一例海豚源典型異尖線蟲形態觀察和分子鑒定

摘 要：旨在鑒定由海豚糞便樣本中所分離所得線蟲種類。首先對所分離蟲體進行形態觀察，然后提取蟲體基因組DNA，并對樣本28S rRNA D2-D3基因和ITS基因片段進行PCR擴增，以進行分子生物學鑒定。所得序列經BLAST比對并用鄰接法構建系統進化樹對所得序列進行分析。結果顯示：蟲體長120～140mm，整體呈圓柱形，兩端尖細，外觀呈乳白色半透明，鏡下觀察其內部偏黃。可見食道前端細，向后逐漸膨大。PCR結果顯示，28S rRNA D2-D3基因與ITS基因擴增長度分別為797和840bp。BLAST比對結果顯示：28S rRNA D2-D3基因（GenBank登錄號OR345165）與已報道典型異尖線蟲（Anisakis typical，GenBank登錄號HF911524.1）的序列一致性為95.36％；ITS基因（GenBank登錄號OR345164）與典型異尖線蟲（GenBank登錄號MF668919.1）一致性為97.11%，其中，ITS-1區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號MF668919.1）一致性為91.90%，ITS-2區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號JN968938.1）一致性為94.97%，5.8S rRNA區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號OQ244221.1）一致性為100.00%。基于ITS基因和28S rRNA D2-D3基因的系統發育分析結果顯示，此次研究分離所得寄生蟲樣本與典型異尖線蟲遺傳距離最近，且同一分支上。本次分離所得寄生蟲樣本經過分子鑒定為典型異尖線蟲。同源性分析結果顯示，其與典型異尖線蟲一致性均大于95%；同時，在28S rRNA D2-D3基因序列和ITS基因序列的系統發育分析方面，均與已報道的典型異尖線蟲遺傳距離最近。

關鍵詞：異尖線蟲；人畜共患病；形態學觀察；分子鑒定；系統進化樹

中圖分類號：S852.731; S858.93

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2599-08

收稿日期：2023-09-20

基金項目：安徽省自然科學基金青年項目（2008085QC136）

作者簡介：朱昊天（1999-），男，安徽淮南人，碩士生，主要從事寄生蟲與寄生蟲病方向研究，E-mail：sirius41852@163.com

*通信作者：徐前明，主要從事動物寄生蟲與寄生蟲病方向研究，E-mail：xuqianming2006@163.com

Morphological Observation and Molecular Characterization of"Anisakis Derived from Dolphin

ZHUHaotian¹，LIULuyao¹，YANGCongshan¹，JIANGJi¹，SHIHan¹，LIUXiaoxiao¹，CHEN Muxin²，XUQianming^1*

（1.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei230036，"China; 2.Key Laboratory of Parasitic Pathogens and Vector Biology of the National Health"Commission（Institute of Parasitic Diseases Prevention and Control of the Chinese Center for"Disease Control and Prevention），Institute of Parasitic Diseases Prevention and Control of"the Chinese Center for Disease Control and Prevention（National Tropical Disease"Research Center），Shanghai200025，China）

Abstract：In order to identify the species of nematodes isolated from dolphin fecal samples，the morphology of the isolated nematodes is first identified.The parasite′s body length was observed to be120-140mm long，with acylindrical shape and slender ends.Its appearance was milky white and translucent，and its internal structure was observed to be yellowish under the microscope.It can be seen that the front end of the esophagus is thin and gradually expands backwards.We extracted the genomic DNA of the isolated worm and amplified the28S rRNA D2-D3gene and ITS gene fragments by PCR for molecular identification.The PCR results showed that the amplification products of the28S rRNA D2-D3gene and ITS gene were797and840bp，respectively.BLAST alignment results showed that the sequence similarity between the28S rRNA D2-D3gene（GenBank accession number OR345165）and the Anisakis typical（GenBank accession number HF911524.1）was95.36%.The sequence similarity between the ITS gene（GenBank accession number OR345164）and the Anisakis typical（GenBank accession number MF668919.1）was97.11%，with a91.90%sequence identity between the ITS-1region and the Anisakis typical（GenBank accession number MF668919.1）.There is a94.97%sequence identity between the ITS-2region and the Anisakis typical（GenBank accession number JN968938.1）and a100.00%sequence identity between the5.8S rRNA region and the Anisakis typical（GenBank accession number OQ244221.1）.Phylogenetic analyses based on the ITS gene and the28S rRNA D2-D3gene showed that the parasite samples isolated in this study were genetically closest to the Anisakis typical，and on the same branch.In summary，the isolated parasite samples obtained from this study should be the larvae of Anisakis typical based on microscopic examination and molecular analysis.

Key words：Anisakis; zoonosis; morphological observation; molecular identification; phylogenetic tree

*Corresponding author：XU Qianming，E-mail：xuqianming2006@163.com

異尖線蟲（Anisakis spp.）屬于蛔目異尖科，其第一中間宿主為磷蝦等小型甲殼類動物，第二中間宿主為海洋魚類及較大的甲殼類和頭足類動物，終末宿主為鯨魚、海豚和海獅等海洋哺乳動物^[1-3]。人不是異尖線蟲的適宜宿主，但幼蟲可寄生于人體消化道各部位，引起內臟幼蟲移行，即人體異尖線蟲病^[4]。人體異尖線蟲病為食源性寄生蟲病，主要通過食用某些含有異尖線蟲第三期幼蟲的海魚而感染，可引起腹痛、腹瀉并伴有惡心、嘔吐等癥狀，嚴重時在體內多處組織器官內形成腫瘤腫物^[5-6]。目前，已報道可引起人體異尖線蟲病的蟲種主要有5屬：即異尖線蟲屬、鉆線蟲屬、鮪蛔線蟲屬、海豹線蟲屬和對盲囊線蟲屬^[7-9]。隨著異尖線蟲對海洋生物感染率的不斷上升以及鮮食生魚（刺身、壽司等）的飲食文化興起，異尖線蟲病已經成為一種非常重要的人獸共患寄生蟲病，不僅對人體健康造成嚴重威脅，還給水產養殖產業帶來重大損失，已被我國農業農村部會同海關總署組織修訂的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》列為二類傳染病、寄生蟲病。

據近幾年的報道，在我國江蘇省沿海地區海域異尖線蟲幼蟲感染率為64.0%^[10]；福建省沿海魚類異尖線蟲幼蟲感染率為34.20%^[7]；遼寧省鮮活海魚中異尖線蟲感染率為20.04%^[8]。由此可見，異尖線蟲的危害是不可忽視的，尤其是在選擇食用海產品（魷魚、小黃魚、帶魚等）時，必須經過完全烹煮后再食用。

本文主要對一例由海豚糞便中進行系統鑒定，進而采用分子分類法加以確定其種屬關系，且初步鑒定其為典型異尖線蟲，這為異尖線蟲病的診斷和鑒定提供了借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒（Blood DNAamp;Tissue kit）購自德國Qiagen公司，PCR預混液購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 蟲體來源

蟲體樣本來源于江蘇省南京市紅山動物園一只2歲雌性寬吻海豚經驅蟲后排泄出的糞便樣，其日常喂飼以常見雜魚為主。

1.3 蟲體觀察

直接從海豚糞便中挑取出蟲體，經PBS緩沖液（pH7.2）漂洗3次，主要觀察蟲體整體形狀即結構，包括胃、腸、尾等。

1.4 蟲體基因組DNA提取

將分離所得蟲體置500μL組織裂解液進行充分研磨，加入蛋白酶K消化5min，依照基因組DNA提取試劑盒說明書提取蟲體基因組DNA，-20 ℃下保存、備用。

1.5 引物設計

參照文獻[11-12]設計并合成擴增線蟲28S rRNA中D2-D3基因序列和rRNA內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，，ITS1、ITS2）（包括ITS-1和ITS-2）基因引物。引物序列詳見表1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.6 PCR擴增目的基因

將提取所得DNA作為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（20μL）：2×PCR預混液10μL，ddH₂O8μL，分別添加上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL。PCR反應條件：95℃3min；94℃25s，56℃25s，72℃20s，共35個循環；72℃5min。取5μL PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.7 同源性分析和遺傳系統發育分析

在GenBank中檢索不同種線蟲ITS基因進行序列比對分析，并對28 S rRNA基因（GenBank登錄號OR345165）和ITS基因（GenBank登錄號OR345164）測序結果進行相應分析。使用MEGA11.0軟件以最大似然法（Maximal likelihood）構建系統進化樹，自展值重復1000次，分析蟲體親緣關系。

1.8 動物倫理批準和患者知情同意

本研究獲得安徽農業大學動物倫理委員會的批準（批準號為AHAUB001），符合動物福利倫理要求，不涉及患者知情同意。

2 結 果

2.1 蟲體觀察

在海豚源性糞便樣本中發現并分離出3條蟲體樣本，蟲體長12～14mm，整體呈圓柱形，兩端尖細，外觀呈乳白色半透明，鏡下觀察其內部結構偏黃。可見食道前端細，向后逐漸膨大（圖1）。根據Jabber等^[13]以及文茜^[14]關于異尖線蟲幼蟲的研究以及描述，且未見明顯分化雌雄器官且蟲體長度較短，初步鑒定該寄生蟲為異尖線蟲幼蟲，后續以便進一步開展分子學鑒定。

2.2 PCR擴增結果

PCR擴增28S rRNA D2-D3基因以及ITS基因片段大小分別為797和840bp（圖2），與預期結果相一致。

2.3 序列分析

通過BLAST分析28S rRNA D2-D3基因測序結果，可知本次分離所得樣本該基因與典型異尖線蟲（Anisakis typica，GenBank登錄號HF911 524.1）一致性為95.36%。

根據蘆亞君等^[15]的研究，以及通過在GenBank中檢索不同種線蟲ITS基因序列并進行對比分析可知，不同種類線蟲之間ITS基因長度差距明顯，見表2。相同地，不同種類異尖線蟲之間ITS基因長度同樣存在差異，見表3。以典型異尖線蟲（GenBank登錄號HF911 524.1）作為參照物，分析出ITS基因840bp序列中含有18S rRNA14bp，ITS-1307bp，5.8S rRNA158bp，ITS-2288bp，28S rRNA73bp。通過BLAST分析后，可知ITS基因序列（包括ITS-1、ITS-2）整體上與典型異尖線蟲（GenBank登錄號MF668 919.1）一致性為97.11%；其中ITS-1區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號MF668 919.1）一致性為91.90%；ITS-2區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號JN968 938.1）一致性為94.97%；5.8 S rRNA區域與典型異尖線蟲（GenBank登錄號OQ244 221.1）一致性為100.00%。

2.4 系統發育分析

基于ITS基因構建的系統進化樹顯示，本次分離所得樣本與典型異尖線蟲（Anisakis typica，GenBank登錄號KY352 230.1）遺傳距離相近，且在同一分支上（圖3），自展值為99%。

分支下方數字為自展值基于28S rRNA D2-D3基因所構建的系統進化樹顯示，本研究分離的線蟲與典型異尖線蟲（Anisakis typica，GenBank登錄號ON117 607.1）遺傳距離最近，且在同一分支上，自展值為100%（圖4）。

3 討 論

異尖線蟲傳統分類中普遍所采用的形態學依據主要有：頭端結構，口、唇、鉆齒和乳突的形狀；食道特征；排泄孔位置；胃和腸；尾端等^[9]。但是通過形態學特征對異尖線蟲進行分類鑒定，卻不是最理想的辦法。因為異尖線蟲的幼蟲在宿主體內處于不同的發育時期，形態和結構上也存在很大的差異^[16-17]；此外，還會因一些外界因素，如宿主遷徙、季節等對其生殖器官的發育帶來一定的影響^[18-19]。因而對異尖線蟲的鑒定與分類，使用傳統形態學方法僅能停留在科或屬以上，而對于屬內各種間異尖線蟲的分類鑒定存在很大的困難，特別是對于一些隱藏種、復合種和姊妹種。

近年來隨著生物分子學技術的發展，越來越多的分子技術被運用到線蟲的鑒定與分類學上。如Orecchia等^[20]通過多位點等位酶電泳技術，首次證實了采自于地中海和東北大西洋海域大的簡單異刺線蟲（A.simliex）為復合種；Timi等^[21]用rDNA的ITS-1、ITS-2和mtDNA的cox2基因分別設計引物，建立了用于鑒別偽地新線蟲屬的PCR方法，用該方法結合測序和進化樹分析首次證明西南大西洋海域的海魚寄生偽地新線蟲屬第三期幼蟲。由此可見，分子方法對于物種的精確鑒定是不可或缺的。故對于本次采集的樣本進行PCR擴增28S rRNA基因及ITS基因，通過同源性及系統發育分析對其進行鑒定。

本次研究利用分子生物學相關技術同時對分離所得樣本ITS基因和28S rRNA D2-D3基因進行了分析，為異尖線蟲分子生物學鑒定方法提供了參考，同時為我國海豚源性異尖線蟲蟲種分類豐富了案例。

4 結 論

對分離所得樣本ITS基因和28S rRNA D2-D3基因進行PCR擴增，得到與預期相符合的目的條帶，并通過同源性分析和構建系統進化樹進行分子鑒定。綜合分析結果表明，ITS基因，即ITS-1區域和ITS-2區域，與典型異尖線蟲一致性分別為91.90%和94.97%，其中5.8S rRNA區域與典型異尖線蟲一致性為100%；28S rRNA基因與典型異尖線蟲一致性為95.36%。同時結合系統發育分析結果，分離樣本ITS基因與28S rRNA基因與典型異尖線蟲親緣關系最為接近，由此可初步鑒定分離所得樣本為典型異尖線蟲。

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（編輯 白永平）