缺氧對雞成肌細胞肌纖維類型轉化作用的機制探究

摘 要：旨在利用氯化鈷（CoCl₂）模擬肌細胞缺氧，并結合轉錄組測序分析缺氧對肌纖維類型及相關基因的影響。本試驗以雞原代成肌細胞為研究對象，使用不同濃度氯化鈷（0、50、100、200和400μmol·L^-1）處理細胞，每組設3個重復孔。通過檢測缺氧標志基因表達和觀察細胞形態篩選氯化鈷濃度，確定最適宜濃度用于建模。隨后，將收集的細胞通過Illumina測序檢測缺氧組和對照組雞成肌細胞的轉錄表達譜，并分析差異基因和富集到的信號通路。結果表明，200μmol·L^-1氯化鈷最適合構建雞胚成肌細胞缺氧模型，通過轉錄組測序發現，在24和48h時，缺氧組和對照組分別篩選出1474個和2028個差異表達基因，其中有959個差異基因在兩個時間點共有。GO和KEGG分析發現，在缺氧環境下，雞成肌細胞的信號受體活性調節、質膜組成成分、神經活性配體受體作用、PI3K-AKT、肌肉收縮等信號通路關鍵因子發生明顯表達變化。測序和qRT-PCR結果一致顯示，缺氧處理后慢肌纖維特異性基因如MYH7B、CSRP2顯著上調，而快肌纖維特異性基因如MYH1F、MYH1D、TNNI2、SOX6顯著下調，表明缺氧能夠誘導雞成肌細胞快肌纖維向慢肌纖維轉換。本研究初步揭示了缺氧對雞成肌細胞肌纖維類型轉換的機制，并提供相關基因表達數據庫，為未來家禽肉質和哺乳動物缺氧研究提供了重要參考。

關鍵詞：缺氧；雞成肌細胞；肌纖維類型轉換

中圖分類號：S831

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2397-12

收稿日期：2024-01-02

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1200305）；現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-41）；江蘇現代農業產業技術體系建設項目（JATS[2023]360）；江蘇省自然科學基金（BK20211121）；江蘇省種業振興“揭榜掛帥”（JBGS[2021]107）；江西省重點研發項目：井岡山科技精準扶貧模式和生態循環農業關鍵技術的集成與示范（20171ACF60013）

作者簡介：謝兵紅（1997-），女，江西豐城人，碩士生，主要從事家禽肉品質調控機理研究，E-mail：binghong1@qq.com

*通信作者：吳紅翔，高級實驗師，主要從事無抗優質畜禽產品研究，E-mail：2014035038@qq.com；束婧婷，研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：shujingting@163.com

The Mechanism of Effect of Hypoxia on Myofiber Type Transformation

in Chicken Myoblasts

XIEBinghong^1，2，LIUYifan^2，3，XUEFuguang¹，SHANYanju²，TUYunjie²，

JIGaige²，JUXiaojun²，SHUJingting^2*，WUHongxiang^1*

（1.Nanchang Key Laboratory of Animal Health and Safety Production，College of

Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330000，China；

2.Key Laboratory for Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province，Jiangsu

Institute of Poultry Science，Yangzhou225125，China；3.Hesheng

Food Group Co.，Ltd，Taizhou225501，China）

Abstract：The cobalt chloride（CoCl₂）was utilized in this study to simulate hypoxia in muscle cells and employed transcriptomic sequencing to analyze the effects of hypoxia on muscle fiber type and genes expression that related to muscle fiber types.Primary chicken myoblasts were treated with different concentrations of CoCl₂（0，50，100，200and400μmol·L^-1），with3repeat wells in each group.The CoCl₂concentration was screened by detecting the expression of hypoxia marker genes and observing cell morphology to determine the most suitable concentration for modeling.Subsequently，the collected cell was used to detect the gene expression profile of chicken myoblast in hypoxia treatment and control treatment by Illumina technology and assess differential gene expression and enriched signaling pathways between treatments.The results indicated that200μmol·L^-1CoCl₂was the most suitable concentration for constructing the hypoxic model in chicken embryonic myogenic cells.Transcriptomic results showed atotal of1474and2028differentially expressed genes in the hypoxia treatment compared to the control group at24and48h，respectively.Interestingly，959genes showed differential expression in both time points.GO and KEGG analyses revealed significant alterations in key factors related to signaling pathways such as regulation of signaling receptor activity，integral component of plasma membrane，neuroactive ligand-receptor interaction，PI3K-AKT signaling pathway and muscle contraction in chicken muscle cells under hypoxic conditions.Consistent findings from sequencing and real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）demonstrated that slow muscle fiber-specific genes such as MYH7B and CSRP2were significantly upregulated after hypoxia treatment，while fast muscle fiber-specific genes including MYH1F，MYH1D，TNNI2，and SOX6were significantly downregulated，which indicated atransition of chicken muscle cells from fast to slow muscle fibers was induced by hypoxia.This study provides preliminary insights into the mechanisms underlying the hypoxia-induced transition of muscle fiber types in chicken myogenic cells and offers avaluable gene expression database for future research on poultry meat quality and hypoxia-related studies in mammals.

Key words：hypoxia; chicken myoblasts; muscle fiber type transformation

*Corresponding authors：WU Hongxiang，E-mail：2014035038@qq.com; SHU Jingting，E-mail：shujingting@163.com

氧氣作為維持生命活動的關鍵物質，當生物體受到環境或疾病因素的影響導致體內氧含量變化時，包括肌肉在內的各種組織器官會做出相應的調整以適應外界的變化^[1-2]。肌纖維作為肌肉的基本結構單位，根據其固有的細胞特性可分為慢肌（Ⅰ型）和快肌（Ⅱ型）兩種主要類型^[3]。慢肌纖維富含線粒體和毛細血管，具備強大的抗疲勞能力，更依賴氧化磷酸化來產生能量也被稱為氧化型；而快肌纖維則因其線粒體較少，快速收縮容易疲勞，又被稱作酵解型^[4-5]。骨骼肌纖維具有高度的可塑性，在遺傳、營養、環境等內外因素的作用下，骨骼肌纖維的類型可以發生相互轉換^[6]。研究表明，低氧暴露可以改變骨骼肌的代謝特征，誘導肌纖維類型轉換，然而具體的轉換方式在不同物種或對象的研究中存在差異^[7]。在畜牧業中，肌纖維類型已被證實是決定肌肉品質的關鍵因素，了解肌纖維類型轉換的分子機制對產業發展至關重要^[8-9]。然而，在家禽肉質研究領域中，缺乏有關缺氧影響的報道。

氯化鈷是一種廣泛應用于細胞低氧模擬的化學試劑，通過競爭性抑制鐵螯合酶而影響細胞呼吸鏈，從而實現缺氧效果^[10]。低氧誘導因子HIF-1是細胞低氧適應性的關鍵轉錄因子^[11-12]。HIF-1由一個對氧敏感的HIF-1α亞基和一個穩定表達的HIF-1β亞基組成，低氧條件下HIF-1α積累并遷移到細胞核，與HIF-1β形成異二聚體蛋白HIF-1，進而激活參與多種生物過程的靶基因，包括血管生成、氧氣運輸和能量代謝等生理過程^[13]。血管內皮生長因子（VEGF）是HIF-1的關鍵靶標之一，VEGF啟動子含有可結合轉錄因子HIF-1α的缺氧反應元件，并啟動VEGF基因的轉錄激活^[14]。VEGF基因表達對于骨骼肌血管生成至關重要，小鼠敲除VEGF基因導致骨骼肌毛細血管大大減少^[15]。因此，HIF1A和VEGFA的表達檢測已在評價缺氧模型效果時得到廣泛應用^[16-18]。

本研究利用氯化鈷模擬缺氧環境，通過觀察細胞形態和檢測不同濃度氯化鈷處理后成肌細胞中HIF1A和VEGFA mRNA表達水平，篩選出合適的缺氧模型。隨后，利用轉錄組測序分析缺氧對雞胚成肌細胞肌纖維類型轉化的具體影響，并初步鑒定參與肌纖維類型調控的關鍵因子和信號通路，為揭示家禽肌纖維類型轉化的分子機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞胚成肌細胞的分離所使用的雞種蛋采購自和盛食品集團有限公司，并在實驗室孵化器（溫度37.5 ℃，濕度60%）中孵化至11胚齡時進行細胞提取。DMEM培養基、EDTA胰酶、胎牛血清、馬血清采購自美國Gibco公司；TRIzol采購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒采購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNase-free ddH₂O、DEPC、氯仿、無水乙醇、異丙醇采購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞原代成肌細胞的分離培養和缺氧處理

按照本實驗室已建立的方法^[19]從孵化至11胚齡的雞胚中提取原代成肌細胞。使用DMEM+20%胎牛血清和1%青/鏈霉素作為生長培養基。將獲得的細胞播散至24孔板中，待細胞匯合至80%時，使用分化培養基（DMEM+2%馬血清和1%青/鏈霉素）促進細胞誘導分化。分化1d后，分別更換為含有0、50、100、200、400μmol·L^-1氯化鈷的分化培養基，繼續培養24和48h后，收集細胞用于后續分析。

1.2.2 實時熒光定量PCR

采用Trizol法提取各細胞樣品的總RNA，隨后按照HiScript III RT SuperMIX for qPCR（+gDNA wiper）cDNA合成試劑盒說明書進行cDNA合成。利用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix Q511試劑盒進行各目標基因表達的qRT-PCR定量分析，以GAPDH為內參。各基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，引物序列詳見表1。

1.2.3 轉錄組測序

選取200μmol·L^-1氯化鈷對誘導分化1d的雞胚成肌細胞進行處理，分別在處理后24h（H24組）和48h（H48組）以及相應的對照組（N24和N48組）中收集細胞樣品，每組設3個重復。使用Trizol法提取所有樣品的總RNA，使用NanoDrop2000Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）檢測RNA樣品的濃度和純度，通過安捷倫2100Bioanalyzer（Agilent Technologies）檢測RNA樣品的完整性。合格的樣品被送往北京天根生化科技有限公司，使用Illumina平臺進行PE150測序。

1.2.4 測序數據分析

對測序原始數據進行質控后，利用HISAT2（2.1.0）與參考基因組（GRCg7b）進行比對，只有成功比對到基因組的reads才能用于后續分析。通過HTSeq（v0.60）對基因表達量進行統計，然后利用DEseq2（1.30.0）進行差異表達分析，選取以FDRlt;0.05且|log₂（FC）|gt;1為差異篩選標準。使用topGO和clusterProfiler軟件進行差異基因的GO和KEGG信號通路富集分析。

1.2.5 統計分析

在實時熒光定量PCR中，目的基因的相對表達量通過2^-ΔΔct方法進行統計分析。組間差異采用獨立樣本t檢驗進行分析，并使用GraphPad Prism8.0制圖。在圖中，*表示顯著差異（Plt;0.05），**表示極顯著差異（Plt;0.01）。

2 結 果

2.1 不同氯化鈷濃度構建雞胚成肌細胞缺氧模型對比

本研究選擇了0、50、100、200、400μmol·L^-1五種濃度用于篩選適合構建雞胚成肌細胞缺氧模型的氯化鈷濃度。處理24和48h后，發現缺氧標志基因HIF1A和VEGFA在200和400μmol·L^-1組升高（圖1）。綜合細胞形態觀察結果，400μmol·L^-1氯化鈷處理下細胞凋亡率顯著升高，因此本研究選擇200μmol·L^-1氯化鈷處理組進行后續試驗（圖2）。

2.2 差異表達基因分析

通過DESeq2軟件對氯化鈷處理組和對照組細胞進行差異表達分析，以|log₂（FC）|gt;1和padjlt;0.05為篩選標準。結果顯示，在24h組中共篩選出1474個差異表達基因，其中有667個上調基因和807個下調基因。而在48h組，共獲得2028個差異表達基因，其中有766個上調基因和1262個下調基因。進一步比對兩組差異分析結果，發現有959個基因在缺氧處理24和48h時都發生了差異表達。對這些差異表達基因進行聚類分析發現，來源于同一組的樣品各自聚為一類，表明本試驗的分組合理（圖3）。

2.3 差異基因功能富集分析

對差異表達基因進行GO功能富集分析，結果分為細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物學過程（biological process）3個大類。我們選取每個大類中富集最顯著的前10個功能類別進行分析，結果顯示，24和48h樣品中的差異基因均顯著富集在對藥物的反應、肌肉收縮、信號受體活性的調節、骨骼肌收縮、血管生成的正向調節、肌絲滑動等過程。在對差異顯著的基因進行KEGG通路富集分析時，發現顯著富集在肌動蛋白細胞骨架調控、Rap1信號通路、cGMP-PKG信號通路、戊糖磷酸途徑、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等途徑（圖4）。

2.4 qRT-PCR驗證差異表達基因

我們本研究選取了14個差異表達基因進行qRT-PCR驗證，結果發現在缺氧條件下，其中MYH7B、VEGFC、CSRP2、MYOG表達上調，CSRP3在缺氧24h下調，48h上調，而其他基因（MYH1E、SOX6、PGM1、TNNI2、PPARGC1A、PRKAG3、MYBPC2、MYH1D、MYH1F）在缺氧條件下表達下調。qRT-PCR定量結果與轉錄組結果基本一致，說明轉錄組結果是可靠的（圖5）。

2.5 qRT-PCR驗證缺氧誘導肌纖維類型轉換

為了進一步驗證缺氧對肌纖維類型轉換的調控作用，我們選擇了0、50、100、200、400μmol·L^-1氯化鈷處理后的成肌細胞進行表達監測。結果顯示，隨著氯化鈷濃度的升高，處理后24h和48h的MYH7B和MYH1F分別呈現逐漸升高和降低的趨勢，說明缺氧能夠促進成肌細胞的慢肌纖維增加，快肌纖維減少（圖6）。

3 討 論

盡管缺氧已被證實是骨骼肌肌纖維類型轉變的關鍵因素，但對于缺氧誘導肌纖維類型轉換的具體作用機制仍存在爭議。早在1988年，Itoh等^[20]的研究發現，在海拔4000m的高度缺氧環境下飼養7周的大鼠、比目魚肌中慢肌纖維比例更低，而快肌纖維比例更高。隨后的研究一致表明，動物在慢性缺氧環境中，肌纖維呈現向快肌轉變的趨勢^[21-24]。然而，一些體外研究觀察到低氧環境促進肌纖維從快肌向慢肌的轉變。例如，Slot等^[25]在研究缺氧小鼠骨骼肌細胞時發現細胞氧化能力降低，肌球蛋白重鏈I型的表達水平升高。Li等^[26]也觀察到CoCl₂處理后C2C12細胞中I型肌纖維比例的增加。有學者認為，動物暴露于缺氧環境時，肌纖維類型的轉變可能是由于缺氧導致身體活動減少、食物攝入量降低以及機體激素水平改變，而不僅僅是因為缺氧本身^[27]。本研究通過構建雞胚成肌細胞缺氧模型發現，在缺氧環境下成肌細胞表現出與慢肌纖維更相似的基因表達模式。具體而言，缺氧環境下MYH7B基因表達顯著升高，而MYH1F基因表達顯著下降。這種基因表達模式隨著缺氧程度的加深而變得更加顯著，表明缺氧環境能夠促使雞骨骼肌向慢肌纖維的轉變。這一轉變可能是由于缺氧啟動了與能量代謝相關的調控元件所致。

目前已經確定了一些調控因子可以觸發細胞內的信號級聯，參與肌纖維類型轉換的調控^[28]。細胞內游離的Ca²⁺是豐富和有效的調控因子，它可以調節和激活細胞質中的鈣蛋白酶水解系統和鈣調神經磷酸酶^[29]。激活的鈣調神經磷酸酶導致活化T細胞核因子（NFAT）蛋白的去磷酸化和核移位，啟動

編碼慢肌纖維蛋白質基因的轉錄^[30]，且研究表明鈣蛋白酶相關的基因也參與肌纖維類型的轉化^[31]。JunchulShin等^[32]通過敲除小鼠中脯氨酸羥化酶結構域2（PHD2）穩定HIF-1α蛋白導致肌纖維類型向慢肌轉變，此過程鈣調神經磷酸酶蛋白水平升高且NFATc1蛋白發生核移位，表明穩定的HIF1α蛋白可導致肌纖維通過鈣調神經磷酸酶/NFATc1信號通路轉變肌纖維類型。本研究中，鈣調磷酸酶相關基因在轉錄水平無顯著差異，后續需要在蛋白水平進行更深入的研究以驗證此通路。線粒體的氧化磷酸化途徑是細胞中主要的能量供應來源。當環境缺氧時，線粒體功能發生顯著變化，機體轉而通過糖酵解途徑提供能量^[33-34]。PGC-1α作為其中一個關鍵的轉錄共激活因子，在多個信號通路中都顯示出調節線粒體功能和氧化代謝的作用。研究也表明，PGC-1α具有促進酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉化的能力^[35-37]。本研究通過轉錄組分析發現，缺氧環境下成肌細胞中PGC-1α的表達顯著降低。這與Slot等^[25]在研究缺氧小鼠骨骼肌細胞時發現的結果一致，即缺氧下調PGC-1α的表達，但MyHCI型水平升高。SOX6是一種重要的轉錄因子，對胚胎肌肉發育和肌纖維維持具有重要影響。通常被認為是一種快肌纖維特異性表達基因。前期研究表明，在雞胚成肌細胞中敲低SOX6基因導致慢收縮肌纖維的形成和快收縮肌纖維的減少^[38]。本研究中，在缺氧環境下，雞成肌細胞中SOX6的表達下降，慢肌纖維上升，與前期研究結果一致。PRKAG3是AMPK的γ調節亞基，研究發現PRKAG3突變的豬在不同的肌肉中慢肌纖維不同程度地增加^[39]。在雞上也有研究表明PRKAG3基因與快肌纖維比例呈正相關^[40]。本研究在缺氧條件下發現PRKAG3mRNA顯著降低，進一步提示缺氧條件下成肌細胞呈現慢肌類似的基因表達模式。

綜上所述，NFATc1、PGC-1α、SOX6、PRKAG3等可能是缺氧誘導肌纖維類型轉換的關鍵靶標。然而，具體的作用機制還需要通過更深入的試驗證實。對于缺氧環境如何調控這些因子，以及它們之間的相互關系，是未來深入研究的方向。這些研究結果對于深入理解缺氧對肌纖維類型轉換的調控機制以及對缺氧相關疾病如慢性阻塞性肺疾病（COPD）的發病機理具有重要的指導意義。

4 結 論

本研究利用氯化鈷成功構建了雞成肌細胞缺氧模型，通過轉錄組測序和qPCR等試驗初步證實缺氧誘導雞成肌細胞快肌纖維向慢肌纖維轉換，并鑒定了一系列潛在的下游靶標和涉及的信號通路，初步揭示了缺氧對雞成肌細胞肌纖維類型轉換的機制，為深入開展家禽肉質調控機制和缺氧適應性研究提供了關鍵的基礎數據。

參考文獻（References）：

[1]PURI S，PANZA G，MATEIKA JH.A comprehensive review of respiratory，autonomic and cardiovascular responses to intermittent hypoxia in humans[J].Exp Neurol，2021，341：113709.

[2]MALLET RT，BURTSCHER J，PIALOUX V，et al.Molecular mechanisms of high-altitude acclimatization[J].Int JMol Sci，2023，24（2）：1698.

[3]LATCHMAN HK，WETTE SG，ELLUL DJ，et al.Fiber type identification of human skeletal muscle[J].J Vis Exp，2023（199）：e65750.

[4]LUNA VM，DAIKOKU E，ONO F.\"Slow\"skeletal muscles across vertebrate species[J].Cell Biosci，2015，5：62.

[5]VASILEIADOU O，NASTOS GG，CHATZINIKOLAOU PN，et al.Redox profile of skeletal muscles：implications for research design and interpretation[J].Antioxidants（Basel），2023，12（9）：1738.

[6]PETTE D，STARON RS.Myosin isoforms，muscle fiber types，and transitions[J].Microsc Res Tech，2000，50（6）：500-509.

[7]CHAILLOU T.Skeletal muscle fiber type in hypoxia：adaptation to high-altitude exposure and under conditions of pathological hypoxia[J].Front Physiol，2018，9：1450.

[8]MO MJ，ZHANG ZH，WANG XT，et al.Molecular mechanisms underlying the impact of muscle fiber types on meat quality in livestock and poultry[J].Front Vet Sci，2023，10：1284551.

[9]侯任達，張 潤，侯欣華，等.畜禽肌纖維發育規律及相關基因研究進展[J].畜牧獸醫學報，2022，53（10）：3279-3286.

HOU RD，ZHANG R，HOU XH，et al.Research progress on the pattern of muscle fiber development and related genes in livestock and poultry[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2022，53（10）：3279-3286.（in Chinese）

[10]CHEN R，JIANG T，SHE YL，et al.Effects of cobalt chloride，a hypoxia-mimetic agent，on autophagy and atrophy in skeletal C2C12myotubes[J].Biomed Res Int，2017，2017：7097580.

[11]TAYLOR CT，MCELWAIN JC.Ancient atmospheres and the evolution of oxygen sensing via the hypoxia-inducible factor in metazoans[J].Physiology（Bethesda），2010，25（5）：272-279.

[12]FAVIER FB，BRITTO FA，FREYSSENET DG，et al.HIF-1-driven skeletal muscle adaptations to chronic hypoxia：molecular insights into muscle physiology[J].Cell Mol Life Sci，2015，72（24）：4681-4696.

[13]KE QD，COSTA M.Hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）[J].Mol Pharmacol，2006，70（5）：1469-1480.

[14]LIU LX，LU H，LUO YX，et al.Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia-inducible factor1[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，291（4）：908-914.

[15]TANG KC，BREEN EC，GERBER HP，et al.Capillary regression in vascular endothelial growth factor-deficient skeletal muscle[J].Physiol Genomics，2004，18（1）：63-69.

[16]FU JD，YAO JJ，WANG H，et al.Effects of EGCG on proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC7901cells via down-regulation of HIF-1α and VEGF under ahypoxic state[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2019，23（1）：155-161.

[17]RANA NK，SINGH P，KOCH B.CoCl₂simulated hypoxia induce cell proliferation and alter the expression pattern of hypoxia associated genes involved in angiogenesis and apoptosis[J].Biol Res，2019，52（1）：12.

[18]CANHASI L，TINA E，EREMO AG.Hypoxia-mimetic by CoCl₂increases SLC7A5expression in breast cancer cells in vitro[J].BMC Res Notes，2023，16（1）：366.

[19]龐立川，單艷菊，劉一帆，等.METTL16在雞不同類型肌肉中的表達規律及其對肌肉功能的調控作用[J].畜牧獸醫學報，2023，54（2）：545-553.

PANG LC，SHAN YJ，LIU YF，et al.Expression of METTL16in different types of chicken muscle and its regulatory role in chicken skeletal muscle function[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（2）：545-553.（in Chinese）

[20]ITOH K，ITOH M，TAGUCHI S，et al.Effects of hypobaric-hypoxia on the total number and histochemical properties of the soleus muscle fibers and motoneurons in the rat[J].Nihon Seirigaku Zasshi，1988，50（4）：163-168.

[21]ITOH K，ITOH M，ISHIHARA A，et al.Influence of12weeks of hypobaric hypoxia on fibre type composition of the rat soleus muscle[J].Acta Physiol Scand，1995，154（3）：417-418.

[22]FAUCHER M，GUILLOT C，MARQUESTE T，et al.Matched adaptations of electrophysiological，physiological，and histological properties of skeletal muscles in response to chronic hypoxia[J].Pflugers Arch，2005，450（1）：45-52.

[23]RIZO-ROCA D，BONET JB，íNAL B，et al.Contractile activity is necessary to trigger intermittent hypobaric hypoxia-induced fiber size and vascular adaptations in skeletal muscle[J].Front Physiol，2018，9：481.

[24]KUSHWAHA AD，VARSHNEY R，SARASWAT D.Effect of hypobaric hypoxia on the fiber type transition of skeletal muscle：a synergistic therapy of exercise preconditioning with ananocurcumin formulation[J].J Physiol Biochem，2023，79（3）：635-652.

[25]SLOT IG M，SCHOLS AM WJ，VOSSE BA H，et al.Hypoxia differentially regulates muscle oxidative fiber type and metabolism in aHIF-1α-dependent manner[J].Cell Signal，2014，26（9）：1837-1845.

[26]LI XL，JUAN W，YUN B，et al.Effect of hypoxia on the muscle fiber switching signal pathways CnA/NFATc1and myostatin in mouse myocytes[J].Acta Histochem，2019，121（5）：539-545.

[27]CHAILLOU T，KOULMANN N，MEUNIER A，et al.Effect of hypoxia exposure on the recovery of skeletal muscle phenotype during regeneration[J].Mol Cell Biochem，2014，390（1/2）：31-40.

[28]GUNDERSEN K.Excitation-transcription coupling in skeletal muscle：the molecular pathways of exercise[J].Biol Rev Camb Philos Soc，2011，86（3）：564-600.

[29]GEHLERT S，BLOCH W，SUHR F.Ca²⁺-dependent regulations and signaling in skeletal muscle：from electro-mechanical coupling to adaptation[J].Int JMol Sci，2015，16（1）：1066-1095.

[30]LUO P，WANG LN，LUO L，et al.Ca²⁺-Calcineurin-NFAT pathway mediates the effect of thymol on oxidative metabolism and fiber-type switch in skeletal muscle[J].Food Funct，2019，10（8）：5166-5173.

[31]MOYEN C，GOUDENEGE S，POUSSARD S，et al.Involvement of micro-calpain（CAPN1）in muscle cell differentiation[J].Int JBiochem Cell Biol，2004，36（4）：728-743.

[32]SHIN J，NUNOMIYA A，KITAJIMA Y，et al.Prolyl hydroxylase domain2deficiency promotes skeletal muscle fiber-type transition via acalcineurin/NFATc1-dependent pathway[J].Skelet Muscle，2016，6：5.

[33]CHEN X，FENG WR，YAN FY，et al.Alteration of antioxidant status，glucose metabolism，and hypoxia signal pathway in Eirocheir sinensis after acute hypoxic stress and reoxygenation[J].Comp Biochem Physiol CToxicol Pharmacol，2023，268：109604.

[34]NAVA RC，MCKENNA Z，FENNEL Z，et al.Repeated sprint exercise in hypoxia stimulates HIF-1-dependent gene expression in skeletal muscle[J].Eur JAppl Physiol，2022，122（4）：1097-1107.

[35]LIN JD，WU H，TARR PT，et al.Transcriptional co-activator PGC-1α drives the formation of slow-twitch muscle fibres[J].Nature，2002，418（6899）：797-801.

[36]ZHANG JY，LI JQ，LIU YG，et al.Effect of resveratrol on skeletal slow-twitch muscle fiber expression via AMPK/PGC-1α signaling pathway in bovine myotubes[J].Meat Sci，2023，204：109287.

[37]TAKAKURA Y，SUZUKI T，HIRAI N，et al.VGLL3confers slow-twitch muscle differentiation via PGC-1α expression in C2C12myocytes[J].Biochem Biophys Res Commun，2023，669：30-37.

[38]LIU YF，ZHANG M，SHAN YJ，et al.Transcriptome sequencing analysis of the role of miR-499-5p and SOX6in chicken skeletal myofiber specification[J].Front Genet，2022，13：1008649.

[39]GRANLUND A，JENSEN-WAERN M，ESSéN-GUSTAVSSON B.The influence of the PRKAG3mutation on glycogen，enzyme activities and fibre types in different skeletal muscles of exercise trained pigs[J].Acta Vet Scand，2011，53（1）：20.

[40]章 明，單艷菊，姬改革，等.PRKAG3基因在雞不同部位肌肉中的表達及其與肌纖維類型的相關性[J].江蘇農業科學，2021，49（16）：144-147.

ZHANG M，SHAN YJ，JI GG，et al.Expression of RKAG3gene in different parts of muscle and its association with myofiber type in chicken[J].Jiangsu Agricultural Sciences，2021，49（16）：144-147.（in Chinese）

（編輯 郭云雁）