敲低多房棘球蚴let-7-5p可抑制BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化和蟲體生長

摘 要：旨在明確敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化和蟲體生長的影響。構(gòu)建表達(dá)多房棘球蚴emu-let-7-5p海綿序列的重組腺相關(guān)病毒載體，并在293T細(xì)胞上驗(yàn)證其抑制效果和特異性。70只清潔級BALB/c小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射AAV8-si-let-7-5p、AAV8-control和PBS后兩周，每組隨機(jī)選取2只小鼠分別用Western blot和qRT-PCR分析肝組織中GFP、let-7-5p及其靶基因C/EBP δ的表達(dá)。隨后，所有小鼠每只腹腔接種1000個(gè)原頭蚴，3個(gè)月后qRT-PCR檢測腹腔巨噬細(xì)胞emu-let-7-5p、C/EBP δ、M1型（IL-1β、iNOS和IL-6）和M2型（Arg-1、IL-4和IL-10）相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平，并統(tǒng)計(jì)各組小鼠多房棘球蚴的包囊重量和原頭蚴數(shù)量。結(jié)果表明，注射后第15天，AAV8-si-let-7-5p成功靶向小鼠肝臟，并引起emu-let-7-5p的敲低和C/EBP δ的上調(diào)表達(dá)。感染后3個(gè)月，AAV8-si-let-7-5p組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞emu-let-7-5p和M2型相關(guān)分子Arg-1均顯著下調(diào)，而C/EBP δ和M1型相關(guān)分子IL-1β和iNOS均顯著上調(diào)。此外，AAV8-si-let-7-5p組IL-4和IL-6下調(diào)表達(dá)，而IL-10上調(diào)表達(dá)，且小鼠肝臟包囊重量和原頭蚴數(shù)量顯著低于對照組。敲低多房棘球蚴感染小鼠體內(nèi)emu-let-7-5p，可促進(jìn)C/EBP δ的表達(dá)，進(jìn)而抑制M2型極化和蟲體生長。

關(guān)鍵詞：多房棘球蚴；emu-let-7-5p；腹腔巨噬細(xì)胞極化；蟲體生長

中圖分類號：S852.734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2619-10

收稿日期：2023-09-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32072889）

作者簡介：王立群（1994-），女，甘肅成縣人，博士生，主要從事病原與宿主相互作用研究，E-mail：wlq1282690114@163.com；吳易璇（1999-），女，甘肅蘭州人，碩士生，主要從事病原與宿主相互作用研究，E-mail：wyx2211591074@163.com。王立群和吳易璇為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：駱學(xué)農(nóng)，主要從事人獸共患病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究，E-mail：luoxuenong@caas.cn

Knockdown of let-7-5p from Echinococcus multilocularis Inhibited the Peritoneal

Macrophages Polarization and Worm Growth in BALB/c Mice

WANGLiqun¹，WUYixuan^1，2，PUGuiting¹，CAOShanling¹，WNAGDexian¹，LIUTingli¹，

LIHong¹，AMUDA Tharheer Oluwashola¹，GUOXiaola¹，YINHong^1，3，LUOXuenong^1，3*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Key Laboratory of Veterinary

Parasitology of Gansu Province，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of

Agricultural Sciences，Lanzhou730046，China; 2.Life Science and Engineering College of

Northwest University of Nationalities，Lanzhou730030，China; 3.Jiangsu Co-Innovation

Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses，

Yangzhou University，Yangzhou225009，China）

Abstract：The purpose of this study was to determine the effects of knockdown of Echinococcus multilocularis emu-let-7-5p on mouse peritoneal macrophages polarization and worm growth.A recombinant adeno-associated virus vector expressing emu-let-7-5p sponge sequence of E.multilocularis was constructed，and its inhibitory effect and specificity were validated in293T cells.Seventy clean-grade BALB/c mice were injected intravenously（tail vein）with AAV8-si-let-7-5p，AAV8-control，and PBS，respectively.After two weeks，two mice in each group were randomly selected，and the expression of GFP，emu-let-7-5p and its target C/EBP δin liver were detected by Western blot and qRT-PCR.At3months after intraperitoneal inoculation of1000protoscolexs in each mouse，the transcriptional levels of emu-let-7-5p，C/EBP δ，M1type（IL-1β，iNOS and IL-6）and M2type（Arg-1，IL-4and IL-10）related molecules in peritoneal macrophages were detected by qRT-PCR，and cysts weight and protoscolexs number of E.multilocularis in each group were analyzed.The results showed that，on the15th day after injection，AAV8-si-let-7-5p successfully targeted the mouse liver and caused knockdown of emu-let-7-5p and up-regulation of C/EBP δ.At3months after infection，the expressions of emu-let-7-5p and M2related molecule（Arg-1）in peritoneal macrophages were significantly down-regulated in AAV8-si-let-7-5p group，while C/EBP δand M1related molecules（IL-1β and iNOS）were significantly up-regulated.In addition，in AAV8-si-let-7-5p group，the expressions of IL-4and IL-6were down-regulated，while the expression of IL-10was up-regulated，and cysts weight and protoscolexs number in AAV8-si-let-7-5p group were significantly lower than those in the control group.The above results suggested that knockdown of emu-let-7-5p in mice infected with E.multilocularis can promote the expression of C/EPB δ，and thus inhibit M2macrophage polarization and worm growth.

Key words：Echinococcus multilocularis; emu-let-7-5p; peritoneal macrophages polarization; worm growth

*Corresponding author：LUO Xuenong，E-mail：luoxuenong@caas.cn

多房棘球蚴病（echinococcosis multilocularis）是由多房棘球絳蟲的中絳期-多房棘球蚴感染人或動(dòng)物引起的一種危害嚴(yán)重的寄生蟲病，又稱為泡球蚴病（alveolar echinococcosis，AE），世界衛(wèi)生組織將其列為20種被忽視的熱帶病之一^[1]。AE廣泛流行于北半球，尤其是中國和中亞地區(qū)^[2]。在我國，AE主要分布于中西部和東北部地區(qū)，有4個(gè)明顯流行區(qū)：新疆北部、寧夏固原地區(qū)及甘肅南部、青藏高原東部（包括四川西北部和青海南部）、內(nèi)蒙古東部和黑龍江^[3]。目前，全國棘球蚴病流行縣共368個(gè)，主要分布于四川、西藏、青海、甘肅和新疆等地，其中115個(gè)縣為囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和AE混合流行區(qū)^[4]。多房棘球蚴的生活史通常包括作為終末宿主的犬科動(dòng)物（主要是狐貍和狗）和作為中間宿主的小型哺乳動(dòng)物（嚙齒動(dòng)物）。人通過攝入終末宿主排出的蟲卵而感染。AE患者中，98%的感染主要發(fā)生在肝臟^[5]，確診后未經(jīng)治療或治療不良的患者10～15年內(nèi)的死亡率高達(dá)94%^[6]，故又名“蟲癌”。因此，AE被認(rèn)為是最致命的慢性寄生蟲病之一，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全^[7]。

巨噬細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)中的一種具有高度可塑性和多功能的細(xì)胞，在宿主防御、炎癥、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用^[8]。在不同微環(huán)境刺激下可極化為兩種不同的表型：M1型（促炎表型）和M2型（抗炎表型）。M1型巨噬細(xì)胞分泌iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子，對清除細(xì)菌、病毒和真菌等感染至關(guān)重要^[9]。M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)Arg-1、Ym1和CD206，分泌IL-10等抗炎細(xì)胞因子，對血管生成和傷口愈合有促進(jìn)作用^[10]。研究報(bào)道，小鼠多房棘球蚴感染早期，巨噬細(xì)胞以M1表型誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，分泌促炎細(xì)胞因子，參與蟲體殺傷和清除；在感染后期則以M2表型誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，分泌抗炎細(xì)胞因子，參與蟲體的持續(xù)感染過程^[11]。表明多房棘球蚴的感染過程存在巨噬細(xì)胞型別轉(zhuǎn)換。

microRNA（miRNA）是一類小的調(diào)節(jié)性非編碼RNA，主要通過下調(diào)mRNA水平或轉(zhuǎn)錄抑制，從而負(fù)調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)。研究表明，包括棘球蚴在內(nèi)的多種寄生蟲都能編碼miRNA，其中一些miRNA與寄生蟲感染密切相關(guān)^[12]。在扁形動(dòng)物中，let-7高度保守且具有復(fù)雜的進(jìn)化模式^[13]，可能參與寄生蟲的發(fā)育和感染^[14-15]。微小隱孢子蟲感染誘導(dǎo)膽管細(xì)胞let-7i下調(diào)，從而導(dǎo)致其靶基因TLR4的上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性敲低let-7i顯著逆轉(zhuǎn)了微小隱孢子蟲誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)，使荷蟲量顯著降低，表明let-7i在抗寄生蟲感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用^[16]。最新研究報(bào)道，豆?fàn)钅椅豺蔿et-7-5p可通過調(diào)節(jié)靶基因C/EBP δ的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，從而導(dǎo)致宿主免疫抑制，這可能有利于蟲體在宿主體內(nèi)的長期寄生^[17]。let-7-5p是寄生蠕蟲高表達(dá)的miRNA之一，且在絳蟲蚴中序列完全一致^[18-20]。多房棘球蚴外泌體和感染小鼠血清中都存在蟲源emu-let-7-5p^[21]，推測多房棘球蚴emu-let-7-5p在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，敲低或抑制emu-let-7-5p可能對多房棘球蚴誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化和蟲體生長發(fā)育產(chǎn)生影響。本研究通過小鼠尾靜脈注射表達(dá)絳蟲蚴來源emu-let-7-5p海綿序列的8型重組腺相關(guān)病毒（AAV8-si-let-7-5p），敲低或抑制emu-let-7-5p的表達(dá)，進(jìn)而評價(jià)對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化和原頭蚴生長發(fā)育的影響，這將為闡明多房棘球蚴病的致病機(jī)制研究和治療藥物的開發(fā)提供新見解。

1 材料與方法

1.1 蟲體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

多房棘球蚴原頭蚴來自本實(shí)驗(yàn)室保種的長爪沙鼠。6～8周齡、雌性BALB/c小鼠（清潔級）購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究所有動(dòng)物試驗(yàn)均獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：LVRIAEC-2018009），動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南（GB/T35892-2018）》的要求執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器

巰基乙酸鹽肉湯（USP替代物）購自美國Sigma公司；TRIzol試劑、Lipofectamine^TM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PBS緩沖液、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、HiScript II1st Strand cDNA合成試劑盒、miRNA1st Strand cDNA合成試劑盒（加尾法）購自南京諾維贊生物公司；2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購自武漢塞維爾生物公司；qPCR引物購自上海生工生物公司。GFP抗體購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京博奧龍生物公司；極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物公司；CO₂培養(yǎng)箱、ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和qRT-PCR分析

用Primer Primer6.0分別設(shè)計(jì)miRNA和mRNA的引物，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（見表1）。用TRIZol法提取細(xì)胞或組織中的總RNA，分別用miRNA1st Strand cDNA合成試劑盒（加尾法）、HiScript II1st Strand cDNA合成試劑盒合成miRNA和mRNA的cDNA第一鏈。用2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix5μL，上、下游引物各0.2μL（10μmol·L^-1），DEPC水3.6μL，模板1μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，60℃退火延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。分別以U6和GAPDH作為miRNA和mRNA的內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制效果評價(jià)

根據(jù)多房棘球蚴emu-let-7-5p序列（TCTGTAAGCTUUGCGATGGAGT），設(shè)計(jì)針對emu-let-7-5p的海綿（sponge）序列（AGACATTCGAG-

TTCTACCTCA），并將4條海綿序列通過接頭序列（GGGTCCC）串聯(lián)，構(gòu)建pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p重組表達(dá)載體（圖1）。重組質(zhì)粒的構(gòu)建由山東維真生物科技公司完成。

按照Lipofectamine^TM3000說明書要求，分別將emu-let-7-5p模擬物（mimics，50mmol·L^-1）、模擬物對照（NC，50mmol·L^-1）、NC+pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p（2.0μg）、mimics+pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p（2.0μg）轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞樣品，用qRT-PCR檢測let-7-5p的轉(zhuǎn)錄水平，并根據(jù)如下公式計(jì)算重組質(zhì)粒的抑制效率：抑制效率（%）=（emu-let-7-5p轉(zhuǎn)錄水平（mimics轉(zhuǎn)染組）-emu-let-7-5p轉(zhuǎn)錄水平（mimics+emu-let-7-5p海綿質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組））/emu-let-7-5p轉(zhuǎn)錄水平（mimics轉(zhuǎn)染組）×100%。

1.5 重組腺相關(guān)病毒（AAV8-si-let-7-5p）的包裝

AAV8-si-let-7-5p的包裝、純化和滴度測定由山東維真生物科技公司完成。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及重組病毒接種

將70只BALB/c小鼠分為3組：PBS組（20只）、AAV8-control組（20只）和AAV8-si-let-7-5p（30只）。PBS組小鼠每只尾靜脈注射200μL無菌PBS；AAV8-control組和AAV8-si-let-7-5p組小鼠分別尾靜脈注射200μL重組腺相關(guān)病毒（病毒滴度：2×10¹¹拷貝·mL^-1，稀釋液為PBS）。

1.7 AAV8-si-let-7-5p對小鼠肝臟let-7-5p的抑制效果

在接種重組腺相關(guān)病毒后兩周，隨機(jī)選取PBS組、AAV8-control組和AAV8-si-let-7-5p組的小鼠各1只，提取肝組織的總蛋白。取30μg蛋白樣品用12%SDS-PAGE進(jìn)行分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST洗膜3次，每次10min，加入兔GFP多克隆抗體（1∶2000；稀釋液為TBST），于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶4000，稀釋液為TBST），TBST洗膜3次，加入極超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，用化學(xué)發(fā)光儀檢測目標(biāo)條帶。同時(shí)，每組隨機(jī)選取1只小鼠，提取肝臟總RNA，用qRT-PCR檢測小鼠肝組織中l(wèi)et-7-5p和C/EBP δ的轉(zhuǎn)錄水平。

1.8 多房棘球蚴感染

頸椎脫臼法處死多房棘球蚴感染的長爪沙鼠，于超凈工作臺內(nèi)解剖小鼠，無菌分離腹腔內(nèi)的多房棘球蚴原頭蚴，用顯微鏡觀察原頭蚴活力并計(jì)數(shù)。在重組腺病毒接種后兩周，每只小鼠分別腹腔接種1000個(gè)原頭蚴（200μL，稀釋液為PBS）。

1.9 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子的分析

感染多房棘球蚴后3個(gè)月，用1mL3%巰基乙酸鹽肉湯腹腔注射小鼠，每天1次，連續(xù)刺激3d。采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其置于75%乙醇中，浸泡3min，隨后置于超凈工作臺內(nèi)，剪開腹部皮膚并暴露腹膜。向腹腔內(nèi)注入5mL預(yù)冷PBS（含10%FBS），按摩小鼠腹部5min。用注射器吸取沖洗液，并立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，反復(fù)沖洗腹腔3次，將沖洗液合并后于4℃、1000r·min^-1離心10min，細(xì)胞沉淀用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后，于37℃培養(yǎng)箱中靜置3h，棄掉未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。

收集巨噬細(xì)胞，提取總RNA，用qRT-PCR檢測let-7-5p、C/EBP δ和巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子（M1型：IL-1β、IL-6和iNOS；M2型：IL-10和Arg-1）的轉(zhuǎn)錄水平。

1.10 多房棘球蚴包囊重量和原頭蚴數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

分離PBS組、AAV8-control組和AAV8-si-let-7-5p組小鼠肝臟和腹腔中的多房棘球蚴包囊，并對包囊重量和原頭蚴數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的減蟲率：減蟲率（%）=（對照組平均蟲體數(shù)量-試驗(yàn)組平均蟲體數(shù)量）/對照組平均蟲體數(shù)量×100%。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism8.0軟件進(jìn)行分析，Student′s ttest用于兩組間差異分析，Plt;0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒可抑制emu-let-7-5p的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖2），與NC組相比，emu-let-7-5p mimics轉(zhuǎn)染組emu-let-7-5p的水平顯著升高（Plt;0.000 1），說明emu-let-7-5p在293 T細(xì)胞中成功過表達(dá)。然而，當(dāng)emu-let-7-5p mimics和emu-let-7-5p海綿質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，顯著逆轉(zhuǎn)了emu-let-7-5p mimics誘導(dǎo)的emu-let-7-5p的升高（Plt;0.001），表明emu-let-7-5p海綿質(zhì)粒可特異性抑制emu-let-7-5p的表達(dá)，其抑制效率達(dá)94.6%。

2.2 AAV8-si-let-7-5p靶向小鼠肝臟并介導(dǎo)let-7-5p敲低

Western blot結(jié)果顯示（圖3），AAV8-control和AAV8-si-let-7-5p組小鼠肝組織中均檢測到GFP蛋白表達(dá)，而PBS組小鼠卻未檢測到。說明重組病毒AAV8-si-let-7-5p成功靶向小鼠肝臟。

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖4），與PBS組和AAV8-control組相比，AAV8-si-let-7-5p組小鼠肝臟中l(wèi)et-7-5p的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（圖4A，Plt;0.01），而C/EBP δ的水平卻顯著升高（圖4B，Plt;0.05）。表明重組AAV8介導(dǎo)了let-7-5p的敲低，從而導(dǎo)致其靶基因C/EBP δ的轉(zhuǎn)錄升高。

2.3 AAV8-si-let-7-5p通過C/EBP δ抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M2型極化

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖5），在感染后3個(gè)月，與PBS組和AAV8-control組相比，通過AAV8-si-let-7-5p敲低emu-let-7-5p后，其靶基因C/EBP δ的轉(zhuǎn)錄上調(diào)^[19]（圖5A，Plt;0.05），從而促進(jìn)M1型相關(guān)分子IL-1β和iNOS的轉(zhuǎn)錄（圖5B，Plt;0.05），抑制M2型相關(guān)分子Arg-1的表達(dá)轉(zhuǎn)錄（圖5C，Plt;0.05）。同時(shí)，AAV8-si-let-7-5p組IL-6和IL-4的水平顯著低于PBS組和AAV8-control組，而IL-10的水平顯著高于PBS組和AAV8-control組（Plt;0.05）。提示通過AAV8-si-let-7-5p敲低小鼠體內(nèi)的emu-let-7-5p，可抑制腹腔巨噬細(xì)胞向M2表型極化。

2.4 AAV8-si-let-7-5p可抑制多房棘球蚴生長發(fā)育

每只小鼠多房棘球蚴的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖6）顯示，PBS組、AAV8-control組和AAV8-si-let-7-5p組的平均包囊重量分別為42、41和31mg，平均原頭蚴數(shù)量分別為2347、2341和881個(gè)。與AAV8-control組相比，AAV8-si-let-7-5p組包囊重量和原頭蚴數(shù)量均顯著降低（圖6，Plt;0.01和Plt;0.000 1），其減蟲率為62.4%。以上結(jié)果表明，敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p可顯著抑制蟲體的生長發(fā)育。

3 討 論

巨噬細(xì)胞在宿主抗蠕蟲感染的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用^[22]。目前普遍認(rèn)為，多房棘球蚴感染早期，巨噬細(xì)胞極化為促炎的M1型，參與蟲體的殺傷和清除；感染晚期極化為抗炎的M2型，誘導(dǎo)宿主形成免疫耐受，有利于蟲體的持續(xù)感染和長期存活^[23]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豆?fàn)钅椅豺蔿et-7-5p可通過下調(diào)其靶基因C/EBP δ的表達(dá)，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化^[19]。分析發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴等絳蟲蚴與豆?fàn)钅椅豺视型耆嗤膌et-7-5p序列，推測多房棘球蚴emu-let-7-5p也可通過C/EBP δ調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化。因此，本研究設(shè)計(jì)合成了絳蟲蚴emu-let-7-5p的海綿序列，并利用重組AAV8敲低多房棘球蚴感染小鼠體內(nèi)emu-let-7-5p。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AAV8-si-let-7-5p組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中，C/EBP δ和M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子（iNOS和IL-1β）的mRNA水平顯著高于對照組，而M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子（Arg-1）的mRNA水平顯著低于對照組，而且Arg-1的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平要顯著低于iNOS和IL-1β，呈現(xiàn)M2表型劣勢。說明敲低小鼠體內(nèi)emu-let-7-5p后，促進(jìn)了C/EBP δ的表達(dá)，進(jìn)而抑制了由多房棘球蚴感染誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化，該結(jié)果進(jìn)一步印證了體外試驗(yàn)結(jié)果^[20]。

巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的iNOS與抗寄生蟲感染密切相關(guān)^[24-25]。Shen等^[26]研究發(fā)現(xiàn)，iNOS在大鼠體內(nèi)的高表達(dá)對阻斷日本血吸蟲生長、生殖器官發(fā)育、產(chǎn)卵和存活方面起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p后，感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中iNOS轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)；而且與對照組相比，敲低emu-let-7-5p后多房棘球蚴包囊重量和原頭蚴數(shù)量顯著減少，推測iNOS的高表達(dá)可能有利于宿主對蟲體的殺傷和清除。

已有研究報(bào)道，在微小隱孢子蟲感染的人膽管上皮細(xì)胞H69中，用let-7i的反義寡核苷酸靶向敲低let-7i，可促進(jìn)其靶基因SIRT1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)NF-κB的激活，表明let-7i在NF-κB介導(dǎo)的上皮細(xì)胞抗微小隱孢子蟲感染的炎癥應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)控作用^[27]。此外，最新研究表明，在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中過表達(dá)emu-let-7-5p可抑制促炎細(xì)胞因子IL-1α和LPS/TLR4信號通路中的關(guān)鍵基因RIPK1和NFKB的表達(dá)^[28]，表明emu-let-7-5p具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的特性，可能參與了多房棘球蚴病的發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)用8型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)多房棘球蚴emu-let-7-5p敲低，促進(jìn)了炎性轉(zhuǎn)錄因子C/EBP δ和促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，從而抑制了多房棘球蚴的生長發(fā)育，證實(shí)emu-let-7-5p在小鼠抗多房棘球蚴感染過程中也發(fā)揮著調(diào)控作用。

寄生蟲來源的外泌體通過向宿主傳遞生物活性物質(zhì)（miRNA和蛋白），在寄生蟲-宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豆?fàn)钅椅豺释饷隗w及其包裹的let-7-5p可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答^[20，29]。也有研究報(bào)道，多房棘球蚴及其外泌體中均含有高豐度且相對富集的emu-let-7-5p^[30]。因此，推測多房棘球蚴產(chǎn)生的emu-let-7-5p可通過外泌體作用于宿主免疫細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，創(chuàng)建有利于自己寄生的微環(huán)境。

4 結(jié) 論

敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p可抑制感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞從抗炎M2型轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺譓1型，從而抑制了蟲體的生長發(fā)育。提示多房棘球蚴emu-let-7-5p在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

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（編輯 白永平）