








摘 要:旨在研究植物乳桿菌及其后生元對育成期母貂生長性能、免疫功能及腸道健康的影響。試驗采用2×2試驗設計,選取40只12周齡的灰色母貂分成4組,每組10個重復。4組分別為對照組、0.1%植物乳桿菌(活菌數>106CFU·mL-1)添加組、0.3%植物乳桿菌后生元添加組、0.1%植物乳桿菌+0.3%植物乳桿菌后生元添加組。預試期1周,正試期8周。本試驗從生長性能、試驗期間記錄體重和采食量用于測定生長性能,試驗結束時采集血液、空腸組織和內容物檢測血清免疫、黏膜免疫和腸道菌群方面做了檢測等指標,結果發現:1)植物乳桿菌顯著增加了水貂4周和8周的體重(P<0.05),提高了0~4周和0~8周的平均日增重、平均日采食量(P<0.05),降低了血清IgG、黏膜TNF-α的含量(P<0.05),增加空腸黏膜sIgA含量(P<0.05)。2)植物乳桿菌后生元顯著增加血清IgG、空腸黏膜IFN-γ的含量(P<0.05),降低了IL-2、IL-12和TNF-α的含量(P<0.05)。3)植物乳桿菌及其后生元對育成期母貂腸道菌群的Alpha多樣性指數影響不顯著(P>0.05)。在屬水平上,植物乳桿菌組的Sporosarcina、Aminobacter、Agathobacter的相對豐度顯著低于未添加植物乳桿菌組(P<0.05),Fastidiosipila的相對豐度顯著高于未添加植物乳桿菌組(P<0.05); 植物乳桿菌后生元組Kocuria、Plesiomonas、unclassified_f_Lachnospiraceae、Sanguibacter、Microbacterium、Glutamicibacter和Paracoccus的相對豐度顯著低于未添加后生元組(P<0.05),Staphylococcus、Weissella、Brevibacterium、Dietzia、Brachybacterium、Carnobacterium、Aerococcus和Sphingomonas的相對豐度顯著高于未添加后生元組(P<0.05)。4)植物乳桿菌益生菌及后生元對育成期母貂血清中IgA、IgM含量和黏膜中IL-2、IL-10、IL-8、TNF-α含量影響互作效應顯著(P<0.05)。綜上所述,飼糧中添加植物乳桿菌益生菌可提高母貂的生長性能。植物乳桿菌益生菌及后生元均能夠改善水貂的免疫功能,提高腸道有益菌屬的相對豐度。
關鍵詞:植物乳桿菌;植物乳桿菌后生元;水貂;生長性能;免疫功能;腸道健康
中圖分類號:S862.220.4
文獻標志碼:A
文章編號:0366-6964(2024)06-2530-10
收稿日期:2024-09-19
基金項目:山東省現代農業特種經濟動物產業技術體系(SDAIT-21-8)
作者簡介:李亞霖(1998-),女,山東萊州人,碩士生,主要從事動物營養與飼料科學研究,E-mail:859847078@qq.com
*通信作者:王利華,主要從事動物營養與環境研究,E-mail:lhwang2007@sina.com
Effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus plantarum Postbiotics on
Growth Performance,Immune Status and Intestinal MicrofloraHealth of Growing
Female Minks
LIYalin,ZHENShibo,CAOLin,SUNFengxue,WANGLihua*
(College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural
University,Qingdao266109,China)
Abstract:(Objective)This experiment was conducted to study the effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus plantarum postbiotics on productiongrowth performance,immune status and intestinal microflorahealth of growing female minks.(Methods)A total of40gray female minks at12weeks of age were selected and divided into4groups with10replicates per group.The minks were fed basal diet,basal diet supplemented with0.1%Lactobacillus plantarum(viable bacteria number>106CFU·mL-1),basal diet supplemented with0.3%postbiotics of Lactobacillus plantarum,basal diet supplemented with0.1%Lactobacillus plantarum and0.3%postbiotics of Lactobacillus plantarum,respectively.The pre-experimental period lasted for1week,and the experimental period lasted for8weeks.(Result)Growth performance,serum immunity,mucosal immunity and intestinal microflora were tested in this experiment,and the resultsDuring the experiment,bodyweight and feed intake were recorded to determine the growth performance.At the end of the experiment,blood,jejunum tissue,jejunal content were collected to determine the immune indexes and microflora.The results were showed as follows:1)Compared to the minks in group without Lactobacillus plantarum,minks in Lactobacillus plantarum group had greater body weight at week4and week8(Plt;0.05),average daily gain and average daily feed intake for the first4weeks and the entire8weeks(Plt;0.05),sIgA content in jejunal mucosa(Plt;0.05),and had less IgG content in serum and TNF-α content in jejunal mucosa(Plt;0.05).2)Minks supplemented withCompared to the minks in group without Lactobacillus plantarum postbiotics,minks in postbiotics had greater IgG content in serum and IFN-γ content in jejunal mucosa(Plt;0.05),and less IL-2,IL-12and TNF-α content in jejunal mucosa(Plt;0.05).3)Neither Lactobacillus plantarum nor postbiotics had significant effects on Alpha diversity index of intestinal flora for growing female minks(Pgt;0.05).Minks in Lactobacillus plantarum group had less proportion of Sporosarcina,Aminobacter and Agathobacter,and greater proportion of Fastidiosipila in rectal flora than minks in group without Lactobacillus plantarum(Plt;0.05).Minks in the postbiotics groups had greater proportion of Staphylococcus,Weissella,Brevibacterium,Dietzia,Brachybacterium,Carnobacterium,Aerococcus and Sphingomonas,and less proportion of Kocuria,Plesiomonas,unclassified_f_Lachnospiraceae,Sanguibacter,Microbacterium,Glutamicibacter and Paracoccus in rectal flora than minks in group without postbiotics(Plt;0.05).4)Interactions between Lactobacillus plantarum and Lactobacillus plantarum postbiotics were significant for serum IgA and IgM contents,jejunum IL-2,IL-10,TNF-α,IL-8levels(Plt;0.05).(Conclusion)In conclusion,dietary Lactobacillus plantarum supplementation could improve the growth performance of female minks,both Lactobacillus plantarum and Lactobacillus plantarum postbiotics improved the immune function of females and increase the relative abundance of beneficial bacteria.
Key words:Lactobacillus plantarum; Lactobacillus plantarum postbiotics; mink; growth performance; immune status; intestinal microflorahealth
*Corresponding author:WANG Lihua,E-mail:lhwang2007@sina.com
水貂的育成期正值一年中最炎熱的時期。水貂飼糧以動物源性鮮飼料為主,鮮飼料在夏季極易腐敗,容易引發水貂腸道的各種疾病[1]。乳酸菌是一種常用的益生菌,可產生有機酸和細菌素等物質[2],改善腸道菌群結構,增強宿主免疫功能,提高生長性能[3]。有研究發現,滅活后的乳酸菌依靠菌體的競爭排斥和其代謝產物中含有的有機酸等發揮作用,與活菌功能相似[4]。這些對宿主健康有益的無生命微生物和/或其成分的制劑,如滅活菌和代謝產物屬于后生元(postbiotics)[5-6]。由于后生元保質期較長,安全性和穩定性也相對較高,能夠彌補益生菌存在的一些不足[7]。因此,后生元已逐漸在動物生產中得到應用,然而目前在水貂中的應用還比較少。本研究以育成期的母貂為研究對象,通過在日糧中添加益生菌植物乳桿菌及其后生元探討其對水貂生長性能、免疫功能和腸道菌群的影響,以期為后生元在水貂中的應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
本試驗中使用的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,LP)為凍干粉形式(編號:194165),菌株購自北納生物公司(BNCC),凍干的植物乳桿菌活化后擴繁至大于106CFU·mL-1菌液。植物乳桿菌菌液在高溫滅活后用奶粉按1∶3混合制成植物乳桿菌后生元(postbiotics of Lactobacillus plantarum,PLP)粉劑。
1.2 試驗設計
試驗采用2×2交叉試驗設計,植物乳桿菌益生菌的添加量為0、0.1%,植物乳桿菌后生元的添加量為0、0.3%。選取40只12周齡的灰色母貂(初始體重為928.68±20.37g)隨機分成4組,每組10個重復。4組分別為對照組(基礎日糧中未添加植物乳桿菌益生菌及后生元組),植物乳桿菌益生菌組(基礎飼糧中添加0.1%植物乳桿菌菌液,活菌數大于106CFU·mL-1),植物乳桿菌后生元組(基礎飼糧中添加0.3%植物乳桿菌后生元),植物乳桿菌益生菌-后生元組(基礎飼糧中添加0.1%植物乳桿菌菌液和0.3%植物乳桿菌后生元)。試驗預試期1周,正試期8周。正試期分為0~4周和5~8周兩階段。基礎飼糧組成和營養水平見表1。
1.3 飼養管理
飼養試驗在煙臺市海陽的某水貂養殖場進行。所有的試驗水貂在試驗開始之前已完成犬瘟熱與細小病毒疫苗接種、并埋植褪黑激素(10mg·只-1)。貂舍為雙列式棚舍,貂籠為金屬網拼接而成(75cm×30cm×45cm,L×W×H),每個貂籠在過道處設有一個與貂籠相通的木質窩箱(30cm×30cm×30cm,L×W×H)。試驗期內采用自然光照,每天飼喂2次,將飼料置于籠頂,供水貂自由采食。貂籠內設有水盒保證自由飲水。
1.4 測定指標及方法
1.4.1 生長性能
在試驗開始和試驗開始后的第4、第8周分別對水貂逐只進行稱重,稱重前禁食8h,記錄每天采食量,計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.4.2 血清免疫
試驗期結束時,每組選6個重復,心臟采血10mL,離心機3000r·min-1離心10min,制備血清,保存于-20℃。用ELISA法檢測血清中IgA、IgG、IgM的含量。
1.4.3 空腸免疫指標及直腸菌群
飼養試驗結束后,每組取6個重復進行屠宰試驗,剪取一段空腸置于-80℃冰箱中保存,同時收集水貂直腸內容物于凍存管中,先置于液氮中,后轉移至-80℃冰箱保存。
刮取空腸黏膜組織,按1∶9加入生理鹽水制作組織勻漿,在3500r·min-1下低溫離心10min,取上清液。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定分泌型免疫球蛋白(sIgA)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)的濃度,均使用全波長酶標儀(CFX96,伯樂公司)測定。
用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP公司,美國)對直腸內容物進行DNA抽提,完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA V3~V4可變區進行PCR擴增[8]。在ABI GeneAmp?9700型PCR儀器上進行程序設置:95℃預變性3min,27個循環(95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s),最后72℃延伸10min。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,用AxyPrep DNA(Axygen公司,美國)試劑盒進行純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega公司,美國)進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺進行對純化后的擴增片段構建PE300文庫,利用Illumina MiSeq PE300平臺進行測序[9]。
1.5 數據統計分析
采用SPSS25.0軟件的一般線性模型(GLM)對試驗數據進行植物乳桿菌益生菌、植物乳桿菌后生元及二者的互作效應進行分析,如二者的互作效應不顯著,結果按植物乳桿菌益生菌、植物乳桿菌后生元主效應給出;如二者的互作效應顯著,結果分別按對照組、植物乳桿菌益生菌組、植物乳桿菌后生元組和植物乳桿菌益生菌-后生元組給出,并采用Duncan′s法進行多重比較。Plt;0.05為差異顯著。
2 結 果
2.1 LP和PLP對育成期母貂生長性能的影響
因為植物乳桿菌益生菌及后生元對水貂生長性能的互作效應不顯著(P>0.05),所以結果按植物乳桿菌益生菌、植物乳桿菌后生元主效應給出(表2)。與LP未添加組相比,LP顯著增加水貂4周和8周的體重(P<0.05),提高0~4周和0~8周的平均日增重、平均日采食量(P<0.05)。植物乳桿菌后生元對試驗貂的生長性能各指標均無顯著影響(P>0.05)。
2.2 LP和PLP對育成期母貂血清免疫的影響
由表3可知,植物乳桿菌益生菌及后生元對血清中IgG的作用顯著(P<0.05),對IgA和IgM的作用不顯著(P>0.05)。與LP未添加組相比,LP顯著降低IgG的含量(P<0.05)。與PLP未添加組相比,PLP顯著增加IgG的含量(P<0.05)。植物乳桿菌益生菌及后生元對水貂IgA和IgM的互作效應顯著(P<0.05)。與對照組相比,LP組的IgA和IgM含量顯著增加(P<0.05)。
2.3 LP和PLP對育成期母貂空腸黏膜免疫的影響
由表4可知,植物乳桿菌益生菌對育成期母貂SIgA和TNF-α的含量有顯著影響(P<0.05),植物乳桿菌后生元對育成期母貂IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量均有顯著影響(P<0.05)。與LP未添加組相比,LP顯著增加sIgA含量(P<0.05),顯著降低TNF-α的含量(P<0.05)。與PLP未添加組相比,PLP顯著降低IL-2、IL-12和TNF-α的含量(P<0.05),顯著增加IFN-γ的含量(P<0.05)。植物乳桿菌益生菌及后生元對育成期母貂IL-2、IL-10、IL-8、TNF-α的含量影響互作顯著(P<0.05)。與對照組相比,LP組的IL-8和IL-2含量顯著降低(P<0.05),LP組、PLP組和LP-PLP組的TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)。LP組和PLP組的IL-10含量顯著低于LP-PLP組(P<0.05)。
2.4 LP和PLP對育成期母貂直腸菌群的影響
2.4.1 LP和PLP對育成期母貂直腸菌群Alpha多樣性指數的影響
由表5可知,植物乳桿菌益生菌及后生元對育成期母貂直腸菌群的Shannon指數、Simpson指數、Ace指數和Chao1指數均無顯著性影響(P>0.05)。植物乳桿菌益生菌及后生元對育成期母貂的直腸菌群Alpha多樣性指數的互作效應不顯著(P>0.05)。
2.4.2 LP和PLP對育成期母貂直腸菌群相對豐度的影響
因為植物乳桿菌益生菌及后生元對水貂直腸菌群相對豐度的互作效應不顯著(P>0.05),所以結果按植物乳桿菌益生菌、植物乳桿菌后生元主效應給出(圖1~4)。如圖1所示,LP未添加組的前四種菌屬為Lactobacillus、Cetobacterium、unclassified_f__Peptostreptococcaceae、Enterococcus。LP組的前四種菌屬為Streptococcus、Lactobacillus、Cetobacterium、Angelakisella。與LP未添加組相比,LP組Lactobacillus的相對豐度減少,Streptococcus的相對豐度增加。如圖2所示,PLP未添加組的前四種菌屬為Streptococcus、Lactobacillus、Cetobacterium、unclassified_f__Peptostreptococcaceae。PLP組的前四種菌屬為Lactobacillus、Angelakisella、Cetobacterium、Streptococcus。與PLP未添加組相比,PLP組Lactobacillus和Angelakisella的相對豐度增加,Escherichia-Shigella和Streptococcus的相對豐度減少。
在屬水平上(圖3),與LP未添加組相比,LP組的Sporosarcina、Aminobacter和Agathobacter的相對豐度顯著降低(P<0.05),Fastidiosipila的相對豐度顯著增高(P<0.05)。在屬水平上(圖4),與PLP未添加組相比,PLP組Kocuria、Plesiomonas、unclassified_f__Lachnospiraceae、Sanguibacter、Microbacterium、Glutamicibacter和Paracoccus的相對豐度顯著降低(P<0.05),Staphylococcus、Weissella、Brevibacterium、Dietzia、Brachybacterium、Carnobacterium、Aerococcus和Sphingomonas的相對豐度顯著增高(P<0.05)。
3 討 論
3.1 LP和PLP對育成期母貂生長性能的影響
本試驗結果發現,飼糧中添加植物乳桿菌益生菌能夠改善水貂的生長性能,但植物乳桿菌后生元并未表現出促生長作用。這與劉斯斯等[10]在肉雞上和吳飛等[11]在斷奶仔豬上的研究結果相同。植物乳桿菌通過自身活動產生的消化酶等代謝物,可以將機體中難以消化吸收的大分子物質降解為容易被機體利用的小分子營養物質,來提高營養物質的吸收率,從而提高生產性能[12]。吳飛等[11]研究發現,后生元可以提高斷奶仔豬的平均日增重,但本試驗中后生元并未表現出促生長作用。本試驗所用的后生元經高溫滅活制備而成,高溫可能會破壞植物乳桿菌產生的消化酶活,因此后生元沒有通過改善養分消化率而實現促生長的作用。另外試驗動物也存在著差異。
3.2 LP和PLP對育成期母貂免疫功能的影響
IgG主要介導抗感染免疫,IgM是機體體液免疫中出現最早的抗體,具有殺菌激活補體等功能[13],IgA主要參與黏膜免疫[14]。殷成港等[15]研究發現,添加后生元提高了斷奶仔豬血漿中IgA和IgG含量。潘泰典等[16]研究發現,添加植物乳桿菌可以提高肉兔血液中IgG、IgA和IL-2的含量。這與本試驗結果一致。IgM可以調節免疫反應,促進IgG的產生和對外來抗原的初始反應[17]。乳酸桿菌的代謝產物激活Th2細胞產生IL-5,IL-5是有效的IgA產生因子,進而促進IgA的產生,提高機體免疫力[18]。
水貂的腸道較短,腸道分小腸(包括十二指腸、空腸、回腸)與大腸(包括結腸、直腸、肛門)。小腸內層較厚,有豐富的絨毛黏膜層,但從內層看腸腔觀察分區不明顯,而空腸相較位于十二指腸和回腸,處于中間位置,較好分辨。腸黏膜免疫屏障中的各種促炎因子和抗炎因子協同調節炎癥的發生和發展[19]。sIgA調節黏膜穩態,保護腸上皮細胞免受細菌毒素影響[20]。IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α等細胞因子具有促炎和免疫調節作用。IL-10是一種抗炎細胞因子,可以通過阻斷促炎細胞因子的產生,抑制有害的免疫反應[21]。Xu等[22]研究發現,給感染產氣莢膜梭菌蛋雞灌服植物乳桿菌,可以降低TNF-α的mRNA相對表達量。Dalloul等[23]研究表明,乳酸桿菌類飼料產品可上調雞腸道IFN-γ表達。這與本試驗的結果一致。乳酸菌菌株肽聚糖可以調節TLR-4信號通路,抑制炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達[24]。植物乳桿菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)通過降低Pam2CSK誘導的IL-8的表達從而抑制腸上皮細胞炎癥發應[25]。植物乳桿菌分泌的聚集促進因子蛋白能夠增強益生菌與黏蛋白的結合能力,有助于益生菌適應腸道環境并限制病原體在腸道黏膜黏附,從而促進腸道環境平衡[26]。
3.3 LP和PLP對育成期母貂直腸菌群的影響
萬瑾怡和袁建敏[27]研究發現,在肉雞飼糧中添加滅活的植物乳桿菌能使乳酸桿菌(Lactobacillus)的相對豐度顯著增高,并且腸球菌(Enterococcus)、志賀大腸桿菌(Escherichia-Shigella)等的相對豐度降低。黃金貴等[5]試驗結果表明,在肉雞飼糧中添加PLP能夠提高其盲腸內乳酸桿菌數量。本試驗研究也證實,有益菌的相對豐度增加。Weissella有顯著的抗微生物和抗炎性質[28]。Carnobacterium能夠產生抗菌物質,并且抑制Vibrio等病原體的活性[29]。Plesiomonas具有一定的耐藥性,并對動物機體有嚴重的致病性[30]。Escherichia-Shigella產生的細菌毒素,導致機體腹瀉,對機體腸道健康造成損傷[31]。Plesiomonas和Escherichia-Shigella等菌屬的相對豐度降低,Weissella和Carnobacterium等菌屬的相對豐度增高,與植物乳桿菌及其代謝產物有一定相關性。乳桿菌屬通過降低pH或改變受體來產生多種短鏈脂肪酸和細菌素發揮抑菌或殺菌作用[32]。植物乳桿菌EPS可以阻止有害菌黏附在腸上皮細胞上,促進有益菌的增殖,從而減少有害菌和有害物質[33]。試驗結果和已有報道的菌屬存在差異,可能與試驗動物和動物飼料的不同相關。
4 結 論
在本試驗條件下,飼糧中添加植物乳桿菌益生菌可提高育成期母貂的生長性能,植物乳桿菌益生菌及后生元均能夠改善母貂的免疫功能,并且提高了Weissella和Carnobacterium等有益菌菌屬的相對豐度。
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(編輯 范子娟)