宏基因組技術診斷親內皮皰疹病毒感染致瀕危亞洲象死亡病例

摘 要：本研究旨在借助宏基因組測序分析技術快速發現引起瀕危亞洲象死亡的可能病原，再結合常規診斷技術，對大象病因進行分析和確診，為大象相關疫病的快速診斷和預防提供參考。對死亡大象進行尸檢，取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、肌肉、胃、十二指腸、空腸、結腸、盲腸、胰腺等器官制備切片，進行HE染色和病理切片分析；取腹股溝淋巴結進行宏基因組測序分析；使用特異性PCR方法對特征基因進行擴增和測序，經序列比對繪制進化樹，分析其與其他毒株的進化關系。結果顯示，死亡大象的剖檢和病例切片結果符合象親內皮皰疹病毒感染的特征，宏基因組分析結果顯示，大象的腹股溝淋巴結中含有大量的象β皰疹病毒1型（即親內皮皰疹病毒）。該大象死亡的原因可能是象親內皮皰疹病毒感染所致，宏基因組技術對大象親內皮皰疹病毒感染以及其他瀕危動物病例的快速診斷具有良好的應用前景。

關鍵詞：亞洲象；親內皮皰疹病毒；宏基因組分析

中圖分類號：S858.93

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2569-09

收稿日期：2023-09-18

基金項目：重大外來動物疫病阻斷與防控技術研發項目（2022YFD1800500）

作者簡介：沈青春（1976-），男，湖北麻城人，正高級獸醫師/研究員，博士，主要從事動物支原體、布魯氏菌病流行病學與防控技術及生物信息學研究，E-mail：shenqingchun@caas.cn；劉 青（1983-），山東威海人，高級獸醫師，博士，主要從事野生動物疾病檢測工作，E-mail：liuqing0631@163.com；仉 偉（1979-），山東泰安人，高級獸醫師，主要從事野生動物疾病防治工作，E-mail：13176688152@163.com。沈青春、仉偉和劉青為同等貢獻作者

*通信作者：范學政，主要從事人畜共患病、重大傳染病獸用新型疫苗、新型診斷試劑研發工作，E-mail：fanxuezheng@caas.cn；李 偉，主要從事野生動物疾病相關研究，E-mail：1279257279@qq.com

Diagnosis of Death Cases of an Endangered Asian Elephants Caused by Endothelial

Herpesvirus Infection with Metagenomic Technology

SHENQingchun¹，ZHANGWei²，LIUQing²，LIUYiduo³，QIANJiahao¹，ZHANGBoyuan¹，

ZHOUShizhong¹，ZHANGYichen¹，XINGQianru¹，DINGJiabo¹，ZHOUXiangmei³，

ZHANGGuangzhi¹，LIQiuchen¹，LIWei^2*，FANXuezheng^1*

（1.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，

China; 2.Jinan Park Development Service Center，Jinan250099，China; 3.College of

Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Abstract：This study aims to use metagenomic sequencing analysis technology to quickly diagnose the possible pathogens causing the death of an Asian elephant，and then combine with conventional diagnostic techniques to analyze and confirm the etiological cause of elephant diseases，so as to provide reference for rapid diagnosis and prevention of elephant-related diseases.Autopsies were performed on dead elephant，and organs such as the heart，liver，spleen，lungs，kidneys，lymph nodes，muscles，stomach，duodenum，jejunum，colon，cecum，and pancreas were removedcollected and sectioned for HE staining and pathological analysis; Metagenomic sequencing analysis was performed on the inguinal lymph nodes; species-specific PCR were used to amplify and sequence the characteristic genes，and an evolutionary tree was drawn to analyze its phylogenetic relationship with other strains.Data showed that necropsy and case biopsy results of dead elephant are consistent with the clinical characteristics of endothelial herpesvirus infection in elephants.Metagenomic analysis detected alarge number of elephant betaherpesvirus type1（i.e.，parent endothelial herpes virus）in the inguinal lymph nodes of elephants.The death of the elephant was probably caused by endothelial herpesvirus infection.Metagenomic technology offers valuable application prospects for the rapid diagnosis of endothelial herpesvirus infection in elephants as well as other endangered animal clinical infectious cases.

Key words：Asian elephant; endothelial herpesvirus; metagenomic analysis

*Corresponding authors：FAN Xuezheng，E-mail：fanxuezheng@caas.cn; LI Wei，E-mail：1279257279@qq.com

亞洲象（Elephas maximus）為瀕危物種，全球僅存約5萬頭，其中我國境內僅有約300頭^[1-2]。多種原因導致亞洲象的種群數量不斷下降，傳染性疾病給亞洲象保育工作帶來新的打擊，其中，象親內皮皰疹病毒（elephant endotheliotropic herpesviruses，EEHV）感染可導致系統性出血性疾病，造成亞洲象急性死亡，致死率極高，是威脅亞洲象種群數量增長的主要因素之一^[3-5]。2023年3月，某公園一頭圈養亞洲小公象不明原因突然死亡，排除飼料中毒等因素，作者借助宏基因組測序技術^[6]、特異PCR驗證、基因同源性分析、病理學分析等，證明該象是由象親內皮皰疹病毒1A型引起。本文對該起病例進行了回顧性分析，以便為以后的防治工作提供參考。

1 發病情況

亞洲公象，2歲10個月，既往健康，膘情良好，突然發病經搶救無效死亡，發病前無明顯癥狀，經觀察皮張完整，無外傷；平躺，無掙扎痕跡；眼結膜、舌面發紺，初步排除飼料中毒等因素。

2 尸體剖檢與實驗室檢驗

2.1 尸體剖檢

按臨床一般程序進行腹腔和胸腔剖檢，觀察各臟器大概病變情況，并采樣用于病理分析和檢測。

2.2 病理分析

取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、肌肉、胃、十二指腸、空腸、結腸、盲腸、胰腺等組織，剪成1～2cm大小，浸入10%福爾馬林中固定12h，制備病理切片，然后采用HE染色，并進行病理學分析。

2.3 宏基因組測序

取腹股溝淋巴結使用深圳華大智造科技股份有限公司生產的高通量測序平臺進行宏基因組測序，主要過程如下：提取核酸樣本，取1μg DNA，經過DNA酶切片段化，片段篩選，末端修復、連接index接頭，環化、文庫富集、酶切消化、建立環形文庫。再經過滾環復制，生成DNA納米球，通過MGISEQ-2000RS測序平臺，進行2*150bp測序。將獲得的測序數據使用KneadData流程（https：∥bitbucket.org/biobakery/kneaddata）進行處理，采用Trimmomatic對測序reads進行質控^[7]，再通過bowtie2建立亞洲象基因組（NCBI參考基因組GCF_024 166 365.1）的宿主庫^[8]，經比對去除去宿主核酸序列，使用Kraken2對比到古菌archaea、細菌bacteria、載體UniVec_Core、病毒viral數據庫中^[9-10]，獲得物種及豐度信息，使用Krona對其進行可視化展示^[11]。

2.4 特異PCR驗證及測序

取脾、肝、腎、腸系膜淋巴結提取核酸，與宏基因組測序中提取的核酸樣本一起，參考文獻方法進行特異PCR驗證^[12]，將PCR擴增的目的條帶送公司測序。

2.5 Blast比對及同源性分析

將測序所得序列去除兩端引物序列，截取中間484bp序列，在NCBI上利用Blast模塊檢索同源序列，設置覆蓋率（Query coverage）為100%，檢索出62條同源序列。利用MEGA7.0軟件繪制遺傳進化樹，再經iTOL在線工具（https：∥itol.embl.de/）優化。

3 結 果

3.1 尸體剖檢

腹腔腸系膜有少量出血點，并伴有輕度水腫。

各段腸管漿膜均有大量出血斑點，尤以盲腸最為嚴重；胃、小腸（尤其回腸）黏膜腫脹，呈深紅色的彌漫性斑塊狀或點狀出血；盲腸和結腸黏膜出血，但程度較輕。胰腺腫大、散布點狀與斑塊出血；肝質量30kg，表面有少量出血點；脾長150cm，表面有出血點；腎包膜散布少量出血斑點。心包大量積液，質地透明清亮；心肌松軟，心內外膜、心肌出現大面積出血點斑。肺表面有少量出血斑點，切面基本正常。部分臟器病變見圖1。

3.2 病理組織學分析

各臟器均呈現嚴重/中度的出血，有炎性浸潤，主要病變集中于血管：血管內皮腫脹脫落，血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，可見透明血栓和混合血栓形成。本例動物的病理變化以血液循環障礙為主，包括水腫、充血、淤血、出血和彌散性血管內凝血等多種病理表現，出血性病變為其最主要的特征。具體如下：

心外膜大量出血，心肌纖維嗜伊紅深染，排列紊亂，結構疏松，心肌間有大小不一的出血灶，可見部分心肌間有粉染的纖維蛋白（圖2A），血管內皮細胞腫脹、壞死脫落（圖2B）。

肝：低倍鏡下，可見肝臟被膜及實質出血，實質嚴重出血、淤血。高倍鏡下可見，肝細胞輕微腫脹，顆粒變性，排列紊亂，間質增寬，其間充斥紅細胞及少量炎性細胞，浸潤的炎性細胞包括淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞（圖2C）；部分血管充血、淤血，周圍疏松水腫，可見一大血管破裂，破裂的血管中有血栓形成（圖2D）。

脾：脾嚴重出血，淋巴細胞彌漫性凋亡、壞死、崩解且明顯減少，脾小體幾近消失，僅在中央動脈周圍殘留少量淋巴細胞; 紅髓中固有的細胞成分減少，脾髓內充盈大量血液，小梁中的平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松。高倍鏡下，可見血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，血管內皮變性脫落（圖2E）。

肺：肺間質增寬；肺泡壁毛細血管擴張充血，有的部位可見紅細胞黏集，可見透明血栓（圖2F）；細支氣管可見大量脫落的上皮細胞、藍染黏液及炎性細胞（圖2G）。

腎：腎臟嚴重出血；腎間質增寬，充斥大量紅細胞，腎小管上皮細胞從基底膜脫落，可見蛋白管型/細胞管型（圖2H）；腎小球毛細血管充血，有透明血栓形成。部分血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，血管內皮變性脫落（圖2I）。

肌肉：肌纖維間隙增寬，纖維間可見出血及少量炎性細胞浸潤（圖2J）。

淋巴結：淋巴細胞凋亡、壞死、消失，出血，皮髓結構完全破壞，未見正常的淋巴小結?？梢娡淌杉t細胞的巨噬細胞，還可見散在分布的嗜堿性藍染的淋巴細胞團（圖2K）。

胃腸道：可見黏膜上皮壞死脫落，黏膜下層疏松水腫，有炎性細胞浸潤（圖2L），肌層出血嚴重，肌纖維間隙明顯增寬，其間充斥大量紅細胞；炎性細胞主要是淋巴細胞、漿細胞。

根據文獻[13-15]報道的相關癥狀及病理切片，以及以上鏡下表現推測，大象的死亡可能與毒血癥相關，結合急性死亡，推測可能為象親內皮皰疹病毒（EEHV）感染引起出血性病變而導致。

3.3 宏基因組測序分析結果

取死亡大象的腹股溝淋巴結，提取核酸后，采用MGISEQ-2000RS-高通量PE150試劑盒（v3.1）構建測序文庫，使用MGISEQ-2000RS測序平臺，進行2*150bp測序，得到上下游原始數據各24 G，使用kneaddata、trimmomatic和bowtie2對原始數據進行質控和出宿主DNA處理后，再用kraken2進行物種注釋和物種豐度信息計算，在使用krona進行結果展示，如圖3。

從宏基因組分析結果來看，各分類物種中占比最大的為象β皰疹病毒1型（Elephantid betaherpesvirus1），其特異性核酸占總體核酸的6%，其次是布魯氏菌（Brucella），特異性核酸占比為1%。由于病毒基因組相對較小，6%特異性核酸的占比對應的病毒數量則占絕對的優勢，因而可以確定該大象感染了象β皰疹病毒1型，可能是大象的死亡原因。象β皰疹病毒1型（Elephantid betaherpesvirus1），又稱象親內皮皰疹病毒（elephant endotheliotropic herpesviruses，EEHV），屬于Proboscivirus屬（即長鼻動物病毒屬）的成員^{[12，16]}。

結合臨床癥狀和病例切片檢測結果，可判斷該頭亞洲象是感染象親內皮皰疹病毒（EEHV），出現敗血癥引起的急性死亡。

3.4 特異PCR驗證及測序

取脾、肝、腎、腸系膜淋巴結、腹股溝淋巴結淋巴結組織，提取核酸，進行EEHV特異PCR擴增，結果均擴增出約537bp左右的特異條帶（圖4），證明其中含EEHV核酸成分。

3.5 Blast比對及同源性分析

Sanger測序所得序列通過Blast比對，共檢索出62條覆蓋率100%的序列，結果顯示與EEHV1A毒株高度同源（相似性96.7%～100%）。然后整理此次大象分離EEHV1A序列及62條檢索序列同源區484bp序列，最后通過MEGA7.0和iTOL繪制進化樹，由此發現此次大象分離EEHV1A序列與歐美分離株（MF579 070.1、KT007 218.2、JF692 770.1、HM568 510.1）進化關系較近，相似性達100%，對應的毒株名稱為IP222、North American NAP72、European EP14、North American NAP11（圖5）。

4 討 論

亞洲象為瀕危物種，我國存量稀少，極為珍貴。傳染性疾病給亞洲象帶來極大威脅，其中，象親內皮皰疹病毒感染可導致系統性出血性疾病，造成亞洲象急性死亡，致死率極高，是威脅亞洲象種群數量增長的主要因素之一^[17-19]?；谄蕶z觀察，本病例以內臟出血性病變為主。根據病理分析，本起大象死亡可能與敗血癥相關，常見的引起象敗血癥的感染性病原體包括：象親內皮皰疹病毒（EEHV）、大腸桿菌、沙門菌或金黃色葡萄球菌等。其中象親內皮皰疹病毒（EEHV）是最常報道的導致象急性、致命性和出血性疾病的病原體。該病的臨床癥狀主要包括面部腫脹、舌發紺、血小板減少、單核細胞減少和內臟器官出血^[13，20]。Perrin等^[21]對27例致命性大象嗜內皮性皰疹病毒出血性疾病的回顧性分析顯示，EEHV感染引起明顯的彌散性血管內凝血（DIC）。本病例的病理結果與上述報道高度吻合。大象死亡歸因于廣泛的血管損傷和多器官功能障礙，包括嚴重的急性心肌出血和隨后的心力衰竭。Perrin等^[21]還發現在沒有細菌感染的情況下觀察到的全身炎癥可能與細胞因子釋放綜合征有關，并強調了EEHV病毒血癥期間研究細胞因子反應和止血的必要性，支持抗炎治療與抗病毒治療和心血管支持聯合使用。

在北美，圈養的4個月至15歲的年輕活產亞洲象死亡中，60%是由EEHV造成的。該病的臨床病程非常快，僅1～5d，表現為嗜睡、水腫和舌紫，病理檢查顯示各主要內臟器官出現微血管損傷、出血和局變性壞死病變^[22-23]。EEHV樣皰疹病毒還不知道是否存在于象種之外，也沒有在細胞培養中被分離出來，沒有實驗動物模型，給EEHV的免疫機制、致病機制研究帶來障礙。

宏基因組測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是基于二代或三代高通量測序技術的一種新興微生物檢測鑒定技術，能夠快速識別病原微生物，在發現未知病原體、難以培養的病原體和疑難感染早期診斷方面有顯著優勢^[6，24-25]。mNGS技術應用于大象等野生動物已有相關報道，主要用于腸道微生物調查及流行病普查，還沒有用于發病或死亡大象病例的病原學診斷的報道^[26-29]。由于缺乏敏感細胞系，象親內皮皰疹病毒分離培養存在困難。本病例中，先由宏基因組測序對病原進行識別，為病因快速精準識別提供了技術手段。結合尸檢和病理切片結果及PCR驗證和測序分析，進一步驗證了該病例是由EEHV1A型引起的死亡。

在我國，亞洲象存量僅300多頭，十分珍貴^[1]。鑒于該病感染率高、死亡快，無有效治療藥物，且大象野性強，難以接觸，對其進行專項檢測，及早采取良好的預防措施就顯得極為重要。感染期間可采用抗炎治療與抗病毒治療和心血管支持聯合使用^[21]。另外，鑒于亞洲象種群少，病毒無敏感細胞，全病毒疫苗制備難度大，是否可采取亞單位疫苗或mRNA疫苗進行免疫，值得探討。另一方面，要給斷奶后的小象提供營養全面的飼料（特別要添加奶粉），增強其自身抵抗力；還要做好館舍日常消毒和監測工作，防止患有皰疹病的人或帶毒成年象接觸小象引起感染。

保護象群自然棲息地，對其生存至關重要^[30]。我國對于瀕危野生動物的關注度不斷增加，相關疫病監測和針對性防控技術研究不斷深入，給類似疫病防控帶來福音，有利于延續大象這個物種。宏基因組測序分析技術用于對珍稀野生動物的疫病調查和疑難病的快速診斷上，具有十分明顯的優勢，無論其病因是細菌、病毒，還是真菌、寄生蟲等均具有較高的檢測率，有望成為瀕危珍稀野生動物的保護和流行病學調查的有力工具。

5 結 論

本病例中導致大象死亡的原因可能是象親內皮皰疹病毒感染。宏基因組技術在對大象病料檢測中表現出了快速、準確和廣譜的特點，在大象等瀕危珍稀野生動物疫病的快速診斷中具有良好的應用前景。

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（編輯 白永平）