基于轉錄組測序分析SOX18在湖羊毛囊毛乳頭細胞中的功能

摘 要：旨在初步探究SOX18基因在湖羊毛囊毛乳頭細胞中的功能。本研究首先采用免疫熒光染色試驗對從湖羊毛囊中分離的細胞進行鑒定，然后構建SOX18基因過表達載體并通過qRT-PCR和Western blot檢測其過表達效率。將經過鑒定且生長狀態良好的毛乳頭細胞分為兩組，分別轉染SOX18過表達載體和空載質粒，每組3個重復。采用Trizol法提取6個樣本的總RNA并構建cDNA文庫，利用Illumina Novaseq6000平臺進行測序，然后對樣本相關性和差異表達基因進行分析，并對差異表達基因進行GO功能分類和KEGG通路注釋，尋找SOX18基因調控的相關候選基因和通路。為確認轉錄組數據的準確性，隨機選取9個差異表達基因進行qRT-PCR驗證。免疫熒光結果顯示，毛乳頭相關基因在所分離的細胞中高表達，表明所分離的毛乳頭細胞純度高。qRT-PCR和Western blot檢測發現，SOX18基因過表達能夠增加毛乳頭細胞中SOX18的mRNA和蛋白水平，表明構建的SOX18基因過表達載體可用于后續試驗。轉錄組分析結果表明樣本間相關性好，SOX18過表達組和對照組相比共發現157個基因差異表達，其中103個基因在SOX18過表達后上調，54個基因下調，qRT-PCR分析表明轉錄組數據準確性高。GO功能分析顯示，一些差異基因富集于細胞進展和毛囊發育過程。KEGG富集分析表明，一些差異表達基因富集于細胞增殖和毛囊發育相關信號通路。GO功能分析和KEGG富集分析表明SOX18在毛乳頭細胞的增殖和毛囊發育過程中起作用。本研究通過轉錄組測序分析發現SOX18可能通過影響細胞增殖和毛囊發育相關的基因和信號通路來影響毛乳頭細胞增殖和毛囊生長發育，研究結果為解析SOX18基因在湖羊毛乳頭細胞和毛囊中的分子調控機制提供了理論基礎。

關鍵詞：轉錄組測序；SOX18；毛囊；毛乳頭細胞；湖羊

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2409-12

收稿日期：2023-09-25

基金項目：江蘇省自然科學基金（BK20210810）；國家自然科學基金（32172689）；江蘇省農業重大新品種創制項目（PZCZ201739）；江蘇省“333工程”計劃項目（（2022）2-323）；江蘇省高等學校自然科學研究項目（20KJB230003; 22KJA230001）；江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（23）1036）；揚州大學“高端人才計劃-領軍人才”培養項目；教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室開放課題（JILAR-KF202103）；江蘇省研究生科研與實踐創新計劃（KYCX23_3593）

作者簡介：何明亮（1995-），男，河南信陽人，博士，主要從事動物遺傳與育種研究，E-mail：13013706620@163.com

*通信作者：孫 偉，主要從事羊品種資源與分子標記育種研究，E-mail：dkxmsunwei@163.com；王善禾，主要從事羊品種資源與分子標記育種研究，E-mail：shanhe12315@163.com

Function Analysis of SOX18in Hu Sheep Hair Follicle Dermal Papilla

Cells Based on Transcriptome Sequencing

HEMingliang¹，LüXiaoyang^2，3，JIANGYongqing⁴，SONGZhenghai⁵，WANGYeqing⁶，

YANGHuiguo⁷，WANGShanhe^{1，2，3*}，SUNWei^{1，2，3*}

（1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou225009，China;

2.Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of

Education of China，Yangzhou225009，China; 3.International Joint Research Laboratory in

Universities of Jiangsu Province of China for Domestic Animal Germplasm Resources and Genetic

Improvement，Yangzhou225009，China; 4.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou

310021，China; 5.Suzhou Wuzhong District Dongshan Animal Epidemic Prevention Station，

Suzhou215107，China; 6.Suzhou Taihu Dongshan Hu Sheep Industry Development Co.，Ltd，

Suzhou215107，China; 7.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi830011，China）

Abstract：The purpose of this study was to preliminary investigate the function of the SOX18gene in Hu sheep hair follicle dermal papilla cells.In this study，immunofluorescence staining was used to identify cells isolated from the hair follicles of Hu sheep.Subsequently，an overexpression vector of the SOX18gene was conducted，and its overexpression efficacy was assessed using qRT-PCR and Western blot.The dermal papilla cells successfully identified and well-grown were divided into two groups.One group was transfected with SOX18overexpression vector，while the other was transfected with empty plasmid.Each group had3replicates.The total RNA was extracted from6samples using the Trizol method，followed by the construction of acDNA library.The Illumina Novaseq6000platform was used for sequencing.Subsequently，sample correlation and differentially expressed genes were analyzed.The differentially expressed genes were categorized based on GO and annotated using the KEGG pathway analysis to identify candidate genes and pathways associated with the regulation of the SOX18gene.To confirm the accuracy of the transcriptome data，9differentially expressed genes were randomly chosen for qRT-PCR analysis.The immunofluorescence results revealed dermal papilla-related genes had high expression in isolated cells，indicating ahigh purity of the isolated dermal papilla cells.qRT-PCR and Western blot results showed that overexpression of the SOX18gene could increase the mRNA and protein levels of SOX18in dermal papilla cells，indicating that the SOX18overexpression vector could be used for subsequent experiments.Transcriptome analysis results showed agood correlation between samples.A total of157genes were differentially expressed between the SOX18overexpression group and the control group，of which103genes were up-regulated after SOX18overexpression and54genes were down-regulated.qRT-PCR analysis showed high accuracy of transcriptome data.GO functional analysis showed that some differential genes were enriched in cell progression and hair follicle development.KEGG enrichment analysis showed that some differentially expressed genes were enriched in signaling pathways related to cell proliferation and hair follicle development.GO functional analysis and KEGG enrichment analysis indicated that SOX18played arole in the proliferation of dermal papilla cells and the development of hair follicles.In this study，transcriptome sequencing analysis found that SOX18may affect the proliferation of dermal papilla cells and the development of hair follicles by affecting genes and signaling pathways related to cell proliferation and hair follicle development.The study results provide atheoretical basis for understanding the molecular regulatory mechanism of the SOX18gene in Hu sheep dermal papilla cells and hair follicles.

Key words：transcriptome sequencing; SOX18; hair follicles; dermal papilla cells; Hu sheep

*Corresponding authors：SUN Wei，E-mail：dkxmsunwei@163.com; WANG Shanhe，E-mail：shanhe12315@163.com

羊毛作為羊毛紡織品的重要原材料，其生產對世界紡織業有著重大影響。因此，關注羊毛生產對于羊毛產業的穩步發展是不可或缺的。眾所周知，羊毛是從毛囊中生長出來的，毛囊的生長不可避免地會影響羊毛的生產。毛囊（hair follicles，HFs）是由毛囊上皮細胞和毛囊間充質細胞組成的結構，毛囊上皮包括毛干、內根鞘、伴生層、外根鞘和毛囊基質，毛囊基質又包括真皮乳頭和結締組織鞘，這些細胞通過相互調節參與毛囊生長、分化和周期性生長的調節過程^[1]。毛乳頭位于毛球的中心區域，它可以激活毛基質細胞來維持和啟動毛囊生長周期^[2]。毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs）被認為能夠通過外泌體在HFs的生長過程中發揮關鍵調控作用^[3]。Kwack等^[4]發現，人DPCs中提取的外泌體可以促進DPCs和外根鞘細胞的增殖，還能夠誘導小鼠毛發從休止期進入生長期并促進小鼠毛干伸長，這表明DPCs可以通過其外泌體調節毛囊中其他細胞的活性來促進毛發生長。此外，毛乳頭的存在也有助于完整毛囊的形成，并促進頭發生長^[5]。因此，開展對DPCs的研究有助于了解其對毛囊生長的調控作用。

轉錄因子SOX18是SOX家族的成員，該家族由一類與早期胚胎發育有關的核轉錄因子組成^[6]。研究表明，SOX18突變會導致人類少毛癥-淋巴水腫-毛細血管擴張癥（HLT）綜合征的發生^[7]。在小鼠中，SOX18突變能夠誘導小鼠RA表型的產生，其中雜合子小鼠表現出粗糙的毛發，而純合子小鼠則完全無毛^[8]。Pennisi等^[9]通過構建SOX18^-/-小鼠發現了RA小鼠毛發缺陷的原因是皮膚毛囊總數減少^[10]。目前，綿羊毛囊中關于SOX18的報道較少。在我們本課題組之前的研究中，通過對湖羊花紋表型羊毛毛囊和直毛表型羊毛毛囊進行單細胞測序，發現SOX18在DPCs中特異性表達，因此我們猜測SOX18可能在DPCs中發揮重要作用^[11]。

本研究旨在了解SOX18在湖羊毛DPCs中的作用，本研究的結果為解析綿羊羊毛生長的分子調控機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究中用于細胞分離的皮膚組織采集于蘇州湖羊種羊場養殖的3日齡湖羊母羊。

1.2 細胞分離和培養

湖羊DPCs的分離：首先使用眼科剪刀切割皮膚組織，然后將其分割為小塊皮膚組織并從中分離出處于生長期的單個毛囊。接下來，用鑷子獲取毛囊的膨大末端，然后使用鑷子破壞該組織完整性以使其內部細胞能夠遷移出來。最后，將經鑷子破壞后的膨大末端接種到12孔細胞培養皿中培養，直到DPCs生長。湖羊DPCs的培養：用DMEM-F12（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國）培養基培養湖羊DPCs，DMEM-F12培養基中添加10%胎牛血清（Gibco，長島，紐約州，美國）和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素（Solarbio，北京，中國）。所有湖羊DPCs在37 ℃、5%CO₂的細胞培養箱（Thermo，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）中培養。

1.3 RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR

用Trizol（TaKaRa，大連，中國）從DPCs中提取總RNA，并在-80 ℃下儲存。本研究使用分光光度計（Thermo，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）檢測RNA的質量和濃度。然后，使用一步逆轉錄試劑盒（Tiagen，北京，中國）進行基因的cDNA合成，使用2×TSINGKE^?Master-qPCR Mix（擎科，南京，中國）檢測組織和細胞中相關基因的表達水平，定量反應體系和程序均按照2×TSINGKE^?Master-qPCR Mix（擎科，南京，中國）試劑盒說明書。以綿羊GAPDH為參考基因，對每個樣本進行3次重復檢測。使用2^-ΔΔCT方法計算相對表達量^[12]。

1.4 qRT-PCR引物

本研究使用Premier Primer5.0軟件（Premier Biosoft International，帕羅奧圖，加利福尼亞州，美國）設計相關基因的引物。所有引物均由南京擎科生物公司合成。引物序列如表1所示。

1.5 SOX18過表達載體的構建

為了構建SOX18的過表達載體，首先使用PrimeSTAR^?Max DNA聚合酶（TaKaRa，大連，中國）擴增SOX18基因的編碼序列（CDS），并分離和純化PCR產物。然后，將擴增的片段克隆到pcDNA3.1+載體中。限制性酶切位點內切酶為HindⅢ和BamH I（TaKaRa，大連，中國）。最后，將構建完成的重組質粒進行測序以確保SOX18基因的CDS片段被成功插入。引物如表2所示。

1.6 細胞轉染

在本研究中，jetPRIME轉染試劑（polyplus，斯特拉斯堡，法國）用于細胞轉染，所有細胞轉染程序均按照制造商的方案進行。

1.7 免疫熒光染色

使用24孔細胞培養皿培養DPCs，細胞轉染的密度約為30%。在細胞達到適當密度后用1×PBS（Solarbio，北京，中國）洗滌細胞，然后用4%多聚甲醛（Solarbio，北京，中國）固定細胞，并用0.5%Triton X-100（Solarbio，北京，中國）對細胞進行通透。接下來，用5%BSA（Solarbio，北京，中國）在37 ℃條件下對細胞進行封閉。最后，將封閉細胞中加入一抗并在4 ℃條件下避光孵育過夜。第二天，用1×PBST（Solarbio，北京，中國）洗滌細胞，并使用二抗在37 ℃條件下孵育1 h，最后用DAPI（Beyotime，上海，中國）對細胞核進行染色。染色完成后使用倒置熒光顯微鏡（Nikon，東京，日本）觀察并拍攝染色的細胞。一抗及其稀釋比例如下：兔抗ACTA1抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗CRABP1抗體（Santa Cruz Biotech，圣克魯斯，玻利維亞，1∶400），兔抗CRABP2抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗IGFBP3抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗PDGFRA抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗VCAN抗體（Santa Cruz Biotech，圣克魯斯，玻利維亞，1∶400），兔抗SOX18抗體（Bioss，北京，中國，1∶400）。二抗及其稀釋比例為：山羊抗兔IgG Hamp;L（Alexa Fluor^?594）（Abcam，劍橋，英國，1∶400）。

1.8 Western blot檢測

使用6孔細胞培養皿培養DPCs以收集蛋白質樣品，細胞轉染的密度約為50%。轉染48h后，用胰蛋白酶消化和收集細胞（Solarbio，北京，中國）。收集完畢后，用RIPA細胞裂解物（Beyotime，上海，中國）和蛋白酶抑制劑（Beyotime，上海，中國）裂解細胞以收集蛋白并用BCA蛋白定量試劑盒（Vazyme，南京，中國）測定濃度。蛋白樣品變性后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得目的蛋白，并將其轉移到PVDF（BIO-RAD，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國）中。然后，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜并使用一抗將PVDF膜置于4 ℃條件下孵育過夜。第二天，用1×TBST（Solarbio，北京，中國）洗滌PVDF膜，然后用二抗在室溫條件下孵育PVDF膜。最后，使用1×TBST洗滌PVDF膜，并將化學發光試劑盒（ECL）（Beyotime，上海，中國）用于蛋白印跡顯色。

1.9 基因文庫構建和測序

使用Trizol試劑盒（Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）提取總RNA。RNA質量通過Agilent2100生物分析儀（Agilent Technologies，帕羅奧圖，加利福尼亞州，美國）檢測，并使用不含RNase的瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA文庫由NEB Next Ultra RNA文庫制備試劑盒（NEB#7530，New England Biolabs，伊普斯威奇，馬薩諸塞州，美國）生成。使用Gene Denovo Biote的Illumina Novaseq6000對所得cDNA文庫進行測序。

1.10 轉錄組數據分析

將測序獲得的原始數據進行質控以獲得高質量的Clean reads，然后將其與綿羊參考基因組比對，并對數據進行歸一化處理以獲得FPKM值，綿羊參考基因組為GCF_016 772 045.1。

1.11 樣本相關性分析

通過R軟件計算兩個樣本之間的相關系數以評估樣本之間的重復性，相關系數越接近1，兩個平行試驗之間的重復性越好。兩個平行試驗的相關性提供了對試驗結果可靠性和操作穩定性的評估。

1.12 差異表達基因篩選

通過DESeq2軟件分析SOX18過表達組（SOX18-OE）和對照組（SOX18-K）間的差異表達基因。錯誤發現率（FDR）＜0.05且差異倍數（Fold Change）≥2的基因/轉錄物被認為是差異表達基因/轉錄本。

1.13 GO和KEGG通路富集分析

注釋、可視化和綜合發現數據庫（DAVID）用于SOX18-OE與SOX18-K（157個基因）組間差異表達基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.14 統計分析

使用SPSS25.0軟件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利諾伊州，美國）進行統計分析。使用獨立樣本t檢驗進行數據分析。只有當P＜0.05（*）或P＜0.01（**）時，數據才被認為具有統計學意義。在本研究中，每個試驗處理進行3次重復測定，所有數據均以“平均值±SEM（平均值的標準誤差）”表示。

2 結 果

2.1 湖羊毛乳頭細胞相關基因的鑒定

在本研究中，首先選用免疫熒光染色對湖羊DPCs中相關基因進行檢測以鑒定所分離的細胞是否為DPCs，檢測結果顯示真皮乳頭細胞標記基因α-SMA（ACTA1）在所分離的細胞中表達（圖1）。根據前期單細胞測序結果，本研究也篩選了5個在湖羊DPCs中高表達基因CRABP1、CRABP2、IGFBP3、PDGFRA和VCAN進行檢測，結果顯示這些基因也都在所分離的細胞中表達（圖1）。這些結果表明所分離的細胞為DPCs，能夠用于下一步試驗。

2.2 毛乳頭細胞中SOX18基因的鑒定及過表達載體構建

前期單細胞測序發現SOX18在湖羊DPCs中特異性表達，本研究中免疫熒光染色也表明SOX18在湖羊DPCs中表達（圖2A）。因此，我們推測SOX18在湖羊DPCs中發揮作用。為了研究SOX18在湖羊DPCs中的功能，本研究構建了SOX18的過表達載體以用于后續試驗（圖2B）。首先，將帶有GFP標簽的pcDNA3.1載體轉染進湖羊DPCs，結果顯示該載體在湖羊DPCs中的轉染效率較高（圖2C）。然后，將構建成功的pcDNA3.1-SOX18轉染進湖羊DPCs中，qRT-PCR和Western blot結果顯示pcDNA3.1-SOX18能夠上調SOX18的mRNA表達水平和蛋白表達水平（圖2D，E）。這些結果表明，pcDNA3.1-SOX18載體可用于后續試驗。

2.3 轉錄組數據分析

為了進一步了解湖羊DPCs中SOX18基因的功能，本研究在湖羊DPCs中過表達SOX18后進行了轉錄組測序。測序數據經質量控制后，相關性分析結果顯示同一組中的重復樣本高度相似（圖3A）。為了直觀地獲取每個樣本中的基因豐度，使用小提琴圖來顯示數據分布和基因表達的分散程度（圖3B）。結果顯示，同一組中的中位數、四分位間距和基因表達分布相似，這表明同一組平行樣本的可重復性很高。樣本相關性和小提琴圖的結果均表明轉錄組數據質量高，可供進一步分析。

2.4 差異表達基因篩選

本研究一共在兩組（SOX18-OE與SOX18-K）間共鑒定出157個差異表達基因，其中103個上調基因，54個下調基因（圖4A），火山圖（圖4B）顯示了基因表達水平的差異。此外，所有差異表達基因的分級聚類結果顯示來自同一組的兩個樣本被聚類在同一聚類中，這進一步表明測序數據是準確可靠的（圖4C）。

2.5 GO功能注釋和KEGG pathway通路富集分析

為了進一步了解差異基因的功能及其可能參與的途徑，本研究對所有差異基因進行了GO和KEGG富集分析?；虮倔w論功能注釋結果顯示，157個差異表達基因中有137個被注釋，20個未被注釋。根據功能注釋的結果，137個差異表達基因分別富集于生物過程（BP）（圖5A）、細胞成分（CC）（圖5B）、分子功能（MF）（圖5C）。本研究主要關注生物過程（BP）所富集的基因，其中一些與細胞進展有關，如細胞增殖的調節（GO：0042127）、細胞過程的負調節（GO：0048523）和細胞增殖的正調節（GO：0008284）。此外，一些差異表達基因被注釋到毛囊發育相關生物過程中，如毛發周期（GO：0042633）、毛發周期過程（GO：0022405）和毛囊發育（GO：00001942）。KEGG pathway通路分析的結果如圖5D所示，差異表達基因主要富集在IL-17信號通路（ko04657）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（ko04060）和TNF信號通路（ko04668）中。

2.6 qRT-PCR驗證

為了驗證測序數據的準確性，本研究隨機選擇了9個轉錄組測序獲得的差異表達基因進行差異表達驗證，qRT-PCR結果顯示9個基因的表達趨勢與轉錄組測序結果一致（圖6），進一步表明了轉錄組數據的準確性。

3 討 論

DPCs是一種位于皮膚中的間充質細胞，被認為能夠通過分化為不同的細胞類型來調節毛囊的生長發育^[13]。在毛囊生長過程中，細胞板和成纖維細胞凝結物之間的信號傳導引起上皮細胞增殖和新毛囊向下生長，然后上皮細胞和成纖維細胞聚集在一起形成成熟的毛乳頭，毛乳頭再引導上皮細胞生長形成毛干和內根鞘^[14-15]。因此，DPCs在毛囊生長發育過程中發揮重要的作用。

之前的一項轉錄組測序表明SOX18可能與江南絨山羊毛囊發育有關^[16]。雷志惠等^[17]利用全基因組選擇信號研究發現SOX18與綿羊毛囊發育相關聯。本研究旨在通過轉錄組測序進一步了解SOX18在湖羊DPCs和毛囊中的功能?；谵D錄組測序的結果，本研究在SOX18-OE組與SOX18-K組中篩選獲得157個差異表達基因（103個上調，54個下調），通過對這些差異基因的分析，初步了解了SOX18在湖羊DPCs增殖和毛囊發育中的潛在功能。

根據GO分析結果，一些與細胞進展相關的基因被發現可能作為SOX18的下游基因發揮重要作用，包括ANKRD1、SOX9、CXCL6等。ANKRD1是內皮細胞中一種細胞因子誘導的核蛋白，在細胞增殖過程中發揮作用^[18]。轉錄因子SOX9也被報道參與了細胞增殖和命運調節等過程^[19，20]。CXCL6是CXC趨化因子家族的一員，可介導炎癥、免疫反應、細胞生長和轉移^[21]。這些基因的功能表明，SOX18可能通過調節某些基因的表達水平來影響湖羊DPCs的生長。DPCs能夠通過儲存多能干細胞、營養物質和生長因子來調節毛囊的生長^[13]。因此，我們本研究還注意到一些基因與毛囊發育有關。3個差異表達基因，SOX18、SOX9和PTGS2被注釋為與毛發周期、毛發周期過程和毛囊發育有關，這一結果表明SOX18在毛囊生長過程中可能發揮著重要作用。

KEGG通路富集分析結果顯示，部分差異表達基因顯著富集于IL-17信號通路和TNF信號通路，這些信號通路已經被報道與細胞增殖有關^{[22，23]}。因此，我們推測SOX18可能通過IL-17信號通路和TNF信號通路影響湖羊DPCs的增殖。在毛囊生長過程中，許多信號通路發揮著不可或缺的作用，如Wnt/β-Catenin、BMP、TGF-β和MAPK信號通路。據報道，Wnt/β-Catenin信號通路廣泛參與毛囊形態發生和周期性生長^[24，25]。此外，一些WNT相關基因在毛發生長中的作用也已被研究，如Wnt2基因被報道在調控毛囊發育中發揮關鍵作用^[26]。在本研究中，WNT2基因被發現在不同處理組中差異表達，并被富集到Wnt/β-Catenin信號通路，這表明SOX18可能通過Wnt/β-Catenin信號通路影響湖羊DPCs增殖和毛囊生長。

4 結 論

在本研究中，SOX18被發現可能通過影響一些細胞增殖相關基因和信號通路來影響湖羊DPCs的增殖和毛囊生長發育。我們的本研究報道了SOX18在湖羊DPCs和毛囊中的潛在作用，拓寬了對SOX18基因在綿羊毛囊生長發育中作用的認知，為解析SOX18基因在湖羊DPCs和毛囊中的分子調控機制提供了理論基礎。

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（編輯 郭云雁）