一株豬CD56單克隆抗體的制備及抗原表位的初步鑒定

摘 要：CD56作為NK細胞的重要表面分子，在NK細胞的發(fā)育、亞群分型和功能發(fā)揮等方面發(fā)揮重要的作用。因此，為了便于篩選不同亞群的豬NK細胞并探究其生物學功能，本研究制備了豬CD56單克隆抗體并對其抗原表位進行了初步鑒定。首先，通過生物信息軟件預測并選取豬CD56蛋白胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位的氨基酸序列（50-499aa），利用原核表達系統(tǒng)表達豬CD56胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位蛋白并進行純化和復性，之后，將豬CD56重組蛋白免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合、亞克隆等試驗，獲得一株穩(wěn)定分泌豬CD56單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1G8。Western blot結(jié)果顯示，制備的豬CD56單抗可以與豬腦和脾總蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；為了進一步驗證CD56單抗的特異性，作者分離了豬外周血NK細胞，以制備的豬CD56單抗作為一抗進行間接免疫熒光試驗，結(jié)果顯示，制備的單抗能夠與NK細胞膜特異性結(jié)合。最后，為了進一步探究單抗識別的抗原表位，作者將選取的豬CD56基因進一步截短為四個截短體（50-192aa、193-294aa、295-397aa、398-499aa）并構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染至293T細胞進行真核表達，Western blot和間接免疫熒光結(jié)果顯示，制備的CD56單抗識別的抗原表位為豬CD56蛋白的193-294aa。綜上，本研究成功制備了豬CD56單克隆抗體，并對其特異性及抗原表位進行了初步鑒定，對豬NK細胞亞群的篩選及探究豬NK細胞的生物學功能具有重要意義。

關鍵詞：豬；NK細胞；CD56；單克隆抗體；抗原表位

中圖分類號：S852.4

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2662-10

收稿日期：2023-07-11

基金項目：福建農(nóng)林大學科技專項創(chuàng)新基金項目（KFb22065XA）

作者簡介：辛航闊（1998-），男，河北石家莊人，碩士生，主要從事基礎獸醫(yī)學研究，E-mail：HK9811@163.com

*通信作者：朱 婷，主要從事動物疾病的基礎病理學研究，E-mail：zhuting@fafu.edu.cn

Preparation of Monoclonal Antibody against Porcine CD56and Preliminary

Identification of Its Epitope

XINHangkuo，XIEQingqing，LIUKun，LINShengyu，CHENWei，

ZHENGXiaohui，ZHUTing^*

（Key Laboratory of Fujian-Taiwan Animal Pathogen Biology，College of Animal Science，

Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou350002，China）

Abstract：As an important surface molecule of NK cells，CD56plays an important role in the development，subgroup typing and function of NK cells.Therefore，in order to facilitate the screening of different subpopulations of porcine NK cells and explore their biological functions，this study prepared porcine CD56monoclonal antibodies and preliminically identified their epitopes.Firstly，the amino acid sequences of the dominant epitope of porcine CD56protein extracellular region（50-499aa）was predicted and selected by bioinformatics software.Then the selected region of CD56was expressed by prokaryotic expression system，and the protein was purified and renaturated.After that，the recombinant protein was immunized to BALB/c mice，and ahybridoma cell line with stable secretion of porcine CD56monoclonal antibody was obtained through cell fusion and subcloning experiments，which was named1G8.Western blot results showed that the prepared porcine CD56monoclonal antibody could bind specifically to the total protein of porcine brain and spleen.To further explore the specificity of CD56monoclonal antibody，NK cells were isolated from porcine peripheral blood，then indirect immunofluorescence assay（IFA）was performed by using the prepared CD56monoclonal antibody as the primary antibody.The results showed that the prepared monoclonal antibody could bind specifically to NK cell membrane.Finally，in order to further investigate the epitopes recognized by monoclonal antibodies，we further truncated the selected porcine CD56gene into four truncations（50aa-192aa，193aa-294aa，295aa-397aa，398aa-499aa），which were insert into eukaryotic expression plasmids.And then these eukaryotic expression recombinant plasmids were transfected into293T cells，respectively.Western blotting and IFA results showed that the epitopes recognized by the prepared CD56monoclonal antibody were193aa-294aa of porcine CD56protein.In this study，porcine CD56monoclonal antibody was successfully prepared，and its specificity and epitopes were preliminically identified，which is of great significance for screening porcine NK cell subsets and exploring the biological function of porcine NK cells

Key words：pig; NK cells; CD56; monoclonal antibody; epitope

*Corresponding author：ZHU Ting，E-mail：zhuting@fafu.edu.cn

自然殺傷細胞（natural killer cells，NK cells）是細胞毒性淋巴細胞^[1]，在機體抵抗病原體感染和異常細胞侵害時發(fā)揮重要作用。NK細胞可以直接釋放顆粒酶和穿孔素特異性地殺傷異常細胞，還可以釋放干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等細胞因子激活其他免疫細胞，發(fā)揮免疫作用^[2-3]。

CD56又稱神經(jīng)細胞黏附分子（nerve cell adhesion molecule，NCAM），在人的神經(jīng)元和NK細胞中普遍表達。作為神經(jīng)細胞黏附分子，CD56是狂犬病病毒（rabies virus，RV）和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染神經(jīng)元的受體^[4-5]，并且，CD56還是治療多種嗜神經(jīng)性腫瘤的靶點^[6-7]。此外，CD56還是NK細胞重要的表面分子，根據(jù)CD56的表達，可將NK細胞分為多種細胞亞群，其中CD56^brightNK細胞和CD56^dimNK細胞是兩種主要的NK細胞亞群^[8]，研究表明，CD56^brightNK細胞和CD56^dimNK細胞在機體免疫防御過程中發(fā)揮不同的作用，其中CD56^brightNK細胞主要通過產(chǎn)生多種細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而CD56^dimNK細胞作為成熟的NK細胞，具有完整且強大的細胞毒性，可直接殺傷異常細胞和病原體^[9]，CD56還參與NK細胞的發(fā)育和功能發(fā)揮，CD56可以促進NK細胞與基質(zhì)細胞間突觸的形成，誘導NK細胞活化^[10]。因此，通過CD56分選出不同的NK細胞對于探究NK細胞的生物學功能至關重要。

盡管人源CD56在NK細胞發(fā)揮生物學功能等多方面中具有重要作用，但是豬源CD56的生物學功能有待探究，為了進一步闡明CD56在豬體內(nèi)的功能和作用，需要一系列的檢測方法。本研究經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達了豬CD56胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位的蛋白，通過雜交瘤技術制備了豬CD56單克隆抗體，并對其特異性、穩(wěn)定性以及抗原表位進行了初步鑒定，這既為探究豬CD56的生物學功能及豬NK細胞的分選奠定了基礎，也為進一步探究豬CD56的生物學功能提供了特異性檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓瘤細胞（sp2/0）、人胚腎細胞（293 T）為福建省畜禽病原感染與免疫學重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞購自上海唯地公司；pET-32a、pEGFP-C1為本實驗室保存；引物由福州易禾基因公司合成；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和HindⅢ、T4連接酶、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑均購自賽默飛世爾科技有限公司、PVDF膜購自Millipore公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；IPTG（異丙基硫半乳糖苷）購自生工生物工程公司；TMB顯色液、ELISA終止液均購自索萊寶公司；HAT/HT、PEG4000購自武漢普諾賽公司；小鼠6×his標簽抗體、山羊抗小鼠IgG（HRP標記、FITC標記）二抗購自Proteintech公司；預染蛋白Marker購自Gene Tech公司；Ni-NTA His-Tag Purification Agarose購自Senhui Microsphere Technology（Suzhou）公司；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；豬外周血NK細胞分離試劑盒購自天津灝洋生物公司。

SPF級BALB/c小鼠購自福州吳氏實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 豬CD56蛋白生物信息預測

通過生物信息軟件DNASTAR Protean和在線網(wǎng)站TMHMM2.0對GenBank收錄的豬CD56蛋白氨基酸序列（登錄號：XP020918471）的抗原表位和蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測，并選取優(yōu)勢抗原表位（即抗原性強）且位于胞外區(qū)的氨基酸序列。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以選取的豬CD56核苷酸序列為參考，引入酶切位點EcoRⅠ、XhoⅠ，設計特異性引物，上游P1：5′-CAGGGACTCCTGTCCAATGCG-3′，下游P2∶5′-CAGGGACTCCTGTCCAATGCG-3′，然后以豬脾cDNA為模板，通過PCR擴增選取的豬CD56基因片段，并將其連接至pET-32a載體，然后對重組質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定。

1.2.3 重組蛋白誘導表達及可溶性分析

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）中誘導表達，培養(yǎng)菌液至OD_600nm為0.8，向其中加入0.2mmol·L^-1IPTG，繼續(xù)于37℃、180r·min^-1誘導表達16h，收集菌體進行超聲破碎，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色后鑒定重組蛋白的表達和可溶性。

1.2.4 重組蛋白融合標簽鑒定及純化

通過上述“1.2.3”中的條件誘導表達重組蛋白，以6×his標簽抗體為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)Western blot驗證重組蛋白的his標簽。重組蛋白經(jīng)Ni-NTA鎳柱進行親和層析純化，并通過SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色后鑒定蛋白純度，之后對純化后的蛋白進行透析復性并運用BSA試劑盒測定蛋白濃度，測定后分裝，置于-80℃保存。

1.2.5 動物免疫

將豬CD56胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位蛋白按照80μg·只^-1的劑量與弗氏完全佐劑1∶1乳化，背部皮下注射BALB/c小鼠，2周后，將豬CD56重組蛋白按照80μg·只^-1的劑量與弗氏不完全佐劑1∶1乳化后，連續(xù)免疫小鼠2次，每次間隔2周，第3次免疫后7～10d后，尾部靜脈采血，運用間接ELISA方法測定抗體效價，選取抗體效價高的小鼠進行加強免疫。

1.2.6 間接ELISA檢測方法的建立

采用方陣滴定法建立豬CD56胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位蛋白的間接ELISA方法。將不同濃度（1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000）的重組蛋白包被于96孔酶標板，以不同濃度（1∶1×10⁴、1∶1×10⁵、1∶2×10⁵）的小鼠血清作為一抗，并設陰性對照，37℃孵育1h，加入單組分TMB顯色液，顯色15min，加入終止液終止反應，于酶標儀讀取各孔OD_450nm值，選定抗原最佳包被濃度。

1.2.7 細胞融合及陽性雜交瘤細胞篩選

采集加強免疫后的BALB/c小鼠脾細胞，將其與sp2/0細胞通過50%的PEG4000進行細胞融合。融合后以建立的間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，對篩選后的陽性雜交瘤細胞進行3次亞克隆后，當單克隆細胞孔的陽性率達到100%，此細胞孔中的雜交瘤細胞即可認定為能夠穩(wěn)定分泌單一抗體的雜交瘤細胞株。

1.2.8 雜交瘤細胞染色體鑒定

于生長至對數(shù)期的陽性雜交瘤細胞中，加入200μL4mg·mL^-1的秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，收集細胞低滲處理后，加入50μL固定液重懸細胞，吉姆薩染色10～15min，染色后于顯微鏡下觀察細胞染色體并計數(shù)拍照。

1.2.9 Western blot檢測

分別抽提豬腦組織和脾組織全蛋白，進行Western blot驗證。以豬CD56單克隆抗體（1∶500）為一抗，4℃孵育過夜，PBST洗滌后，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶5000），孵育1h，PBST洗滌后，加入化學發(fā)光液顯色。

1.2.10 豬外周血NK細胞分離

采集新鮮的豬外周血，使用豬外周血NK細胞試劑盒分離原代豬NK細胞。向離心管中加入分離液和抗凝血，3000r·min^-1離心30min，吸取NK細胞層，加入5mL清洗液，1250r·min^-1離心10min，重復2次，加入500μL清洗液，4℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.11 間接免疫熒光（IFA）檢測

豬原代NK細胞以及豬巨噬細胞（macrophages，M?）經(jīng)固定、封閉后，加入豬CD56單克隆抗體（1∶500），37℃孵育1h，PBS清洗后，加入FITC標記的山羊抗鼠IgG（1∶50），37℃孵育1h，PBS清洗后，加入抗熒光淬滅劑封片，置于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.2.12 單克隆抗體抗原表位初步鑒定

將選取的豬CD56氨基酸序列依次截短，設計特異性引物（表1），并連接至pEGFP-載體，分別命名為Δ1、Δ2、Δ3、Δ4。將構(gòu)建成功的截短體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293 T細胞，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并以豬CD56單克隆抗體為一抗，通過Western blot鑒定豬CD56單克隆抗體識別的抗原表位區(qū)域。

1.2.13 腹水單克隆抗體制備及效價測定

選取8～10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.3mL，注射3d后，每只小鼠腹腔注射1×10⁶個陽性雜交瘤細胞，10～14d后，小鼠腹部隆起、行動不便時，采集腹水，通過建立的間接ELISA方法測定腹水抗體效價。

2 結(jié) 果

2.1 豬CD56蛋白生物信息預測

通過在線網(wǎng)站TMHMM和生物信息軟件DNAStar中的protean對豬CD56蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和抗原表位進行預測，選取了處于胞外區(qū)且具有優(yōu)勢抗原表位的50-499aa（圖1A、B）進行后續(xù)試驗。

2.2 豬CD56基因擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以豬脾cDNA為模板擴增豬CD56基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到大小約1347bp的目的條帶，與預期大小相符（圖2A），連接至pET-32a載體，通過EcoRⅠ、XhoⅠ進行雙酶切驗證，酶切得到與預期大小相符的兩個條帶（圖2B），送北京擎科生物公司測序，測序正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并命名為pET-32a-CD56。

2.3 豬CD56重組蛋白誘導表達及可溶性分析

于37℃，180r·min^-1，0.2mmol·L^-1IPTG的條件下誘導表達豬CD56重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，進行考馬斯亮藍染色分析，重組蛋白成功表達，條帶大小約70ku（圖3A），并且重組蛋白以包涵體的形式存在（圖3B）。

2.4 豬CD56重組蛋白His標簽驗證及純化

以6×His標簽抗體為一抗，通過Western blot檢測誘導表達的蛋白，結(jié)果顯示，豬CD56重組蛋白能與6×His標簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應（圖4A）。隨后，使用Ni-NTA柱純化豬CD56重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后分析，得到純度較高的豬CD56蛋白（圖4B），并對重組蛋白復性、濃縮后測定濃度，測定濃度為1.25mg·mL^-1，分裝后于-80℃留存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 豬CD56重組蛋白最佳包被濃度確定

以陽性血清/陰性血清（P/N）的OD_450nm＞2.1，且陽性血清OD_450nm接近于1時（陰性血清OD_450nm＜0.1）的蛋白包被濃度為蛋白最佳包被濃度。測定結(jié)果顯示當?shù)鞍诐舛葹?.25μg（1∶4000），血清稀釋度為2×10⁵時，陽性血清OD_450nm為1.0783，陰性血清OD_450nm為0.0480，且陽性血清/陰性血清（P/N）的OD_450nm＞2.1，所以選定蛋白的最佳包被濃度為0.25μg·mL^-1。

2.6 陽性雜交瘤細胞的篩選

小鼠加強免疫后，取小鼠脾細胞與sp2/0細胞進行細胞融合，7～10d后，待雜交瘤細胞克隆團大小生長至50～80個時，運用建立的間接ELISA方法篩選到陽性雜交瘤細胞，經(jīng)3次亞克隆篩選到1株穩(wěn)定分泌CD56單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為1G8。

2.7 單克隆抗體的特異性鑒定

2.7.1 Western blot鑒定

研究表明，CD56在人的神經(jīng)元和NK細胞中普遍表達。本研究分別抽提不同豬的腦組織和脾臟全蛋白，并將其作為抗原，以制備的豬CD56單克隆抗體為一抗，通過Western blot檢測單克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，豬CD56單克隆抗體可以與豬腦組織和豬脾總蛋白特異性結(jié)合（圖5）。

2.7.2 間接免疫熒光（IFA）鑒定

為了進一步驗證CD56單克隆抗體的特異性，豬NK細胞（圖6A）與豬M?經(jīng)固定和封閉后，分別以制備的豬CD56單克隆抗體（CD56mAb）為一抗，通過IFA試驗鑒定單克隆抗體的特異性。結(jié)果如圖所示，CD56mAb可以與豬NK細胞上的CD56蛋白特異性結(jié)合，顯示綠色熒光（圖6B），且熒光信號主要集中于NK細胞膜上（圖6C）。然而，制備的單抗并不能與豬巨噬細胞結(jié)合，無熒光信號（圖6D～F）。

2.8 腹水單克隆抗體效價測定

收集陽性雜交瘤細胞，腹腔注射預先致敏的BALB/c小鼠，制備小鼠腹水抗體，通過建立的間接ELISA方法對制備的豬CD56腹水抗體效價進行測定，結(jié)果如圖7所示，1G8腹水抗體效價達到1∶51200。

2.9 豬CD56單克隆抗體抗原表位初步鑒定

根據(jù)豬CD56蛋白預測結(jié)果，將選取的豬CD56氨基酸序列進行截短（圖8A），分別設計四條豬CD56（50-499aa）截短片段的引物（表1），以豬脾cDNA為模板，進行PCR擴增，結(jié)果如圖8所示，PCR擴增到的條帶與預期大小一致（圖8B），將構(gòu)建成功的豬CD56截短體分別轉(zhuǎn)染至293 T細胞中進行真核表達，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果良好（圖8C），收集細胞全蛋白，以制備的豬CD56單克隆抗體為一抗，Western blotting檢測結(jié)果表明，豬CD56單克隆抗體識別的抗原表位為Δ2（193-294aa）（圖8D）。IFA檢測結(jié)果顯示，制備的CD56單抗能夠識別EGFP-Δ2融合蛋白（圖8E）。

3 討 論

NK細胞是細胞毒性淋巴細胞，參與機體的抗病毒和抗腫瘤免疫。NK細胞表達多種表面受體，通過這些受體NK細胞能夠特異性地識別異常細胞而發(fā)揮其殺傷作用。研究表明，豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染能夠激活NK細胞^[11]，病毒蛋白gD和US3通過阻止NK細胞受體DNAM-1和靶細胞CD300a的結(jié)合，從而抑制NK細胞介導的靶細胞的裂解^[12-13]。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）等多種皰疹病毒可以通過自身蛋白下調(diào)NK細胞激活受體的相關配體，降低NK細胞活性和抑制其殺傷靶細胞的能力^[14-15]。NK細胞還可以通過血凝素（HA）和NKp44/NKp46之間的相互作用有效地限制流感病毒（influenza virus，IV）的復制和傳播^[16]。以上結(jié)果表明，NK細胞在機體抵抗病毒感染過程中發(fā)揮重要的作用。

CD56^bright和CD56^dimNK細胞是NK細胞兩種主要的細胞亞群^[9，17]。CD56^brightNK細胞亞群是細胞因子的主要生產(chǎn)者，在丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）感染過程中，CD56^birghtNK細胞亞群數(shù)量明顯增加，從而產(chǎn)生更多的干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）以發(fā)揮抗病毒作用^[18]。CD56^dimNK細胞亞群作為更加成熟的NK細胞，具有更強的細胞毒性，乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）的ILT2蛋白的表達能夠阻止CD56^dimNK細胞的細胞毒性，而抑制ILT2的表達后，CD56^dimNK細胞的功能得以恢復，表明CD56^dimNK細胞可能對于治療HBV至關重要^[19-20]。除了作為細胞表面分子，CD56還積極參與NK細胞的發(fā)育和功能發(fā)揮，NK細胞可以通過CD56與CD62 L形成的免疫突觸與基質(zhì)細胞結(jié)合，從而促進NK細胞的成熟與運動^[21-22]；CD56還可以通過Pyk2調(diào)節(jié)NK細胞毒性^[23]。此外，CD56作為一種神經(jīng)黏附分子，還是RV等多種嗜神經(jīng)性病毒感染宿主的受體^[24-25]。雖然人源CD56蛋白的研究已十分成熟，且生物學功能被廣泛揭示，但豬源CD56蛋白的功能尚不明確。因此，本研究通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得豬CD56重組蛋白，經(jīng)動物免疫、細胞融合與篩選，制備了豬CD56單克隆抗體，為豬CD56蛋白的研究提供了基礎。

本研究前期選用的免疫原為重組CD56蛋白，其空間構(gòu)象與天然CD56蛋白存在差異，這可能導致制備的單克隆抗體親和力低，無法識別天然蛋白，經(jīng)Western blot和IFA鑒定，結(jié)果表明豬CD56單克隆抗體可以特異性地識別豬天然CD56蛋白。并且，豬CD56單克隆抗體主要與豬NK細胞的細胞膜結(jié)合，表明豬CD56蛋白主要表達于NK細胞膜上，這與人源CD56蛋白類似，而豬CD56蛋白是否具有類似于人CD56蛋白的生物學功能，仍需進一步研究。蛋白質(zhì)抗原表位的鑒定是研究抗原的結(jié)構(gòu)與功能、抗原與抗體反應機制的基礎^[26]，本研究初步鑒定出所制備的單克隆抗體識別的抗原表位位于豬CD56蛋白的193aa-294aa之間，這為進一步探究豬CD56蛋白結(jié)構(gòu)和生物學功能奠定了基礎。

4 結(jié) 論

本研究成功表達了豬CD56胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位的蛋白，并制備了針對該蛋白的單克隆抗體，對其進行了特異性及抗原表位的鑒定，為進一步探究豬NK細胞表面分子CD56的生物學功能及NK細胞的亞型篩選提供了研究基礎。

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（編輯 白永平）