豬流行性腹瀉病毒感染仔豬空腸轉錄組差異表達分析

摘 要：旨在分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染仔豬空腸組織的轉錄組差異。用PEDV毒株HB（G2b）感染3頭2日齡仔豬，對感染后18h仔豬空腸組織進行免疫組化、轉錄組測序和分析，最后采用熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證轉錄組結果。結果顯示：仔豬感染PEDV18h后空腸絨毛明顯脫落、變短，且PEDV主要分布于空腸腸絨毛表面；GO富集及KEGG富集分析的差異基因主要與免疫應答過程和炎癥反應過程相關；富集在趨化因子受體相互作用、Toll受體信號、脂肪與糖代謝等。結果提示PEDV感染可激活宿主免疫反應及相關抗病毒信號通路，并且引起宿主的炎癥風暴和營養代謝紊亂，為深入研究PEDV的致病機制奠定了基礎。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；轉錄組；致病機制

中圖分類號：S852.6596

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2652-10

收稿日期：2023-06-19

基金項目：國家自然科學基金（32202826）；河南省大學生創新創業（202210471045）；河南省青年基金（222300420216）

作者簡介：李棟梁（1989-），男，河南鄭州人，博士生，主要從事病毒免疫學研究，E-mail：497222038@sian.com

*通信作者：吳 超，主要從事病原微生物學檢測研究，E-mail：wuchao_517@126.com

Differential Expression of Transcriptome in Jejunal of Piglets Infected with Porcine

Epidemic Diarrhea Virus

LIDongliang^1，2，ZHENGGuanmin³，LIShuai¹，ZHUHongsen³，WUChao^4*

（1.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou450046，China;

2.College of Animal Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou

450046，China; 3.Henan University of Chinese Medicine School of Medicine，Zhengzhou

450046，China; 4.Zhengzhou Customs，Zhengzhou450008，China）

Abstract：The aim is to study the pathogenic mechanism of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）by transcriptome analysis of the jejunum of two-day-old piglets infected with PEDV.Three two-day-old piglets were infected with the PEDV HB strain（PEDV-HB），which belongs to the currently prevalent G2b subtype.At18h post-infection，jejunum tissues were collected from piglets for pathology，PEDV detection，RNA-seq and transcriptome analysis.Finally; the transcriptome results were verified by quantitative real-time PCR（RT-qPCR）.The result showed that the jejunal villi of piglets infected PEDV-HB were significantly shed and shortened; and was mainly distributed on the surface of intestinal villi.GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes（DEGs）were mainly related to immune response and inflammatory response，and were enriched in several classical pathways，such as cytokine-cytokine receptor interaction，Toll-like receptor signaling pathway，fat and glucose absorption and metabolism.（Conclusion）PEDV infection of the jejunum of piglets activates the host immune response and associated antiviral signaling pathways and induces acytokine storm as well as dysfunctions in fat and glucose absorption and metabolism.In all，this research can lay the foundation for the study of pathogenesis mechanism of PED.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus; transcriptions; pathogenesis mechanisms

*Corresponding author：WU Chao，E-mail：wuchao_517@126.com

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于α冠狀病毒，是一種高度接觸性的傳染病病原，可引起各日齡豬的嘔吐、腹瀉、脫水及仔豬的高死亡^[1]。1971年PEDV首次在英國的育肥豬發現。隨后，20世紀80年代和90年代PEDV在歐洲廣泛流行^[2]。2010年以后PEDV發生變異，在中國、美國、加拿大、日本等全球主要養豬國家廣泛流行；新的PEDV毒株主要引起嚴重的腸道疾病，從而導致初生仔豬死亡，給世界養豬業帶來極大的經濟損失，且臨床上尚無有效的疫苗防控此病^[1，3]。因此，針對PEDV致病機制的相關基礎研究尤為重要。

轉錄組近些年來被廣泛應用于病毒與宿主相互作用的基礎研究中，其中應用轉錄組測序技術研究PEDV致病機制已有了大量報道。有文章報道使用PEDV感染Vero E6細胞后，轉錄組分析發現mTOR信號通路在Vero E6細胞抗PEDV病毒調控中發揮了重要作用^[4]；有學者分別使用經典毒株（CV777）和地方流行毒株（HLJ）感染IPEC-J2細胞，之后進行轉錄組分析，發現HLJ菌株比CV777菌株能更快速、更強烈地激活先天免疫和炎癥反應^[5]；此外，還有研究報道分別使用PEDV強、弱毒株感染IPEC-J2細胞，比對不同時間點轉錄組差異^[6]；通過轉錄組分析發現PEDV感染IPEC-J2細胞能激活STAT家族的調控^[7]。

本論文為研究PEDV與宿主空腸組織相互作用的分子致病機制，我們使用PEDV抗原抗體陰性的初生2日齡仔豬為感染宿主，使用PEDV G2b基因型HB毒株感染2日齡仔豬，建立了PEDV感染仔豬18h的模型。隨后，使用18h感染仔豬的空腸組織構建了文庫，對文庫進行轉錄組測序，篩選到PEDV感染引起的宿主差異表達基因，隨后進行GO富集及KEGG富集生物信息學分析，并用RT-qPCR方法進一步驗證轉錄組測序結果。該研究補充了PEDV與宿主相互作用的體內數據，并且為進一步研究PEDV體內致病機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與病毒

從PEDV抗原陰性的母豬所產仔豬中選取6頭用作試驗動物。PEDV抗原檢測試紙條檢測仔豬，結果顯示抗原為陰性。使用羊奶替代母豬的初乳飼喂初生仔豬24h；口服感染PEDV HB毒株（KY928065.1）。該毒株為本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養基購自Hyclone公司；PEDV N蛋白單克隆抗體由本實驗室制備^[8]；4％多聚甲醛購自Hyclone公司；HRP-羊抗鼠IgG試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自中國武漢博士德生物技術有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；熒光定量反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自Vazyme品牌；引物由生工生物工程有限公司合成；PEDV抗原檢測試紙條購自廣州岳洋生物技術有限公司。

1.3 動物感染試驗

感染組3頭仔豬使用噬斑純化后第五代HB毒株，經口服感染途徑感染，每頭仔豬感染劑量為1 mL，病毒毒價為10⁵TCID₅₀·mL^-1，編號為1、2、3；剩余3頭口服DMEM，設為對照組，編號為4，5，6。感染18h后，收集感染組和對照組仔豬空腸組織，4％多聚甲醛固定，其余空腸部分-80 ℃保存備用。

1.4 PEDV N蛋白在仔豬空腸內的分布

對收集的空腸組織進行石蠟包埋，使用的一抗為PEDV N蛋白單抗，二抗為HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，DAB顯色試劑盒顯色，檢測病毒在空腸組織內的表達分布。

具體方法如下：組織的脫水、透明和浸蠟使用全自動組織處理器設備來完成，完成脫水、透明和浸蠟后，對組織進行包埋，修剪包埋蠟塊，進行切片。脫蠟：二甲苯透明10min，梯度乙醇脫水，然后沖洗，過蒸餾水。抗原修復：使用蒸餾水稀釋抗原修復液，將切片煮沸20min，并且自然冷卻至室溫。用PBS漂洗3次，封閉液封閉1h；棄去封閉液，滴加一抗，4 ℃過夜；用PBS漂洗3次，滴加二抗，37 ℃濕盒中孵育1h；用PBS漂洗3次，使用DAB在37 ℃溫箱顯色10min，鏡下觀察到細胞內有棕色顆粒出現時，蒸餾水終止顯色；蘇木素溶液復染5min，從蘇木素溶液中取出后，組織切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 樣品總RNA提取

處理凍存的空腸組織（感染組和對照組），使用TRIzol法提取總RNA。RNA樣品快速放置-80 ℃保存，用于后續的文庫構建。

1.6 測序文庫構建

對符合質量標準的RNA進行純化，去除rRNA，富集mRNA。通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA，用超聲波打斷mRNA。以片段化的mRNA為模版，合成cDNA第1條鏈，用RNaseH降解多余的RNA，隨后合成cDNA第2條鏈。雙鏈cDNA經過末端修復、加尾并連接測序接頭，隨后篩選出200bp左右的cDNA，進行PCR擴增，純化PCR產物，最終獲得文庫，Illumina平臺上機測序（由廣東基迪奧公司完成）。

1.7 生物信息學分析

比較感染組和對照組之間的基因表達差異，對差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析。

1.8 熒光定量（RT-qPCR）驗證

對樣品總RNA進行反轉錄。根據選擇的基因，以GADPH為內參，設計引物進行相對定量測定與分析（表1）。RT-qPCR的結果用2^-ΔΔCt方法進行處理，在本試驗中特定基因的ΔΔCt具體為（PEDV感染組檢測基因-感染組內參）-（對照組檢測基因-對照組內參）。每個樣品做3孔重復，用GraphPad Prism6軟件處理數據。RT-qPCR的反應程序：預變性95 ℃5min；95℃15s；60℃40s，共40個循環。反應體系：SYBY EX Taq10μL；上游引物1μL；下游引物1μL；反轉錄產物1μL；DEPC水7μL。

2 結 果

2.1 PEDV感染仔豬癥狀及空腸的免疫組化分析

PEDV HB毒株口服感染2日齡仔豬后，仔豬在8～12h出現腹瀉和嘔吐等PED典型癥狀。感染組3頭仔豬糞便評分分別為1分、2分和2分；對照組3頭仔豬評分均為0分（1分及以上認為是腹瀉癥狀，最大分值為2分）。感染18h后，仔豬陸續出現精神萎靡，臥地不起癥狀，但是沒有仔豬死亡；進一步剖檢觀察發現小腸壁薄而透明，小腸和胃分別膨脹且充滿凝乳和未消化乳汁，而對照組小腸臟器基本正常。

利用PEDV N單抗檢測感染PEDV18h的仔豬空腸。結果表明，與對照相比，感染組空腸絨毛明顯脫落、變短，空腸組織內可見明顯的N蛋白表達，且主要分布在腸絨毛表面（圖1）。進一步量化評估腸絨毛與腸隱窩比值，3頭感染仔豬的VH∶CD（腸絨毛長度﹕腸隱窩深度）分別為1.14、2.10、2.49；3頭對照組仔豬VH∶CD為6.61、6.80、7.10；感染組與對照組VH∶CD比值之間差異極顯著（Plt;0.05）。

2.2 轉錄組文庫分析

對構建的轉錄組文庫原始數據與參考序列進行比對，剔除一系列低質量數據獲得高質量數據，所測樣品的高質量數據占原始數據的比率分別為96.7%、96.73%、96.65%、96.79%、96.73%、96.70%；高質量數據比例較高可用于后續分析。進一步將獲得的高質量數據與豬的參考基因組進行比對；6個樣品與參考基因組匹配分別為44629843（93.10%）、44703865（92.97%）、41875447（92.64%）、34146295（88.84%）、35720474（89.38%）、39135999（87.14%），樣品高質量數據基本可匹配到參考基因組。

2.3 差異基因分析

對感染組和對照組差異基因進行聚類分析，設定|log₂FC|gt;1且FDRlt;0.05的基因為差異顯著。如圖2A，結果共發現1051個差異顯著基因，其中上調基因為541個，下調基因為510個。單個樣品差異基因聚類分析熱圖（2B）可以通過樣品基因譜的相近程度判斷組內不同樣品基因的表達情況，紅色代表高表達基因，藍色代表低表達基因。如圖2B對照組樣品之間的差異基因表達聚類相近，感染組樣品差異基因表達聚類相近，符合水平預期。

2.4 GO富集分析

把差異顯著基因比對到GO數據庫，得到GO功能顯著性富集分析結果。其中生物過程中富集的差異基因主要集中在炎性反應、免疫系統過程等（圖3）。

2.5 KEGG分析

為探討PEDV感染仔豬后，主要影響空腸組織的哪些信號通路或代謝途徑，利用KEGG數據庫對差異基因進行Pathway分析。分析結果顯示，富集的最顯著信號通路為細胞因子與受體相互作用、脂肪消化與吸收等（圖4）。

2.6 RT-qPCR驗證空腸轉錄組

對轉錄組測序所得到的差異基因進行驗證，隨機選取9個基因（圖5A）和9個趨化因子相關基因（圖5B），用RT-qPCR確定其表達水平。盡管由于兩種方法的不同，RT-qPCR與轉錄組結果的具體數值不完全匹配（表2、表3），但是RT-qPCR結果與轉錄組結果趨勢一致。

3 討 論

PEDV是近些年內引起初生仔豬高死亡率的腸道傳染病病原之一^[1]。空腸組織是PEDV主要感染部位^[9]。在之前的研究中我們使用臨床分離的PEDV流行毒株-HB、HNAY、HNXX構建了2日齡仔豬感染PEDV的動物模型，比對了不同毒株的毒力差異^[10]。在本研究中，我們基于之前的動物模型數據，進一步構建了PEDV HB毒株感染2日齡仔豬18h的動物模型。臨床觀察發現仔豬出現典型的PED癥狀，免疫組化染色驗證了感染仔豬的腸絨毛存在大量PEDV抗原，基于仔豬剖檢分析和腸絨毛與腸隱窩比值分析，感染組空腸組織破壞嚴重。選擇18h感染組空腸組織構建文庫，對文庫進行轉錄組測序、生物信息學比對，發現1051個顯著差異基因，其中上調基因為541個，下調基因為510個。

進一步通過GO富集分析后，發現在生物過程聚類的差異基因大部分與免疫應答相關，這與之前的體外PEDV感染細胞轉錄組研究相一致^[4-7]。差異基因顯著富集的炎癥反應過程中IL-6基因有明顯表達（圖5，表2）。在新型冠狀病毒的研究中，炎癥風暴已被認為是引起宿主死亡的關鍵因素^[11]；事實上在SARS-CoV-2的臨床研究中IL-6特異性抗體可以抑制過度的炎癥反應，從而有效治療重癥患者^[12]。那么，IL-6在PEDV導致仔豬急性腸炎和高死亡中發揮何種功能還需要進一步研究。

通過KEGG分析發現差異基因主要聚類到趨化因子受體相互作用通路（Cytokine-cytokine receptor interaction）。趨化因子是免疫系統對抗病原感染的的重要組成部分，主要負責淋巴細胞遷移和炎癥反應^[13]。SARS-CoV感染的患者血清中和死亡患者的表達譜中都能檢測到高表達的趨化因子和炎癥因子^[14]。此外，還有文章報道PEDV可以感染DC細胞，引起相關趨化因子上調^[14]。在本研究中我們也發現PEDV感染的空腸組織中大量趨化因子表達變化，進一步選擇之前報道研究的趨化因子進行RT-qPCR驗證，所得結果和轉錄組結果趨勢一致（圖5，表3）。但是，有趣的是根據之前文章報道，PEDV體外感染DC細胞后CCL25為上調^[15]。而在我們體內研究中CCL25則下調表達（圖5，表3）。CCL25對趨化腸道分泌的IgA，T淋巴細胞遷移、循環和抗原遞呈具有重要作用^[16-17]。人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的恒河猴動物模型中，空腸內CCL25的表達明顯下調，這可能會影響黏膜淋巴細胞回歸，進而影響黏膜細胞的體液免疫功能^[18]。我們推測PEDV感染仔豬腸道內CCL25趨化因子下調可能會影響宿主IgA的趨化和抗原遞呈，從而更有利于病毒在腸道復制。但是，PEDV可以利用抗原遞呈細胞-DC細胞感染宿主多個器官^[15]，CCL25的下調可能會在一定程度上減弱腸道DC細胞的招募和遞呈作用，從而減少病毒對宿主多器官的影響。其次，我們發現差異基因主要還聚類到Toll受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway），冠狀病毒感染宿主后，宿主主要通過Toll受體識別模式識別病毒，激活下游免疫應答^[19-20]。除此之外，差異顯著基因還富集到脂肪消化與吸收（fat digestion and absorption）和高級糖基化終末產物-受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications），這些信號通路主要與脂肪和糖代謝相關。事實上，PEDV感染宿主，造成腸道損傷后，是可以影響空腸黏膜對脂質和葡萄糖的吸收和代謝^[21]；從而進一步加劇宿主死亡。

4 結 論

本研究構建了PEDV感染2日齡仔豬18h動物模型，對感染的空腸組織進行免疫組化分析，可觀察到空腸絨毛明顯脫落、變短，且PEDV主要分布在腸絨毛表面。進一步對感染仔豬空腸進行轉錄組測序及分析顯示：差異表達基因主要富集在免疫應答相關生物學過程，并在趨化因子受體相互作用，Toll受體信號通路等多個經典通路富集。這提示PEDV感染宿主后激活了宿主免疫反應及相關抗病毒信號通路，從而對抗病毒感染。此外，差異顯著基因還主要富集在炎癥應答，脂肪、糖代謝相關通路上，這提示PEDV引起的炎癥風暴和空腸營養代謝紊亂可能是仔豬高死亡率的原因。

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（編輯 白永平）