浙江省部分地區雞球蟲感染情況調查分析

摘 要：為了解浙江省部分地區雞球蟲感染情況，以及對致病性新種：拉坦艾美耳球蟲（Eimeria latan）、納甘比艾美耳球蟲（Eimeria nagambie）和扎利亞艾美耳球蟲（Eimeria zaria）進行鑒定，從杭州、麗水、嘉興3個地區7個養殖場采集新鮮雞糞便349份。使用麥克馬斯特計數法檢查并計數每克糞便中球蟲卵囊數，用顯微觀察法確定陽性樣品中球蟲種類，并進行PCR鑒定。隨后，按地區來源、養殖方式、用途和日齡不同對雞球蟲的感染情況進行差異分析。結果顯示，所調查地區雞球蟲的總感染率為72.78%（254/349），共檢出七種傳統雞艾美耳球蟲和納甘比艾美耳球蟲。其中優勢種為堆型艾美耳球蟲，7個養殖場均為混合感染。PCR及序列分析結果表明在7個場中4個存在疑似納甘比艾美耳球蟲的感染，其中A場納甘比艾美耳球蟲與澳大利亞株LR877717.1COI基因序列親緣關系最近，相似性為99.99%，聚成一支。調查研究結果表明，浙江地區雞球蟲總體感染率較高，其中堆型艾美耳球蟲田間感染尤其嚴重。所調查的浙江省部分地區部分雞場已出現疑似納甘比艾美耳球蟲的感染。

關鍵詞：浙江；雞球蟲；流行病學調查；納甘比艾美耳球蟲；堆型艾美耳球蟲

中圖分類號：S851.3; S852.723

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2629-12

收稿日期：2023-10-10

基金項目：國家自然科學基金（32072883）

作者簡介：周思含（1998-），女，河南新鄉人，碩士，主要從事雞球蟲研究，E-mail：2674022481@qq.com；Tel：13569885825

*通信作者：王天奇，主要從事動物寄生蟲研究，E-mail：wtq@haust.edu.cn；石團員，主要從事動物寄生蟲研究，E-mail：lstone2008@126.com

Investigation and Analysis on Infection of Chicken Coccidia in Some

Regions of Zhejiang Province

ZHOUSihan^1，2，LITianen^1，2，DENGJinhua³，SUNHongchao²，YANWenchao¹，

SHITuanyuan^2*，WANGTianqi^1*

（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，

Luoyang471023，China; 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Zhejiang

Academy of Agricultural Science，Hangzhou310000，China; 3.College of Animal

Science and Technology，Tarim University，Aral843300，China）

Abstract：In order to understand the infection status of chicken coccidia in some regions of Zhejiang province，and to identify the new species，Eimeria latan，Eimeria nagambie and Eimeria zaria，349fresh chicken feces were collected from7farms in Hangzhou，Lishui and Jiaxing.The number of coccidia oocysts per gram of feces was examined and counted by McMaster counting method.The species of coccidia in positive samples were determined by microscopic observation and identified by PCR.Subsequently，the infection of chicken coccidia was analyzed according to regional sources，breeding methods，uses and age.The result showed that the total infection rate of chicken coccidia in the investigated area was72.78%（254/349），and seven species of Eimeria and Eimeria nagambie were detected，among which the dominant species was Eimeria acervulina，mixed infection were found in all farms.The PCR and sequence analysis results showed that four of the seven farms were infected with suspected Eimeria nagambie，the Eimeria nagambie of farm Ahad the closest homology with the COI gene of the Australian strain LR877717.1，the homology is99.99%，and clustered into abranch.The results showed that the overall infection rate of chicken coccidia in Zhejiang province was high，and the field infection of E.acervulina was particularly serious.Some chicken farms in some areas of Zhejiang Province have been infected with suspected new species of coccidiosis Eimeria nagambie

Key words：Zhejiang; coccidiosis; epidemiological investigation; Eimeria nagambie; Eimeria acervulina

*Corresponding authors：WANG Tianqi，E-mail：wtq@haust.edu.cn; SHI Tuanyuan，E-mail：lstone2008@126.com

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳屬球蟲（Eimeria）寄生在雞腸道所引起的嚴重疾病，是雞養殖過程中最為常見、多發的寄生蟲病之一，隨著集約化養殖的發展，雞球蟲的流行更加廣泛，給全球養雞業造成了嚴重威脅和重大損失^[1]。浙江省地處東南沿海長江三角洲南翼，是我國雞球蟲病高發地區之一，這與浙江省雞養殖企業養殖密度高、夏季高溫、潮濕等因素密切相關^[2]。目前，公認可以感染雞的七種球蟲為柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）、毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）、巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）、堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）、和緩艾美耳球蟲（Eimeria mitis）、早熟艾美耳球蟲（Eimeria praecox）、布氏艾美耳球蟲（Eimeria brunetti），以上七種蟲種在我國均有分布。

最近，在澳大利亞所分離的雞球蟲中發現了三種致病性雞球蟲新種^[3]：拉坦艾美耳球蟲（Eimeria latan）、納甘比艾美耳球蟲（Eimeria nagambie）和扎利亞艾美耳球蟲（Eimeria zaria）。在這三個新種中，拉坦艾美耳球蟲的卵囊最大，平均長度為30.8μm（28.2～32.8μm），寬度為23.8μm（22.1～25.7μm），平均長寬比為1.29。光滑卵球形卵囊，卵囊壁厚約1.8μm。存在斯氏體和極粒，無卵膜孔、卵囊殘體和孢子囊殘體。其形態上與巨型艾美耳球蟲相似。該種寄生于十二指腸、空腸。潛隱期為125～130h，致病性中等。納甘比艾美耳球蟲的卵囊大小中等，平均長度為26.7μm（25.3～27.7μm），平均寬度為22.8μm（21.5～23.9μm），平均長寬比為1.17。光滑卵球形卵囊，卵囊壁厚約1.2μm。存在斯氏體和極粒，無卵膜孔、卵囊殘體和孢子囊殘體。形態上與堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲相似。該種寄生于十二指腸、空腸。潛隱期為132h左右，致病性未知。扎利亞艾美耳球蟲的卵囊最小，平均長度為17.7μm（14.8～18.8μm），平均寬度為15.2μm（13.2～16.8μm），平均長寬比為1.17。光滑卵球形卵囊，卵囊壁厚約1.2μm。存在斯氏體和極粒，無卵膜孔、卵囊殘體和孢子囊殘體。形態上與布氏艾美耳球蟲相似。該種寄生于十二指腸、空腸。潛隱期為130～135h，致病性較低。

由于三種雞球蟲新種在卵囊形態、寄生部位、潛隱期等方面與傳統的七種艾美耳球蟲間存在交叉，傳統的病原學顯微鏡檢方法無法對其進行準確的鑒別診斷；且目前市場上所使用的雞球蟲病全價疫苗是基于傳統的七種雞艾美耳球蟲所研制，這些傳統疫苗均對三種新型致病雞球蟲導致的球蟲病無有效保護作用，給雞球蟲病防控帶來了新的威脅和挑戰。2016年的一項研究表明，只在南半球發現了球蟲新種的感染^[4]。但近兩年的研究中在北美等北半球國家也發現了球蟲新種的存在^[5]。目前我國尚未有關于球蟲新種感染情況的報道，亟需對國內三種雞艾美耳球蟲新種的流行情況進行調查。

在對雞球蟲流行病學進行調查時通常采用的是傳統的形態學方法，該方法不僅耗時耗力，并且容易受環境因素及主觀因素的干擾，出現錯檢、漏檢的現象^[6]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）操作簡單且準確，已廣泛應用在雞球蟲蟲種鑒定上^[7]。18S rRNA基因（18S ribosomal RNA，18S rRNA）序列高度保守；COI基因線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（cytochrome coxidase subunit I，COI）基因序列是用于物種鑒定有效的分子標記之一，尤其是對形態特征極其相似的種的鑒定中可提供更有效的分子依據，適用于球蟲種間的遺傳進化分析、蟲種鑒定等^[8]。

本研究通過顯微鏡鏡檢與分子生物學方法調查了浙江省部分地區不同品種雞球蟲的感染情況，以明確浙江省所調查地區雞球蟲流行情況及優勢種。同時，研究發現了疑似球蟲新種：納甘比艾美耳球蟲，對納甘比艾美耳球蟲浙江株與傳統七種雞球蟲的18S rRNA和COI基因進行了同源性比較分析，構建系統發育樹。本研究為浙江省雞球蟲病防控提供了科學依據，并首次發現國內雞球蟲納甘比艾美耳球蟲的感染，為新種的流行病學調查和防控提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

重鉻酸鉀，來自高晶化工公司；氯化鈉，來自羅恩試劑公司；糞便DNA提取試劑盒，來自Omega bio-tek公司；Premix Tap MIX，來自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，來自Solarbio公司。

1.1.2 主要儀器

麥克馬斯特計數板，來自上海潤友科技有限公司；臺式低溫離心機，來自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；顯微鏡及數碼拍照系統，來自寧波舜宇儀器有限公司；恒溫培養箱，來自上海精宏實驗設備有限公司；PCR儀，來自Analytikjena公司；電泳儀，來自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，來自美國UVP公司。

1.2 樣品采集

選擇了浙江省三個市未使用球蟲疫苗的7個養雞場做為調查對象，其中嘉興市3個，杭州市3個，麗水市1個。2022年10月下旬—11月中旬進行采樣，每個養殖場隨機收集新鮮糞便，每份糞便10～15g，裝入潔凈的塑封袋中，編號做好標記，并記錄養殖場位置、規模、品種、日齡、健康狀況和養殖方式等信息。將樣品放入帶冰袋的低溫泡沫箱中，迅速送入4℃冰箱保存。共采集了349份新鮮樣本（表1）。

1.3 感染強度判定

對所有糞樣進行檢查。將每份樣品混合均勻后，稱取1g糞便放入燒杯中，加入少量飽和鹽水用玻璃棒搗碎，添加飽和鹽水至30mL，攪拌混勻，經100目篩子過濾。將濾液混勻后，用移液器將濾液加入到麥克馬斯特計數板的兩個計數室內，每個計數室填滿，一份樣品分別加入到3個計數室內，靜止3～5min。在顯微鏡下（1000×）觀察是否存在球蟲卵囊。如存在，對其進行計數，共計數3次，取平均值以減少誤差。計算出每克糞便樣品中的卵囊數（oocysts per gram feces，OPG），＜1×10⁴為輕度感染，1×10⁴～1×10⁵為中度感染，＞1×10⁵為嚴重感染^[10]。棄去陰性樣本，將陽性樣本保存于4 ℃冰箱中待收集卵囊。

1.4 陽性樣品卵囊收集和觀察

將4～6份同場的陽性糞便置于干凈燒杯中，加入適量純水，攪拌至糞便充分散開。經100目和200目銅篩去除雜質后，以4000r·min^-1離心5min后取沉淀。在沉淀中加入適量飽和食鹽水后4000r·min^-1離心5min，小心取出上清液。隨后在上清液中加入5倍體積的純水4000r·min^-1離心5min，棄去上清液，加入適量2.5%重鉻酸鉀混勻，置于28℃，200r·min^-1使卵囊孢子化。顯微鏡下，每隔4h檢查孢子化程度，直至80%以上卵囊孢子化。對各場孢子化卵囊進行初步球蟲種類判定并拍照，判定標準參照相應文獻（圖1）^[9]。

1.5 陽性樣品分子鑒定

取孢子化卵囊2mL，4000r·min^-1離心5min后取沉淀，隨后使用PBS洗去重鉻酸鉀后，提取球蟲DNA。參照GenBank數據庫已公布的核苷酸序列以及相關已報道文獻^[11]，針對七種球蟲^[12]和三種新種^[3]分別設計十對特異性引物以檢測糞便中不同品種球蟲的感染情況，同時根據COI和18S rRNA基因設計新種的特異性引物（表2）。PCR反應體系：2×Premix rTaq12.5μL，上游/下游引物（10μmol·mL^-1）各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O8.5μL，共25μL。反應條件：94℃5min（預變性）；94℃30s（變性）；在各特異性引物的退火溫度下退火30s（表2）；72 ℃延伸，延伸時間由產物長度決定（1kd延伸時間60s），共40個循環，最后72 ℃終極延伸5min。反應結束后，均使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察條帶情況，選取各場各蟲種中條帶最亮的條帶切膠回收后送至公司測序。使用DNAStar中的SeqMan對序列進行拼接，拼接后的序列于Blast中進行同源序列搜索。

1.6 感染率統計分析

分別統計不同地區、不同養殖方式、不同用途和不同日齡的感染率，使用SPSS22.0中的卡方檢驗對其進行統計學分析。在影響雞球蟲感染率的諸多因素中，養殖方式的影響最大，因此對同一養殖方式下不同用途和不同日齡的感染率差異進行統計學分析^[13]。

1.7 新種序列分析

使用MEGA6.0軟件對所獲得的的序列與NCBI上傳的不同蟲株的COI和18S rRNA基因序列的同源性進行比較以及構建進化樹，基于鄰接法（Neighbour-joining，NJ）、Bootstrap數值為1000對本研究得到的球蟲新種有關序列進行種系發育分析。

2 結 果

2.1 浙江地區雞球蟲感染情況

共檢出254份陽性糞便，總感染率為72.78%（表3）。在7個場中，C雞場感染率最高，達95.65%。在所有陽性樣品中，輕度、中度及嚴重感染分別占87.01%、12.20%和0.79%。

四個市所采的樣品中，海寧市的感染率最高，為93.13%（表4）。除了麗水市與杭州市感染率差異不顯著外，其余各市之間感染率差異均極顯著（P≤0.01）（圖2）。

肉雞與蛋雞的感染情況如表4所示。肉雞的感染率較蛋雞高，為76.64%，蛋雞的為28.57%。二者差異極顯著（P≤0.01）（圖2）。

根據雞日齡大小將樣品分為三組：＜50d組、50～100d組和＞100d組。感染率最高的為50～100 d組，為83.58%；＞100d組最低，為57.94%；＜50 d組介于前兩者之間，為77.53%（表4）。三組之間差異極顯著（P≤0.01）（圖2）。

在不同的養殖方式中，平養和林下散養的感染率均高于籠養，且差異極顯著（P≤0.01），但平養與林下散養的感染率差異不顯著（圖2）。

在平養和籠養方式下，不同日齡和不同用途之間感染率差異不顯著；在林下散養方式中，肉雞與蛋雞、＜50 d組與＞100 d組、50～100 d組與＞100 d組之間差異顯著（圖2）。

2.2 浙江地區雞球蟲感染種類

顯微鏡共初步檢查出七種已知雞艾美耳屬球蟲（圖3）。

以提取的DNA為模板，分別使用不同艾美耳球蟲特異性引物進行PCR（圖4）。堆型艾美耳球蟲的感染最為嚴重，7個場均存在其感染的現象，陽性率為49.06%；其次為毒害艾美耳球蟲，共有5個場感染，陽性率為24.53%；柔嫩艾美耳球蟲共在4個場發現，陽性率為18.87%；巨型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲的陽性率略低于前三種蟲種，分別為5.66%、7.55%、1.89%和11.32%。7個場均為混合感染。將拼接后的序列于NCBI進行Blast，與相應序列的的一致性均高于97%?？ǚ綑z驗結果顯示優勢種為堆型艾美耳球蟲。分子鑒定結果與鏡檢結果一致。

在7個場中有4個場檢測到納甘比艾美耳球蟲（圖5）。

2.3 疑似新種OTUy分子鑒定分析

使用A場的DNA，對納甘比艾美耳球蟲的18S rRNA和COI基因進行擴增，經凝膠電泳檢測，結果顯示分別擴增出約945和791bp的目的條帶。

對測序獲得的A場納甘比艾美耳球蟲的COI和18S rRNA基因序列進行序列同源性分析和遺傳進化樹分析。結果表明，此研究中納甘比艾美耳球蟲的COI基因序列與NCBI中納甘比艾美耳球蟲澳大利亞株LR877717.1的相似度最高，為99.87%，且具有同源性。通過構建進化樹發現，該基因序列與納甘比艾美耳球蟲澳大利亞株（LR877717.1）位于同一分支上，親緣關系最近；與布氏艾美耳球蟲加拿大株（HM771675.1）聚為一小分支，親緣關系較近（圖6）。18S rRNA基因序列與NCBI中納甘比艾美耳球蟲澳大利亞株（LT964973.1）的相似度較高，為98.20%，且具有同源性。通過構建進化樹發現，該基因序列與納甘比艾美耳球蟲澳大利亞株（LT964973.1）聚為一小分支，親緣關系較近（圖7）。據此分析，浙江地區存在新種納甘比艾美耳球蟲的感染。

3 討 論

在本研究中，作者發現所調查的浙江省部分地區雞球蟲感染率為72.78%，Sun等^[14]調查了浙江省麗水市、臺州市、杭州市以及義烏市球蟲感染情況，總感染率為54.20%，感染率的差異可能與采樣時間、地點的差異所導致的。本研究中雞球蟲感染率高于李微^[15]在哈爾濱（62.39%）所調查的感染率，這可能與浙江省氣溫高，濕度大，更適宜球蟲生長有關。李旭紅和李海輝^[16]對岳陽地區的球蟲感染情況進行調查，發現不同地區、不同品種、不同日齡、不同季節、不同養殖方式的球蟲感染情況差異較大。本次研究與文獻[16]的結果基本一致，肉雞的感染率遠高于蛋雞，這是由于一般來說蛋雞日齡大于肉雞所導致的；幼年雞及青年雞的感染率小于老年雞；林下散養的感染率最高，這是由于該養殖方式直接接觸室外土地，消殺難度較大，且此養殖方式在養殖過程中，相較于其他兩種來說，排泄物更不易清理到位，以上都會助益生存能力本就較強的球蟲感染雞。而杭州市A雞場的感染率最低，這可能與以下原因有關：該場養殖人員相對來說文化程度較高，更易于科學養殖的進行；該場定期使用了不同的抗球蟲藥物進行了防控；該場采用全進全出的模式，相對其他場養殖過程中的操作較為規范。

在以往研究者對雞球蟲的感染品種調查中，柔嫩、堆型、巨型、和緩、早熟和毒害艾美耳球蟲的感染較布氏艾美耳球蟲更為普遍，如杜愛芳等^[17]在杭州部分地區所采集的雞糞便中發現了三種艾美耳屬球蟲，分別是柔嫩、毒害和巨型艾美耳球蟲；何良軍等^[18]對阿克蘇地區的雞球蟲品種進行了調查，共發現三種艾美耳屬球蟲：柔嫩、堆型和巨型艾美耳球蟲。而在本研究中，所調查的養殖場中存在布氏艾美耳球蟲的感染。布氏艾美耳球蟲在卵囊形態、寄生部位和潛隱期等方面與其他幾種艾美耳球蟲不能完全區分開來，而本研究使用PCR的方法從分子學上對七種艾美耳球蟲進行了鑒定，相對于傳統的鑒別方法更加準確。Flores等^[19]對韓國地區2019年到2021年雞球蟲流行情況進行調查，發現混合感染的情況比較多見，最常見的是3種球蟲混合感染，其次是4種和5種。本次調查中發現，7個所調查養殖場均為混合感染，其中，5種混合感染最為常見，與上述調查結果略有不同。由于雞對球蟲各種之間無交叉免疫，因此，球蟲混合感染的情況相對較為常見。

在2007年Morris等^[20]所進行的研究中通過毛細管電泳技術首次發現了雞艾美耳球蟲的三個新種，隨后Clark等^[21]對其全球流行情況進行了調查，結果表明新種在南半球比在北半球的流行更為廣泛。Blake等^[3]進一步對拉坦艾美耳球蟲、納甘比艾美耳球蟲和扎利亞艾美耳球蟲的卵囊形態、潛隱期和寄生部位等進行了詳細的研究，發現目前廣為使用的雞球蟲疫苗對致病性新種所導致的球蟲病無預防保護的作用，并對COI和18S rRNA基因進行擴增測序分析。本試驗使用Blark等設計的引物，對疑似納甘比艾美耳球蟲感染的樣品進行COI和18S rRNA基因序列的擴增，構建進化樹分析。但正如Blake所提出的，在進行雞艾美耳球蟲物種分類時，相對于COI基因序列，18S rRNA基因似乎存在更大的局限性。本試驗中，OTUy的COI基因序列與Blake等^[3]所上傳的基因序列聚在一小支，18S rRNA基因序列與Blark所上傳的基因序列處于進化樹的同一系群，但并未聚于同一小支內，這與Blake所說明的一致。本研究發現浙江地區存在疑似納甘比艾美耳球蟲感染的雞場。這是國內關于田間存在納甘比艾美耳球蟲的首次報道。與Hauck等^[5]所發現的結果一致，雞球蟲致病性新種不僅僅只存在于南半球，目前已呈現全球流行的趨勢。目前正使用單卵囊分離技術獲得納甘比艾美耳球蟲A場分離株，通過其形態學、潛隱期、寄生部位等病原特征對其進行深入的研究鑒定。

綜上所述，浙江省雞球蟲感染率較高，同時存在新種納甘比艾美耳球蟲傳播的可能性。因此，有必要加強浙江地區雞球蟲病的防控，特別是新種，并對浙江地區雞球蟲病尤其是新種的檢測和防控技術加強研究，進而為養雞業的健康發展保駕護航。本研究為浙江雞球蟲病有效防控奠定了一定研究基礎，為浙江省雞球蟲新種的感染情況提供了第一手資料。

4 結 論

浙江地區雞球蟲總體感染率較高，其中堆型艾美耳球蟲田間感染尤其嚴重。所調查的浙江省部分地區部分雞場已出現疑似納甘比艾美耳球蟲的感染。

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（編輯 白永平）