73]。同時，國際上JE的防控以接種GIII株疫苗為主，但已有研究顯示GIII株疫苗誘導產生的抗體對GI株的中和能力偏低，并不能完全保護人類以及動物免受GI株JEVG2株的感染，并且已報道在免疫GIII株疫苗的人體內分離到了GI株JEVG2株^[74]，JEV優勢病毒株的轉型增加了JE的防控難度并對新型JE疫苗提出了更高需求。因此，深入研究JEV編碼的蛋白及其功能在病毒免疫逃逸中的作用，全面了解細胞受體和宿主蛋白與病毒蛋白相互作用關系必將有助于闡釋JEV的致病機理，并對開發更加安全、有效的疫苗和JE防控提供指導作用。除此之外，敲除毒力JEV相關毒力基因或免疫逃逸等相關基因，構建相關基因缺失疫苗也是未來的熱點研究方向。

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（編輯 范子娟）