干擾PPARγ基因對綿羊滋養層細胞增殖、凋亡、遷移和脂質積累的影響

摘 要：旨在通過干擾PPARγ基因的表達，探究PPARγ對綿羊滋養層細胞增殖活性、細胞凋亡、細胞遷移率以及脂質累積的影響，為深入研究PPARγ在綿羊滋養層細胞中的分子機制提供基礎依據。本研究設計并合成干擾PPARγ基因的siRNA干擾片段，通過Western Blot和RT-qPCR篩選干擾效率最高的siRNA，并轉染至分離培養的綿羊滋養層細胞中。通過BODIPY染色檢測干擾PPARγ基因后滋養層細胞中脂滴的聚積，比色法檢測細胞中甘油三酯的含量，并利用RT-qPCR檢測脂代謝相關基因的轉錄水平。采用CCK-8法、劃痕試驗和流式細胞法，分別探究干擾PPARγ基因對滋養層細胞增殖活性、細胞遷移率及細胞凋亡的影響。篩選得到了干擾效率最高的siPPARγ-1片段用于轉染滋養層細胞，在干擾滋養層細胞PPARγ基因表達后，細胞中脂滴聚積能力下降，甘油三酯含量降低（P＜0.01），脂代謝相關基因CD36、FABP4和PLIN2的轉錄水平也受到抑制（P＜0.01）。同時，滋養層細胞的增殖活力也顯著降低（P＜0.05），細胞遷移率減少（P＜0.01），而細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）。本研究表明PPARγ基因在調控滋養層細胞功能方面起重要作用，可對其具體分子機制進行深入研究，以期用于繁殖育種實踐中。

關鍵詞：綿羊；滋養層細胞；PPARγ；干擾

中圖分類號：S826.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2421-10

收稿日期：2023-12-12

基金項目：國家自然科學基金（32060751）; 兵團重點領域科技攻關計劃項目（2021AB014）; 石河子大學高層次人才科研啟動資金專項項目（RCZK201941）

作者簡介：劉 暢（1998-），女，遼寧昌圖人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖的研究，E-mail：liuchang980522@163.com

*通信作者：王 靜，主要從事動物繁殖生理學研究，E-mail：wjtry100@163.com; 胡廣東，主要從事動物繁殖生理學研究，E-mail：huguangdong1017@163.com

Effects of Interference with PPARγ Gene on Proliferation，Apoptosis，Migration

and Lipid Accumulation of Trophoblast Cells in Sheep

LIUChang，HAOKexing，CHENYan，ZENGWeibin，YUHengbin，

CHENLei，WANGJing^*，HUGuangdong^*

（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi832003，China）

Abstract：The aim of this study was to explore the effects of PPARγ on the cell viability，apoptosis，cell migration rate and lipid accumulation of sheep trophoblast cells by interfering with the expression of PPARγ gene，so as to provide abasis for further study of the molecular mechanism of PPARγ in trophoblast cells.To design and synthesize siRNA interference fragment of PPARγ gene，the siRNA with the highest interference efficiency was screened by Western blot and RT-qPCR.Then，the siRNA was transfected into the sheep trophoblast cells.After interfering with the PPARγ gene，the accumulation of lipid droplets in trophoblast cells was measured by BODIPY staining，the amount of triglycerides by colorimetric method，and the transcript levels of genes involved in lipid metabolism was detected using RT-qPCR（real-time quantitative PCR）.CCK-8assay，wound healing test and flow cytometry were used to detect the effects of PPARγ interference on cell viability，migration rate and apoptosis of trophoblast cells.siPPARγ-1fragment with the highest interference efficiency was screened and used to transfect trophoblast cells to interfere with the expression of PPARγ gene.Interference with PPARγ gene expression in trophoblast cells reduced the accumulation capacity of lipid droplets and cellular triglyceride content（Plt;0.01），and the transcription levels of related genes CD36，FABP4and PLIN2were also inhibited（Plt;0.01）.At the same time，interference with PPARγ gene expression significantly reduced cell viability（Plt;0.01）and migration rate（Plt;0.05），while the cell apoptosis rate was increased significantly（Plt;0.01）.This study showed that PPARγ gene plays an important role in regulating the function of trophoblast cells and its specific molecular mechanism can be studied in depth with aview to using it in reproductive breeding practices.

Key words：sheep; trophoblast cells; PPARγ; interference

*Corresponding authors：WANG Jing，E-mail：wjtry100@163.com; HU Guangdong，E-mail：huguangdong1017@163.com

胚胎附植是胚胎滋養層細胞與母體子宮內膜細胞間逐步建立細胞間通訊的過程，它是妊娠的關鍵步驟，也是胚胎早期發育的重要環節^[1]。自然狀態下，綿羊的胚胎在桑葚胚發育的第4天進入子宮，第6天發育到囊胚，此時胚胎發育成熟并且具備了附植的能力，之后胚泡從透明帶中孵出（第8天），延伸形成絲狀體（第11～16天），最終附著于子宮內膜上（第16天）^[2-3]。胚胎附植過程中伴隨著母體和胚胎間復雜的生理變化，其中胚體的正常延伸是保證胚胎附植成功的重要前提^[4]。胚胎附植子宮內膜失敗是體外移植胚胎失敗的主要原因^[5]。因此，研究胚胎附植過程中調控的分子機制對于動物繁育和畜牧業的發展至關重要。

過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）是細胞核受體超家族成員之一，在脂質代謝、抗炎和抗氧化的過程中起關鍵調控作用，并能夠促進脂肪細胞的分化^[6-8]。PPARγ作為一種配體激活轉錄因子，其配體包括天然配體和人工合成配體，調節包括胎盤在內的多種組織中的生物過程^[9]。PPARγ在妊娠圍植入期豬的子宮組織、狗的胎盤和母羊的胎盤子葉都有較高的表達^[10-11]。其轉錄水平隨著胚胎發育階段的變化而變化^[12-13]。在小鼠中，PPARγ的缺失導致胚胎植入缺陷進而引發胚胎死亡^[14]。在孕期，向小鼠灌服激活PPARγ活性的藥物，能夠有效降低LPS處理后胎兒死亡的概率^[15]。牛胚胎轉錄組測序結果發現，PPARγ的轉錄表達在孕體延長開始時顯著增加，并在整個孕體延長期間高水平表達^[16]。抑制PPARγ轉錄會導致綿羊孕體發育嚴重遲緩^[17]。同時，PPARγ能夠調節人滋養層細胞對脂肪酸的攝取，誘導細胞脂質的積累以及滋養層細胞分化^[18-19]。綜上可知，胚胎附植過程中，滋養層細胞內PPARγ的高表達對維持胚胎著床具有重要意義。

脂質代謝是維持哺乳動物胚體延長的重要物質代謝過程，而PPARγ作為一種調控脂質代謝的關鍵轉錄因子，參與滋養層細胞的分化調控^[20-21]。在附植過程中，胚體滋養層細胞內持續的高表達PPARγ基因，提示其可能是胚體延長的重要調節因子。已有的研究已初步驗證了這一點，但大都停留在轉錄組測序和生物信息學分析階段，且在綿羊滋養層細胞上的研究鮮有報道。本研究旨在通過siRNA干擾技術探究抑制PPARγ對綿羊滋養層細胞脂質積累、甘油三酯含量和細胞活性的影響。檢測脂質沉積相關基因表達情況，細胞凋亡、細胞增殖活性和細胞遷移率，為進一步研究PPARγ參與調控胚胎著床過程中滋養層細胞的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取了9只體重在45～55kg之間、18～22月齡的哈薩克斯母羊。在每只母羊的陰道中插入一個插頭于12d后取出，并進行孕馬血清促性腺激素肌肉注射。發情誘導后，用同一只哈薩克公羊給母羊授精，最后一次交配時間記為第0天。在第30天將母羊轉移到屠宰場，其中6只成功妊娠并形成胎盤組織，將采集到的胎盤組織置于滅菌預冷的PBS（含1%青霉素-鏈霉素）中4h內運回實驗室。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素購自Solarbio（中國）；TRIzol和RIPA裂解液購自Thermo（美國）；DMEM基礎培養基、0.25%胰酶購自Gibco（美國）；PBS和青霉素-鏈霉素購自Hyclone（美國）；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）購自Biological Industries（以色列）；反轉錄試劑盒PrimeScript^TM RT Reagent Kit和熒光染料TB Green^?Premix Ex Taq^TM購自TaKaRa（日本）；轉染試劑jetPRIME購自Polyplus（法國）；BODIPY493/503購自GlpBio（美國）；細胞劃痕插件Culture Insert2Well購自ibidi（德國）；甘油三酯（TG）含量檢測試劑盒購自上海生工（中國）；PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、β-actin Mouse Monoclonal Antibody購自碧云天（中國）；PPAR Gamma Polyclonal antibody購自Proteintech（美國）；Anti-mouse DyLight^TM680、Anti-rabbit DyLight^TM800購自Cell Signaling（美國）。

參照已公布的綿羊PPARγ序列（GenBank：KF727 439.1），由上海吉熒生物技術有限公司設計并合成4條siRNA序列siPPARγ-1：GUACCAAAGUGCAAUCAAAGU、siPPARγ-2：CCUGUAUCCCCACCUUAUUAU、siPPARγ-3：GGA-

AAGACGACAGACAAAUCA、siPPARγ-4：GUUCAACGCACUGGAAUUAGA。陰性對照由上海吉熒生物技術有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 綿羊滋養層細胞的分離培養及鑒定

取第30天左右綿羊子宮組織放入含有1%青霉素-鏈霉素的PBS中，立即轉移到實驗室，用70%乙醇清洗子宮對表面進行消毒處理，在無菌超凈臺內解剖。用PBS沖洗子宮角以得到孕體，取滋養外胚層至EP管中剪碎，用PBS清洗組織塊至液體清亮。將剪碎的組織放入15mL離心管中，加入6mL0.25%胰酶消化10min，1000r·min^-1離心10min，棄去上清。用PBS清洗3次以盡量去除組織塊中的胰酶。將組織塊接種到6孔板內，并在每孔加入1mL的DMEM完全培養基，然后放入細胞培養箱中培養。24h后，補加1mL新鮮的完全培養基培養。48～72h后，傳代細胞，通過胰酶消化法純化細胞，純化后的細胞經免疫組化試劑盒檢測細胞角蛋白7（CK-7）呈陽性表達^[22]。

1.3.2 siRNA轉染

凍存的滋養層細胞置于37 ℃水浴鍋復蘇，將其接種于細胞培養瓶中，用含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養基進行培養。復蘇培養后的細胞接種到12孔板中，繼續培養至細胞匯合度達到80%進行轉染。在1.5mL EP管中加入100μL JetPRIME緩沖液和40pmol的siRNA，移液器吹打混勻，加入2μL的JetPRIME試劑，再次吹打混勻，室溫孵育10min后將轉染復合物加入12孔板培養基中，轉染后4h更換完全培養基繼續培養。

1.3.3 RT-qPCR

采用TRIzol法從細胞中提取總RNA，通過A_260nm/A_280nm的比值檢測RNA純度。使用PrimeScript^TM RT Reagent Kit將mRNA逆轉錄成cDNA。RT-qPCR反應在8-Tube Strips中進行，每個處理3個重復，以β-actin基因作為內參。反應體系為20μL：TB Green10μL，cDNA（100ng）2μL，上游引物（10μmol·L^-1）0.8μL，下游引物（10μmol·L^-1）0.8μL，補ddH₂O至20μL。反應混合物在LightCycler^?96中進行3步擴增，共40個循環，熱循環反應設置：95 ℃10s，60 ℃1min，72 ℃1min。采用2^-ΔΔCt法計算基因mRNA的相對表達量。檢測所用引物通過Primer Premier5.0進行設計（表1），并送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.4 Western blot

轉染后48h，棄掉培養基，PBS洗3次，通過加入含有1%PMSF的RIPA裂解液從細胞中提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度。蛋白樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉到PVDF膜上，并將PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h。TBST（含5%吐溫-20的TBS）洗膜3次，每次10min。將膜分別與一抗β-Actin Mouse Monoclonal Antibody、PPAR Gamma Polyclonal antibody在4 ℃下過夜孵育后TBST洗膜3次，每次10min，然后將膜與Anti-mouse DyLight^TM680和Anti-rabbit DyLight^TM800二抗在室溫下避光孵育1h。按照相同的程序清洗膜，并通過Odyssey Infrared Imaging System進行成像。用Image J分析Western blot蛋白條帶的灰度值，計算相對蛋白表達量。

1.3.5 BODIPY脂滴染色與甘油三酯含量檢測

接種細胞到24孔板中，待匯合度達80%，轉染siPPARγ，4h后更換完全培養基，48h后棄掉培養基，用PBS清洗3次后加入4%多聚甲醛，室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS洗3次，每次5min。每孔加入PBS稀釋后的BODIPY493/503（1∶200）染色工作液，37 ℃避光孵育20min。染色結束后用PBS洗細胞3次，每次5min，置于熒光顯微鏡下觀察脂滴并拍照記錄。

轉染細胞后48h，用細胞刮刀刮取細胞，PBS重懸細胞，1000g離心10min收集細胞。按照甘油三酯（TG）含量檢測試劑盒說明書對甘油三酯含量進行測定。

1.3.6 CCK-8細胞活力檢測

以每孔約2×10³個細胞接種滋養層細胞到96孔板中，待細胞匯合度達到50%，轉染siPPARγ，每個處理5個重復，在轉染后24、48、72和96h，向每孔中加入10μL稀釋后的CCK-8工作液，37 ℃避光孵育2h后置于酶標儀上，檢測樣品在450nm處的吸光值，并使用GraphPad Prism8制作生長曲線。

1.3.7 流式檢測細胞凋亡

滋養層細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到80%，轉染siPPARγ后48h用PBS清洗細胞，加入胰酶消化液消化細胞，每個處理組設置3個重復。1000g離心10min去除胰酶，加入細胞培養液吹打細胞，1000g離心5min，棄上清，收集細胞，用PBS重懸細胞。取200μL細胞懸液（約1×10⁵個細胞）1000g離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻，最后加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育10min，隨后立即上機檢測。

1.3.8 細胞劃痕試驗

胰酶消化轉染后的滋養層細胞制備細胞懸液，將細胞懸液調整至每毫升約5×10⁵個細胞。每個處理組設置3個重復，用鑷子將細胞劃痕插件Culture Insert2Well置于24孔板中，向插件各孔中加入70μL細胞懸液，置于細胞培養箱中繼續培養。待細胞在插件孔內匯合度達90%后移去插件，然后用PBS清洗2次，更換無血清培養基繼續培養。分別于0、24、48、72h在顯微鏡下對各孔劃痕的同一區域進行觀察和拍照，通過Image J計算劃痕面積并分析劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（72h劃痕面積-0h劃痕面積）/0h劃痕面積×100%。

1.3.9 統計分析

采用GraphPad Prism v.8.0分析各組間數據差異的顯著性并繪圖，所有試驗均設置3個以上重復，兩組間數據比較采用獨立樣本T檢驗，兩組以上數據比較采用單因素方差分析，以“平均值±標準誤（Mean±SEM）”表示。*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。

2 結 果

2.1 免疫組化檢測綿羊滋養層細胞

純化后的綿羊滋養層細胞經免疫組化試劑盒檢測細胞角蛋白7（CK-7），其呈陽性表達（圖1B），而陰性對照中未檢測到陽性信號（圖1A）。

2.2 siRNA干擾效率檢測

轉染陰性對照和siPPARγ-1、siPPARγ-2、siPPARγ-3、siPPARγ-4至滋養層細胞后，通過Western blot、RT-qPCR檢測干擾效率。結果顯示，轉染siPPARγ-1的滋養層細胞內PPARγ的蛋白表達量和mRNA水平最低（圖2），干擾效率最高，即選用siPPARγ-1進行后續研究。

為探究PPARγ在滋養層細胞脂代謝中的調控作用，通過轉染siRNA干擾PPARγ基因的表達，脂滴染色結果顯示，干擾PPARγ后滋養層細胞的脂滴聚積能力下降（圖3A），同時細胞中的甘油三酯含量也出現下降趨勢（P＜0.01，圖3B）。RT-qPCR檢測脂代謝相關基因發現轉染siPPARγ-1后降低了滋養層細胞中CD36、FABP4和PLIN2的mRNA轉錄水平（P＜0.01，圖3C）。以上結果表明干擾PPARγ表達能夠抑制滋養層細胞的脂質積累。

2.4 干擾PPARγ表達對綿羊滋養層細胞增殖的影響

CCK-8法檢測干擾PPARγ后各個時間點的細胞增殖活力，結果如圖4顯示，在轉染48h后細胞的增殖活力開始受到抑制，到72h細胞增殖活力低于NC組（P＜0.05），表明抑制PPARγ可降低綿羊滋養層細胞的增殖活力。

2.5 干擾PPARγ表達對綿羊滋養層細胞凋亡水平的影響

轉染siRNA干擾片段48h后收集細胞，經流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果如圖5所示，Q1區域為壞死細胞，Q2區域為晚期凋亡細胞，Q3區域為活細胞，Q4區域為早期凋亡細胞，干擾組細胞的凋亡率（Q2+Q4）極顯著高于NC組（P＜0.01），表明抑制PPARγ的表達能夠促進滋養層細胞凋亡。

2.6 干擾PPARγ表達對綿羊滋養層細胞遷移的影響

劃痕試驗結果如圖6所示，觀察0、24、48和72h各個時間點劃痕愈合面積，與NC組相比，轉染siPPARγ-1后，在72h滋養層細胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.01），表明干擾PPARγ表達會抑制滋養層細胞的遷移能力。

3 討 論

滋養層細胞分離后的鑒定至關重要，為后續細胞試驗奠定基礎。Blaschitz等^[23]研究表明，細胞角蛋白-7（cytokeratin7，CK-7）以蛋白絲的形式表達于滋養層亞群中，而不表達于胎盤間充質細胞，因此CK-7可作為鑒定滋養層細胞的重要標志物。本試驗通過免疫組化法鑒定分離出的細胞中CK-7呈陽性表達，由此證明分離出的細胞為滋養層細胞。研究發現，滋養層細胞攝取脂質最重要的作用是誘導細胞中PPARγ的表達和活化，進而促進其下游與細胞攝取脂類物質的相關基因的表達，在脂質攝取和PPARγ活性之間產生正反饋循環^[24]。使用激素模擬附植時期子宮內環境來刺激滋養層細胞，可以提高滋養層細胞內PPARγ的表達水平^[25]。

PPARγ能夠調節脂肪細胞中脂肪酸結合蛋白（FABPs）、脂肪酸轉運蛋白（FATPS）、乙酰輔酶A結合蛋白（ACBP）和脂肪酸去飽和酶（FADS1、FADS2、SCD-1）的活性，其催化不飽和脂肪酸的去飽和生成花生四烯酸和其他二十烷酸前體^[26]。PPARγ表達還可以促進脂肪細胞和其他類型細胞中脂肪分化相關蛋白PLIN2（Perilipin2）的上調，PLIN2是脂滴包被蛋白PAT家族蛋白成員之一，能促進脂肪沉積，是細胞中脂滴存在的標志蛋白^[27]。KatsuhikoNaruse等^[28]研究表明，PPARγ脂肪酸配體濃度的不足或組織營養素中脂肪酸組成成分的失衡可能會阻遏植入前孕體的延長并導致妊娠丟失。脂肪酸可以提供孕體快速延長以及合成并分泌大量的生物活性因子所需的能量^[29]。在本研究中，通過轉染siRNA干擾PPARγ的表達后，滋養層細胞中的脂質積累能力顯著降低。同時，細胞中甘油三酯的含量和脂質積累相關基因脂肪酸移位酶CD36（cluster of differentiation36）、脂肪酸結合蛋白4（fatty acid binding protein4，FABP4）和PLIN2的轉錄水平也出現明顯下降。

PPARγ的轉錄水平在綿羊早期妊娠中逐漸上升，并通過調節其下游細胞因子來調控滋養層細胞的生命活動^[30-31]。PPARγ可以通過影響滋養層細胞增殖、分化、侵襲和脂質代謝，導致動物出現病理性妊娠^[32-33]，PPARγ表達水平異常可導致流產等妊娠失敗的結果^[34-35]。綿羊受精后第12～17天，胎盤滋養層細胞中PPARγ的轉錄水平逐漸上升，并伴隨著滋養層細胞的快速增殖和脂質代謝現象^[25]。胚胎著床前，孕體通過滋養層細胞數量和重量的指數增長快速延長，其中包括滋養層細胞的增殖、遷移和凝集并置^[36-37]。綜上所述，在干擾PPARγ基因表達后，綿羊滋養層細胞的增殖活性和細胞遷移率降低，細胞凋亡率上升，這為進一步探究PPARγ在妊娠早期調控滋養層細胞生命活動的分子機制提供依據。

4 結 論

PPARγ能夠促進綿羊滋養層細胞脂質積累及代謝相關基因的表達，同時PPARγ參與介導了綿羊滋養層細胞的增殖、遷移和凋亡調控。抑制PPARγ活性促進了綿羊滋養層細胞凋亡，抑制細胞增殖和細胞遷移率。這些結果能為進一步揭示PPARγ在滋養層細胞脂質代謝中的作用及其調控機制提供理論基礎。

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（編輯 郭云雁）