細粒棘球絳蟲膜聯蛋白B5、B15和B25的原核表達和分泌特性分析

摘 要：旨在探討細粒棘球絳蟲膜聯蛋白B5、B15和B25的反應原性及其在中間宿主組織中的分泌特性，為進一步研究細粒棘球絳蟲膜聯蛋白與中間宿主的相互作用奠定基礎。作者提取細粒棘球蚴原頭蚴的總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增獲得EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25基因全長編碼序列，使用同源重組法構建pET32a-EgANXB5、pET32a-EgANXB15和pET32a-EgANXB25質粒并進行重組蛋白的原核表達，應用蛋白免疫印跡對上述重組蛋白進行鑒定，并采用免疫熒光染色試驗分析EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25在中間宿主組織中的分泌特性。結果顯示：本研究成功克隆并表達出重組EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25，并更正了EgANXB25的CDS序列（GenBank：OR245515.1）。蛋白免疫印跡結果顯示，這3種蛋白均能夠被感染細粒棘球絳蟲的犬陽性血清和感染細粒棘球蚴的小鼠陽性血清所識別。同時，免疫熒光染色結果顯示，在細粒棘球蚴包囊附近的肝實質組織中可以檢測到EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的陽性信號。EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25具有良好的反應原性，同時它們具有分泌進入包囊周圍肝實質組織中的潛能，可能進一步參與細粒棘球蚴與宿主的相互作用。

關鍵詞：細粒棘球絳蟲；膜聯蛋白；原核表達；反應原性；分泌特性

中圖分類號：S852.734

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2607-12

收稿日期：2023-10-12

基金項目：四川省重點研發項目（2022YFN0013）

作者簡介：陳延鑫（1999-），男，四川峨眉人，碩士，主要從事動物包蟲病研究，E-mail：chenyx1028@163.com

*通信作者：楊光友，主要從事動物包蟲病研究，E-mail：guangyou1963@126.com；陽愛國，主要從事動物包蟲病研究，E-mail：aiguoyang163@163.com

Prokaryotic Expression and Secretion Characterization of Annexin B5，B15，

and B25from Echinococcus granulosus

CHENYanxin¹，HUARuiqi¹，SHAOGuoqing¹，ZHUXiaowei¹，HOUWei²，

LIShengqiong²，YANGAiguo^2*，YANGGuangyou^1*

（1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu611130，China;

2.Sichuan Center for Animal Disease Prevention and Control，Chengdu610000，China）

Abstract：This study aims to investigate the immunoreactivity and secretion characteristics of the Echinococcus granulosus（E.granulosus）annexin B5，B15，and B25in the intermediate host tissues，laying the foundation for further research on the interaction between annexin and hosts.In this study，total RNA was extracted from the protoscolex of E.granulosus，and then reverse transcribed into cDNA.The full-length coding sequences of EgANXB5，EgANXB15，and EgANXB25genes were amplified by PCR using the cDNA as atemplate.The recombinant plasmids pET32a-EgANXB5，pET32a-EgANXB15，and pET32a-EgANXB25were constructed using homologous recombination method，and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli.The immunoreactivity of these recombinant proteins was analyzed using Western blotting，and their secretion in the intermediate host tissues was examined by immunofluorescence staining.The recombinant EgANXB5，EgANXB15，and EgANXB25were successfully cloned and expressed.The coding sequence（CDS）of EgANXB25was corrected（GenBank：OR245515.1）.These three proteins could be specifically recognized by positive canine sera for E.granulosus and positive mouse sera for E.granulosus，indicating that they had strong immunoreactivity.Moreover，immunofluorescence staining revealed that EgANXB5，EgANXB15，and EgANXB25were primarily distributed in the liver parenchyma near the E.granulosus cyst.Recombinant EgANXB5，EgANXB15，and EgANXB25exhibite strong immunoreactivity and these proteins have the potential to secrete into the hepatic parenchymal tissue surrounding the cyst，possibly further participating in the interaction between E.granulosus and their host.

Key words：Echinococcus granulosus; annexin; prokaryotic expression; immunoreactivity; secretion characterization

*Corresponding authors：YANG Guangyou，E-mail：guangyou1963@126.com；YANG Aiguo，E-mail：aiguoyang163@163.com

囊型棘球蚴病（Cystic echinococcosis，CE），是由帶科（Taeniidae）、棘球屬（Echinococcus）的細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus sensu lato，E.granulosus s.l）的中絳期幼蟲寄生于中間宿主（家畜和野生動物等多種哺乳動物以及人）體內引起的一種人獸共患病^[1]。棘球蚴病被世界衛生組織（WHO）列為被忽視的熱帶病，同時動物棘球蚴病也被世界動物衛生組織（WOAH）列為B類需申報動物疫病^[2]。囊型棘球蚴病是一種廣泛傳播的寄生蟲病，對人類健康和社會經濟造成了巨大的危害^[3]。該病在北美（西北部）、南美（西南部）、地中海地區、東非、中亞等地區呈高度流行^[1，4]，在我國的新疆、西藏、青海和四川等省（自治區）流行最為嚴重^[5-7]。

細粒棘球絳蟲需要中間宿主和終末宿主才能完成其生活史，并進化出了復雜的免疫逃避機制^[8]。細粒棘球蚴在中間宿主體內可以形成難以被宿主免疫系統所清除的包囊^[9]，因此研究細粒棘球蚴和其宿主之間的相互作用的分子機制對包蟲病的防控與診療具有重要意義。膜聯蛋白（annexin，ANX）屬于Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白家族，從原生生物到高級真核生物均有分布^[10]。ANX結構保守、種類繁多、功能多樣，廣泛參與細胞內和細胞間的生物過程，其中大部分與磷脂結合的能力直接相關，例如：膜的修復^[11-12]、膜轉運^[13-14]、細胞骨架運動^[15]、細胞增殖與分化^[16]、抗炎和抗凝血^[17]、細胞信號轉導等^[18]。研究發現，豬帶絳蟲（Taenia solium，Ts）和華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis，Cs）的ANX可以調節宿主免疫反應，參與寄生蟲的免疫逃避^[19-21]。組學研究表明，細粒棘球絳蟲的數種膜聯蛋白（E.granulosus annexin proteins，EgANXs）存在于包囊囊液的細胞外囊泡和原頭蚴分泌的細胞外囊泡中^[22-25]，這些EgANXs可能會通過細胞外囊泡途徑分泌到宿主組織內，從而發揮對宿主的調節作用。本研究團隊前期已證實EgANXB3、EgANXB18、EgANXB20、EgANXB33和EgANXB38能夠分泌進入宿主肝實質組織中，并初步探明其可能參與了寄生蟲的免疫逃避^[26-28]。

目前在細粒棘球絳蟲中已鑒定出13個膜聯蛋白基因^[29-30]，其中EgANXB3、EgANXB18、EgANXB20、EgANXB33和EgANXB38已有研究報道^[26-28]，但尚未見有關EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的相關研究報道。為此，本研究首次對EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25基因進行了原核表達、重組蛋白反應原性和蛋白分泌特性分析，以期為深入研究細粒棘球絳蟲膜聯蛋白與中間宿主的相互作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物倫理申明

本研究涉及的動物實驗得到四川農業大學動物倫理委員會的審查和批準，所有相關試驗動物的所有程序嚴格按照“四川農業大學動物倫理委員會實驗動物護理指南”（SYXK2019-187；中國成都）實施。本研究中使用的動物程序均參照《實驗動物的護理和使用指南》（美國馬里蘭州貝塞斯達的國家研究委員會）和ARRIVE指南的建議進行。所有方法均按照相關指南和規定進行。

1.2 實驗材料與試劑

細粒棘球蚴原頭蚴（G1基因型）和感染細粒棘球蚴（G1基因型）的綿羊肝組織切片由四川農業大學動物寄生蟲病研究中心提供。感染細粒棘球絳蟲（G1基因型）的犬陽性血清來自本實驗室人工感染細粒棘球絳蟲（G1基因型）的試驗犬（攻蟲數量為70000個，人工感染28d后解剖，收集分節蟲體經形態學觀察確認成功感染）；犬陰性血清來自健康的試驗犬。感染細粒棘球蚴（G1基因型）的小鼠陽性血清和健康小鼠陰性血清由本實驗室提供。

6周齡SPF級SD雌性大鼠，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司；HRP-兔抗犬IgG購自索萊寶科技（北京）有限公司；HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）和HRP-山羊抗大鼠IgG（H+L）購自愛博泰克生物科技（武漢）有限公司；山羊抗大鼠IgG（FITC，H+L）購自美國Invitrogen公司。

動物組織總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA Marker、通用型DNA純化回收試劑盒、大腸埃希菌BL21（DE3）、DH5α感受態細胞和增強型DAB顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；第一鏈cDNA合成預混體系Master Premix購自福際生物技術（成都）有限公司；PrimeSTAR Max Premix、pET-32a質粒購于寶生物工程（大連）有限公司；Uniclone One Step Seamless Cloning Kit購自金沙生物科技（北京）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和弗氏（不）完全佐劑購自美國SIGMA公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術（上海）有限公司；酶標板購自美國Corning公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自索萊寶科技（北京）有限公司；HisTrap HP親和層析柱購自美國Cytiva公司。

1.3 細粒棘球絳蟲總RNA提取和cDNA的合成

參照動物組織總RNA提取試劑盒說明書，提取細粒棘球蚴原頭蚴總RNA。以所提取的原頭蚴總RNA為模板，參照第一鏈cDNA合成預混體系Master Premix說明書將提取的原頭蚴總RNA反轉錄為cDNA，-20℃保存備用。

1.4 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的克隆和表達載體構建

參考WormBase ParaSite數據庫中細粒棘球絳蟲EgANXB5（Gene ID：EgrG_000111500）、EgANXB15（Gene ID：EgrG_000243700）和EgANXB25（Gene ID：EgrG_000243800）的CDS序列，使用在線軟件CE Design（https：∥crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html）設計同源臂引物，引物序列信息如表1所示，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。以“1.3”中的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（20μL）：PrimeSTAR Max Premix（2×）10μL，超純水7μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL。PCR反應程序：98℃預變性3min；98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，共35個循環；72℃延伸5min，4℃保存。擴增產物經10g·L^-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定，參照通用型DNA純化回收試劑盒說明書對目的條帶進行切膠回收。參照Uniclone One Step Seamless Cloning Kit說明書將膠回收產物與pET-32a（+）載體進行同源重組，將同源重組得到的pET-32a-EgANXB5、pET-32a-EgANXB15和pET-32a-EgANXB25重組質粒分別轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，菌液涂板過夜，挑取單個菌落進行菌液PCR鑒定，將菌液PCR鑒定為陽性的菌落擴大培養后，使用質粒小提試劑盒提取質粒，使用限制性內切酶BamHⅠ和SacⅠ對重組質粒進行雙酶切鑒定，經雙酶切鑒定正確的質粒送至北京擎科生物科技股份有限公司測序。使用DNAMAN軟件將測序結果與對應的參考序列進行比對，若比對結果有誤，則重復上述試驗步驟，直至確定最終序列。

1.5 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的信號肽和鈣離子結合位點預測

使用在線軟件SignalP-6.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）預測EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的信號肽，使用在線軟件SWISS-MODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/interactive）預測EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25三級結構中的鈣離子結合位點。

1.6 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的原核表達

將測序正確的pET-32a（+）-EgANXB5、pET-32a（+）-EgANXB15和pET-32a（+）-EgANXB25重組質粒分別轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，菌液涂板過夜，挑取單個菌落進行菌液PCR鑒定。鑒定為陽性的菌落震蕩培養至菌液OD_600nm約為0.6時，加入終濃度為1mmol·L^-1的IPTG于37℃誘導表達12h，菌液經9000r·min^-1離心10min收集菌體，加入15mL的50mmol·L^-1Tris-HCl（pH=6.8）重懸菌體沉淀，超聲破碎菌體，離心收集上清液，再加8mol·L^-1尿素重懸沉淀后再次離心收集上清液。經12%SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍染色，分析蛋白表達情況。將可溶性表達的蛋白溶液使用0.45μm和0.22μm濾膜過濾后，使用HisTrap HP親和層析柱對rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25進行純化。

1.7 蛋白免疫印跡

純化后的rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25重組蛋白經12%SDS-PAGE電泳后，電轉至PVDF膜上，分別以感染細粒棘球絳蟲的犬陽性血清（1∶100稀釋）和感染細粒棘球蚴的小鼠陽性血清（1∶100稀釋）為試驗組的一抗，分別以健康犬陰性血清（1∶100稀釋）和健康小鼠陰性血清（1∶100稀釋）對照組的一抗，4℃孵育過夜，分別以HRP-兔抗犬IgG（1∶1000稀釋）和HRP-羊抗小鼠IgG（1∶5000稀釋）為二抗室溫孵育2h，使用DAB顯色試劑盒或超敏ECL化學發光試劑盒顯色，分析rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25的反應原性。

1.8 大鼠抗rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25高免血清的制備

分別將純化后的rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25和等體積弗氏（不）完全佐劑混合，超聲乳化，對SD大鼠進行免疫，免疫程序如表2所示。四免結束后第7天對大鼠進行斷尾采血，分離析出的血清。

1.9 間接ELISA

分別將純化后的rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25（50μg·孔^-1）在酶標板中4℃包被過夜，5%脫脂牛奶37℃封閉2h。陰性對照組以大鼠陰性血清（1∶100稀釋）為一抗，各試驗組分別以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600稀釋的大鼠陽性血清為一抗37℃孵育1h，以HRP-山羊抗大鼠IgG（H+L）（1∶10000稀釋）為二抗37℃孵育1h，每孔加入100μL TMB底物溶液避光顯色20min后，加入100μL終止液（2mol·L^-1H₂SO₄）并使用酶標儀檢測紫外波長450nm處的吸光度值，檢測大鼠陽性血清效價。效價判定標準：試驗孔OD值/對照孔OD值＞2.1即為陽性反應，陽性反應的最大稀釋度為待測血清效價。

1.10 蘇木精-伊紅染色和免疫熒光染色

取感染細粒棘球蚴的綿羊肝組織切片，參考文獻[31]中的方法進行蘇木精-伊紅（HE）染色。同時，取相同部位的切片，分別以大鼠抗rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25高免血清為一抗，山羊抗大鼠IgG（FITC，H+L）為二抗，參照文獻[26-27]中的方法進行免疫熒光染色。分析EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25是否能被分泌進入中間宿主（綿羊）肝組織中。

2 結 果

2.1 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的克隆和表達載體構建

PCR擴增產物經瓊脂糖電泳結果顯示，EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的產物片段大小均在1000bp左右，與預期相符（圖1）。使用同源重組法成功構建出pET-32a-EgANXB5、pET-32a-EgANXB15和pET-32a-EgANXB25重組質粒，重組質粒經雙酶切鑒定驗證（圖2），測序結果（圖3）顯示：EgANXB5（978bp）和EgANXB15（969bp）的克隆測序結果與WormBase ParaSite數據庫中的參考序列完全一致，而EgANXB25的克隆測序結果（984bp）比WormBase ParaSite數據庫中EgANXB25的參考序列（Gene ID：EgrG_000243800，963bp）多出21bp的片段（834位～854位），編碼的蛋白會比預計多7個氨基酸。本研究團隊向NCBI數據庫上傳了本次克隆測序得到的EgANXB25的CDS序列（GenBank登錄號：OR245 515.1）。

2.2 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的信號肽分析和鈣離子結合位點分析

SignalP-6.0預測結果顯示，EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25均無信號肽。SWISS-MODEL預測結果顯示EgANXB5和EgANXB15有一個Ca²⁺結合位點，EgANXB25有兩個Ca²⁺結合位點（圖4）。

2.3 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的原核表達、可溶性分析和純化

SDS-PAGE結果（圖1）顯示：rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25相對分子質量大小在50ku左右，符合預期。其中，rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25均大部分為可溶性表達，少量表達在包涵體，可溶性表達的重組蛋白經純化后條帶單一，表達量較高。

2.4 rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25的反應原性

蛋白免疫印跡結果顯示rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25均能被感染細粒棘球絳蟲的犬陽性血清和感染細粒棘球蚴的小鼠陽性血清識別，反應條帶均在50ku左右，且與健康犬陰性血清和健康小鼠陰性血清無反應條帶（圖1）。試驗結果表明：rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25具有良好的反應原性。

2.5 大鼠高免血清的抗體效價

間接ELISA結果（圖5）顯示，制備的大鼠抗rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25的高免血清抗體效價均大于1∶25600，提示抗體效價較高，可用于后續試驗。

2.6 EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25在中間宿主組織中的分泌特性

HE染色結果顯示，在包囊外膜層附近的肝實質組織處存在大量炎性細胞浸潤（圖6）。免疫熒光染色結果顯示，該處可以檢測到EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的陽性信號（綠色熒光），而陰性對照無陽性信號（圖6），表明EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25具有分泌進入肝實質組織中的潛能。

3 討 論

本研究所得的EgANXB25克隆測序結果與二代轉錄測序得到的參考序列不一致，可能是由于二代轉錄組測序中PCR擴增后的DNA會發生相對頻率和豐度的改變且該技術難以檢測變異的堿基，從而影響了測序結果的準確性^[32]。此外，對于待測對象而言，轉錄本剪接、基因組重復區域和低表達轉錄本等原因也會造成轉錄組測序結果的偏差^[33-34]。細粒棘球絳蟲有多個發育階段，完成生活史需要中間宿主和終末宿主，因其長期進化產生的免疫逃避機制，在不同宿主和不同發育階段時細粒棘球絳蟲的基因或抗原可能具有多態性或差異表達性^[35-37]，更容易導致轉錄組測序準確度下降。

早期研究認為膜聯蛋白缺乏信號肽，僅在細胞內參與一系列Ca²⁺依賴性的膜相關過程^[38]。然而，近年來的研究發現部分寄生蟲的膜聯蛋白具有分泌功能，在細胞外發揮多種生理學作用，參與寄生蟲與宿主的相互作用。例如：豬帶絳蟲膜聯蛋白B1（TsANXB1）作為分泌蛋白可以抑制哺乳動物磷脂酶A2活性^[19]，促進人嗜酸性粒細胞凋亡^[20]，從而抑制宿主炎癥反應；華支睪吸蟲膜聯蛋白B30（CsANXB30）作為分泌蛋白^[21]，能與人（終末宿主）纖溶酶原結合并產生纖溶酶^[39]，有利于蟲體在人肝膽管中的存活。在肝片吸蟲（Fasciola hepatica）、麝貓后睪吸蟲（Opisthorchis viverrini）、華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）、日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）和曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）中也發現了ANXB5^[29]，但只有華支睪吸蟲膜聯蛋白CsANXB5有深入研究，CsANXB5雖然不是排泄/分泌蛋白，但卻是被膜蛋白，可直接接觸宿主組織參與寄生蟲和宿主的相互作用^[39]；而其他寄生蟲中尚無以ANXB15和ANXB25命名的的膜聯蛋白，只有多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis，Em）中有兩個未命名的膜聯蛋白EmANX（GenBank：CDI98 573.1）和EmANX（GenBank：CDI98 573.1）分別與EgANXB15和EgANXB25的序列相似度較高^[40]，推測是因為細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲在進化上有著較為密切的關系，而與其他寄生蟲的進化方向不同，導致ANXB15和ANXB25是細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲特有的蛋白，在細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的生活史中，推測兩種蛋白可能發揮著特定的功能。

細粒棘球絳蟲的膜聯蛋白家族成員中EgANXB3、EgANXB33、EgANXB38在細粒棘球蚴寄生于中間宿主階段時可以分泌至包囊外進入中間宿主肝組織中，可能參與寄生蟲對中間宿主的免疫調控^[26-27]；同時，細粒棘球絳蟲的細胞外囊泡的組學研究中發現原頭蚴體外培養上清和包囊液中的細胞外囊泡中也發現多種EgANXs^[41-42]，這些EgANXs也可能分泌進入宿主組織并參與到寄生蟲與中間宿主的相互作用中。EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25均無信號肽，無法通過經典分泌途徑分泌。目前對細粒棘球絳蟲的細胞外囊泡研究表明：EgANXB15存在于囊液的細胞外囊泡^[43]和原頭蚴所分泌的細胞外囊泡中^[23]，它可能通過細胞外囊泡途徑分泌，但尚未發現EgANXB5和EgANXB25可通過細胞外囊泡分泌的證據。在本研究中，EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25可與感染細粒棘球蚴小鼠（中間宿主）的陽性血清反應，并且免疫熒光定位的結果顯示EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25均可分泌進入宿主肝組織，造成該現象的原因可能有以下幾個方面：（1）EgANXB5和EgANXB25均通過細胞外囊泡途徑分泌，但EgANXB5和EgANXB25的濃度較低或在樣品制備時容易降解，導致細胞外囊泡的蛋白質組學未能檢測到EgANXB5和EgANXB25的肽段；（2）EgANXB5和EgANXB25只在特定的某種條件下分泌，由于不同研究中所選取的試驗材料不同，結果會有差異；（3）它們的分泌依賴于細粒棘球蚴包囊與中間宿主之間存在的尚未探明的物質交換機制。細粒棘球蚴包囊的囊壁由外膜層、角質層和生發層三部分構成，是細粒棘球蚴與中間宿主之間的重要屏障。除了屏障作用外，包囊也可以進行一定程度的物質交換，有研究證實囊液中可以檢測到宿主來源的蛋白^[43]，同時蟲體的排泄/分泌產物也可以進入宿主組織內^[41]，但是中間宿主與包囊的物質交換機制尚不清晰，值得進一步探究。

4 結 論

本研究對EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25進行了基因克隆和原核表達，并更正了EgANXB25的CDS序列，rEgANXB5、rEgANXB15和rEgANXB25具有良好的反應原性，同時這3種蛋白可以分泌進入包囊周圍的肝臟實質組織中，可能進一步參與細粒棘球蚴與中間宿主的相互作用，這將有助于深入研究該相互作用，并為囊型棘球蚴病的防控與診療提供理論基礎。

參考文獻（References）：

[1]AGUDELO HIGUITA NI，BRUNETTI E，MCCLOSKEY C.Cystic echinococcosis[J].J Clin Microbiol，2016，54（3）：518-523.

[2]WEN H，VUITTON L，TUXUN T，et al.Echinococcosis：advances in the21st century[J].Clin Microbiol Rev，2019，32（2）：e00075-18.

[3]WOOLSEY ID，MILLER AL.Echinococcus granulosus sensu lato and Echinococcus multilocularis：A review[J].Res Vet Sci，2021，135：517-522.

[4]DEPLAZES P，RINALDI L，ROJAS CA A，et al.Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis[J].Adv Parasitol，2017，95：315-493.

[5]伍衛平，王 虎，王 謙，等.2012-2016年中國棘球蚴病抽樣調查分析[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2018，36（1）：1-14.

WU WP，WANG H，WANG Q，et al.A nationwide sampling survey on echinococcosis in China during2012-2016[J].Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases，2018，36（1）：1-14.（in Chinese）

[6]蕢 嫣，薛垂召，王 旭，等.2021年全國棘球蚴病防治進展[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2023，41（2）：142-148.

KUI Y，XUE CZ，WANG X，et al.Progress of echinococcosis control in China，2021[J].Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases，2023，41（2）：142-148.（in Chinese）

[7]WANG Y，ZHANG J，WANG X，et al.Molecular epidemiology and the control and prevention of cystic echinococcosis in China：what is known from current research[J].Zoonoses，2023，3（1）：976.

[8]SIRACUSANO A，DELUNARDO F，TEGGI A，et al.Cystic echinococcosis：aspects of immune response，immunopathogenesis and immune evasion from the human host[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2012，12（1）：16-23.

[9]SIRACUSANO A，DELUNARDO F，TEGGI A，et al.Host-parasite relationship in cystic echinococcosis：an evolving story[J].Clin Dev Immunol，2012，2012：639362.

[10]MOSS SE，MORGAN RO.The annexins[J].Genome Biol，2004，5（4）：219.

[11]SIMONSEN AC，BOYE TL，NYLANDSTED J.Annexins bend wound edges during plasma membrane repair[J].Curr Med Chem，2020，27（22）：3600-3610.

[12]DEMONBREUN AR，BOGDANOVIC E，VAUGHT LA，et al.A conserved annexin A6-mediated membrane repair mechanism in muscle，heart，and nerve[J].JCI Insight，2022，7（14）：e158107.

[13]LIAO YC，FERNANDOPULLE MS，WANG GZ，et al.RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport，using annexin A11as amolecular tether[J].Cell，2019，179（1）：147-164.e20.

[14]MATOS AL L，KUDRUK S，MORATZ J，et al.Membrane binding promotes annexin A2oligomerization[J].Cells，2020，9（5）：1169.

[15]BABBIN BA，PARKOS CA，MANDELL KJ，et al.Annexin2regulates intestinal epithelial cell spreading and wound closure through Rho-related signaling[J].Am JPathol，2007，170（3）：951-966.

[16]BENAUD C，LE DEZ G，MIRONOV S，et al.Annexin A2is required for the early steps of cytokinesis[J].EMBO Rep，2015，16（4）：481-489.

[17]LIM HI，HAJJAR KA.Annexin A2in fibrinolysis，inflammation and fibrosis[J].Int JMol Sci，2021，22（13）：6836.

[18]DALLACASAGRANDE V，HAJJAR KA.Annexin A2in inflammation and host defense[J].Cells，2020，9（6）：1499.

[19]GAO YJ，YAN HL，DING FX，et al.Annexin B1at the host-parasite interface of the Taenia solium cysticercus：secreted and associated with inflammatory reaction[J].Acta Trop，2007，101（3）：192-199.

[20]YAN HL，XUE G，MEI Q，et al.Calcium-dependent proapoptotic effect of Taenia solium metacestodes annexin B1on human eosinophils：a novel strategy to prevent host immune response[J].Int JBiochem Cell Biol，2008，40（10）：2151-2163.

[21]HE L，REN MY，CHEN XQ，et al.Biochemical and immunological characterization of annexin B30from Clonorchis sinensis excretory/secretory products[J].Parasitol Res，2014，113（7）：2743-2755.

[22]WU JE，CAI MT，YANG J，et al.Comparative analysis of different extracellular vesicles secreted by Echinococcus granulosus protoscoleces[J].Acta Trop，2021，213：105756.

[23]NICOLAO MC，RODRIGUES CR，CUMINO AC.Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage：isolation，characterization and uptake by dendritic cells[J].PLoS Negl Trop Dis，2019，13（1）：e0007032.

[24]MARCILLA A，TRELIS M，CORTéS A，et al.Extracellular vesicles from parasitic helminths contain specific excretory/secretory proteins and are internalized in intestinal host cells[J].PLoS One，2012，7（9）：e45974.

[25]YANG J，WU JE，FU Y，et al.Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of110K EVs on sheep PBMCs[J].Frontn Immunol，2021，12：602717.

[26]SONG XJ，HU DD，ZHONG XQ，et al.Characterization of asecretory annexin in Echinococcus granulosus[J].Am JTrop Med Hyg，2016，94（3）：626-633.

[27]SONG HY，HE X，DU XD，et al.Molecular characterization and expression analysis of annexin B3and B38as secretory proteins in Echinococcus granulosus[J].Parasit Vectors，2021，14（1）：103.

[28]HE X，SHAO GQ，DU XD，et al.Molecular characterization and functional implications on mouse peripheral blood mononuclear cells of annexin proteins from Echinococcus granulosus Sensu lato[J].Parasit Vectors，2023，16（1）：350.

[29]CANTACESSI C，SEDDON JM，MILLER TL，et al.A genome-wide analysis of annexins from parasitic organisms and their vectors[J].Sci Rep，2013，3：2893.

[30]KORHONEN PK，KINKAR L，YOUNG ND，et al.Chromosome-scale Echinococcus granulosus（genotype G1）genome reveals the Eg95gene family and conservation of the EG95-vaccine molecule[J].Commun Biol，2022，5（1）：199.

[31]艾柯代·卡得，齊文靜，田夢瀟，等.兩型棘球蚴感染早期對肝組織自噬和肝巨噬細胞極化的影響[J].中國病原生物學雜志，2023，18（10）：1169-1174.

AIKEDAI KD，QI WJ，TIAN MX，et al.Effects of early infection with Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis on autophagy and Macrophage cell polarization in liver[J].Journal of Pathogen Biology，2023，18（10）：1169-1174.（in Chinese）

[32]杜小迪，侯 巍，蘇中華，等.細粒棘球絳蟲泛素結合酶基因家族的生物信息學及表達分析[J].畜牧獸醫學報，2023，54（6）：2605-2618.

DU XD，HOU W，SU ZH，et al.Bioinformatics and expression analysis of ubiquitin-conjugating enzyme gene family of Echinococcus granulosus[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（6）：2605-2618.（in Chinese）

[33]MARTIN JA，WANG Z.Next-generation transcriptome assembly[J].Nat Rev Genet，2011，12（10）：671-682.

[34]VOSHALL A，MORIYAMA EN.Next-generation transcriptome assembly and analysis：impact of ploidy[J].Methods，2020，176：14-24.

[35]SIRACUSANO A，RIGANò R，ORTONA E，et al.Immunomodulatory mechanisms during Echinococcus granulosus infection[J].Exp Parasitol，2008，119（4）：483-489.

[36]ZHANG WB，LI J，MCMANUS DP.Concepts in immunology and diagnosis of hydatid disease[J].Clin Microbiol Rev，2003，16（1）：18-36.

[37]AMNI F，HAJIZADEH M，ELMI T，et al.Different manifestation of Echinococcus granulosus immunogenic antigens in the liver and lungs of intermediate host[J].Comparat Immunol Microbiol Infect Dis，2021，74：101573.

[38]RESCHER U，GERKE V.Annexins-unique membrane binding proteins with diverse functions[J].J Cell Sci，2004，117（13）：2631-2639.

[39]SHI YL，YU K，LIANG AL，et al.Identification and analysis of the tegument protein and excretory-secretory products of the carcinogenic liver fluke Clonorchis sinensis[J].Front Microbiol，2020，11：555730.

[40]TSAI IJ，ZAROWIECKI M，HOLROYD N，et al.The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism[J].Nature，2013，496（7443）：57-63.

[41]SANTOS GB D，MONTEIRO KM，DA SILVA ED，et al.Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode：is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite？[J].Int JParasitol，2016，46（13/14）：843-856.

[42]SILES-LUCAS M，SáNCHEZ-OVEJERO C，GONZáLEZ-SáNCHEZ M，et al.Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts[J].Vet Parasitol，2017，236：22-33.

[43]ZHOU XJ，WANG W，CUI F，et al.Extracellular vesicles derived from Echinococcus granulosus hydatid cyst fluid from patients：isolation，characterization and evaluation of immunomodulatory functions on Tcells[J].Int JParasitol，2019，49（13/14）：1029-1037.

（編輯 白永平）