模擬胃液結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用研究紫蘇對(duì)內(nèi)源性亞硝胺的阻斷作用

摘 要：為研究蔬菜對(duì)亞硝胺的阻斷效果，在模擬胃液環(huán)境下結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用，研究紫蘇提取液對(duì)內(nèi)源性亞硝胺的阻斷作用。結(jié)果表明，在模擬胃液環(huán)境下加入紫蘇液與亞硝酸鈉，亞硝酸鈉清除率可達(dá)10.4%。加入紫蘇液、亞硝酸鈉和二乙胺進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)，空白樣品和添加紫蘇的樣品中二乙基亞硝胺生成量分別為0.2、0.1 ng/mL，抑制率達(dá)到50%。添加紫蘇的膳食中N-亞硝基二甲基（NDMA）、N-亞硝基二乙基（NDEA）、N-亞硝基二丁基（NDBA）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR）含量顯著降低。NDMA、NDEA在空白膳食中含量均為0.2 ng/g，紫蘇試驗(yàn)組均未檢出。NDBA空白對(duì)照為0.4 ng/g，紫蘇試驗(yàn)組為0.2 ng/g，抑制率為50%；NPYR空白對(duì)照為8.6 ng/g，紫蘇試驗(yàn)組為4.9 ng/g，抑制率為43%。因此，紫蘇對(duì)內(nèi)源性亞硝胺有明顯的阻斷作用。

關(guān)鍵詞：亞硝胺；紫蘇；模擬胃液；液質(zhì)聯(lián)用；亞硝酸鈉

中圖分類號(hào)：TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2024）04-0020-04

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.04.005

Effect of Perilla in Blocking Endogenous Nitrosamines by Simulated Gastric Fluid Combined with Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

YU Fengxiang1， CHEN Xu2*， CHEN Zuwu2， ZENG Sijing3

（1. Hunan Biological Electromechanical Polytechnic， Changsha 410127， China; 2. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3. Longhui Market Supervision and Management Inspection and Testing Center， Shaoyang 422299， China）

Abstract： In order to study the blocking effect of vegetables on nitrosamines， the inhibitory effect of perilla extract on endogenous nitrosamines was studied by combining liquid chromatography-mass spectrometry in a simulated gastric fluid environment. The results indicated that under simulated gastric fluid environment， perilla solution and sodium nitrite were added in simulated gastric juice environment， the sodium nitrite clearance rate could reach 10.4%. Perilla solution， sodium nitrite and diethylamine were added， LC-MS/MS was performed to detect the diethylnitrosamine production of blank sample and perilla added sample at a certain concentration were 0.2 ng/mL and 0.1 ng/mL， and the inhibition rate was 50%. NDMA， NDEA， NDBA and NPYR were significantly decreased in the diet supplemented with perilla. NDMA and NDEA were detected at 0.2 ng/g in the blank diet， but were not detected in the experimental group supplemented with perilla. NDBA blank control was 0.4 ng/g， the experimental group supplemented with perilla was 0.2 ng/g， the inhibition rate was 50%， NPYR blank control was 8.6 ng/g， the experimental group supplemented with perilla was 4.9 ng/g， the inhibition rate was 43%， to provide reference for studying the blocking mechanism of perilla on nitrosamine. Therefore， perilla had a significant blocking effect on endogenous nitrosamines.

Keywords： Nitrosamine; perilla; simulated gastric fluid; liquid chromatography-mass spectrometry; sodium nitrite

亞硝胺除具有致癌作用[1-2]外，還具有致畸、致突變、神經(jīng)損害等毒性[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的亞硝胺類物質(zhì)有二甲基亞硝胺（NDMA）、甲基乙基亞硝胺（NMEA）、二乙基亞硝胺（NDEA）、二丙基亞硝胺（NDPA）、二丁基亞硝胺（NDBA）、亞硝基吡咯烷（NPYR）、亞硝基嗎啉（NMOR）、亞硝基哌啶（NPIP）等[4]，其中NDEA、NDMA被列為2A類致癌物。亞硝胺分為外源性和內(nèi)源性，前者來(lái)自富含N-亞硝基化合物的食物，如火腿、香腸、其他肉類腌制品等，后者在體內(nèi)合成。外源性亞硝胺可通過(guò)體外抑制，即通過(guò)檢測(cè)技術(shù)將其排除，避免入口。各國(guó)對(duì)食品中的亞硝胺含量均有限制，我國(guó)對(duì)肉及肉制品、水產(chǎn)動(dòng)物及其制品的限量規(guī)定為3 μg/kg和4 μg/kg。內(nèi)源性亞硝胺是由亞硝酸鹽與胺類在胃液酸性條件下合成，機(jī)制較為復(fù)雜，難以控制。我國(guó)火腿腸等產(chǎn)品中明確規(guī)定亞硝酸鹽限量為30 mg/kg。據(jù)FAO/WHO規(guī)定，亞硝酸鈉每日允許攝入量（ADI）為0～0.2 mg/kg·bw[5]。但亞硝酸鹽來(lái)源較多，如家庭自制鹽濃度低的醬菜等。人體亞硝酸鹽可來(lái)自食物本身的NO2-或硝酸鹽還原，因此減少硝酸鹽、亞硝酸鹽的攝入，阻斷亞硝酸鹽與胺類物質(zhì)的反應(yīng)均可以達(dá)到阻斷亞硝胺的目的。目前已知維生素C[6-7]、生育酚[8-10]、花色苷[11-12]、多酚類物質(zhì)[13-14]等均具有抗氧化、阻斷亞硝胺的作用。

紫蘇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、神經(jīng)保護(hù)、胃腸保護(hù)、擴(kuò)張血管、降血糖和降血脂等多種藥理作用[15-16]，是典型的藥食同源植物[17]，并且富含花色苷、黃酮等活性物質(zhì)[18]，在我國(guó)資源豐富且成本低[19]。紫蘇常用作某些地區(qū)民間的蔬菜腌制品加工配料，具有抑制醋酸菌等雜菌生長(zhǎng)的作用，有關(guān)紫蘇對(duì)亞硝胺的阻斷研究報(bào)道較少，因此本研究在模擬胃液環(huán)境下結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用，探尋紫蘇對(duì)亞硝胺的阻斷作用，為蔬菜腌制品加工、膳食指南提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）、食用酒精（95%）、甲醇（色譜純）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液5 μg/mL、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。模擬胃液：pH 1.5±0.1，廣州臻萃質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)有限公司。亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品：NDEA（N-亞硝基二乙基胺），NDMA（N-亞硝基二甲基胺），NPIP（N-亞硝基哌啶），NMPhA（N-亞硝基-N- 甲基苯胺），NMEA（N-亞硝基甲基乙基胺），NDPhA（N-亞硝基二苯基胺），NEPhA（N-亞硝基-N- 乙基苯胺），NPYR（N-亞硝基吡咯烷），NDPA（N-亞硝基二丙基胺），NMOR（N-亞硝基嗎啉），NDBA（N-亞硝基二丁基胺），NDBzA（N-亞硝基二芐胺），美國(guó)o2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1290 InfinityⅡ/G6470A液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS），Z0RBAXSB-CN色譜柱，21 mm×100 mm，1.8 μm；UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；旋渦儀，合肥艾本森Mixplus；KQ-300DE超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；GRX9123A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；w601粉碎機(jī)，利仁電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇液的制備

新鮮紫蘇65 ℃鼓風(fēng)干燥4 h，粉碎機(jī)粉碎，稱取50 g紫蘇粉，加入400 mL超純水，超聲0.5 h，定容至500 mL，加入4 g活性炭過(guò)濾，濾液備用。

1.3.2 模擬胃液條件下紫蘇對(duì)亞硝酸鈉清除率的測(cè)定

取10 mL模擬胃液加入25 mL比色管中，按梯度加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL紫蘇液，再加入亞硝酸鈉標(biāo)液2 mL（5 μg/mL），定容至25 mL，37 ℃水浴120 min，按格里斯試劑法檢測(cè)亞硝酸鈉的含量。

1.3.3 模擬胃液條件下紫蘇對(duì)亞硝胺的阻斷率檢測(cè)

取10 mL模擬胃液加入25 mL比色管中，按梯度加入紫蘇液1～10 mL（編號(hào)為Z1～Z10），以Z11為對(duì)照（紫蘇液添加量為0），依次加入二乙胺溶液1 mL（1 mmol/L）、NaNO2溶液1 mL（1 mmol/L），稀釋至刻度，37 ℃保溫120 min。用0.45 μm水性濾膜微濾，上機(jī)檢測(cè)二乙基亞硝胺的含量，計(jì)算抑制率。

1.3.4 紫蘇對(duì)膳食亞硝胺的阻斷率檢測(cè)

按重體力勞動(dòng)成年男子一日膳食需要量進(jìn)行設(shè)計(jì)，適當(dāng)增加蛋白質(zhì)和富含亞硝酸鹽的腌菜。試驗(yàn)組按10%加入新鮮紫蘇，勻漿后加入樣品一倍的胃液，混勻。37 ℃水浴保溫120 min。稱取樣品1.000 0±0.050 0 g，加入2 mL甲醇，渦旋30 s，靜置2 min分層，取上層溶液過(guò)濾膜，上機(jī)測(cè)試。液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)亞硝胺種類和含量。

1.4 亞硝胺的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件

LC-MS：進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，流動(dòng)相 A：5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲醇水溶液，流動(dòng)相 B：甲醇，梯度洗脫程序?yàn)槌跏剂鲃?dòng)相A 90%，5.0～8.0 min A 5%，8.0～10.0 min A 90%。MS條件：NDEA，母離子103.1，子離子47.2，碎裂電壓80 V，碰撞能量18 V，保留時(shí)間1.7 min，離子源APCI。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬胃液條件下紫蘇提取液對(duì)亞硝酸鈉的清除效果

由表1可知，在1～5 mL內(nèi)隨著紫蘇提取液的增加，亞硝酸鈉的清除率逐漸上升，添加5 mL時(shí)，對(duì)亞硝酸鈉的抑制率為10.4%，但紫蘇液繼續(xù)增加，清除率不升反降，而且規(guī)律不明顯，因此這里只保留了1～5 mL。由于紫蘇液富含花青素，本身具有顏色，比色時(shí)會(huì)有干擾，因此本試驗(yàn)使用活性炭進(jìn)行脫色，但濃度太高時(shí)，脫色不能達(dá)到100%的效果，因此試驗(yàn)過(guò)程每個(gè)添加量下設(shè)置空白，紫蘇本身含有的多種抗氧化物質(zhì)如維生素C、花色苷等有助于清除亞硝酸鈉，在脫色過(guò)程中，花色苷隨之減少，研究表明花色苷對(duì)亞硝酸鈉具有清除作用，因此脫色后的花色苷清除力減弱，試驗(yàn)條件下，紫蘇提取液對(duì)亞硝酸鈉具有清除效果，其清除率受提取液制備方法等的影響會(huì)有所不同。

表1 紫蘇提取液對(duì)亞硝酸鈉的清除率

Table 1 Clearance rate of sodium nitrite by perilla extract

2.2 模擬胃液條件下紫蘇提取液對(duì)亞硝胺的阻斷效果

由表2可知，紫蘇液加入量1 mL時(shí)，對(duì)亞硝胺的抑制率為0，有學(xué)者研究草莓、大蒜汁、甘藍(lán)在模擬胃液條件下對(duì)NDMA的阻斷作用，當(dāng)大蒜汁添加量低時(shí)，甚至還有促進(jìn)NDMA生成的作用[4]。表2顯示空白樣品亞硝胺生成量為0.2 ng/mL，而添加2～10 mL紫蘇液的樣品為0.1 ng/mL，抑制率50%。

表2 模擬胃液條件下紫蘇對(duì)亞硝胺的抑制率

Table 2 Inhibition rate of perilla on nitrosamines under simulated gastric fluid condition

注：“—”表示對(duì)照。

2.3 紫蘇對(duì)模擬膳食亞硝胺的阻斷效果

由表3可知，添加紫蘇后的膳食中主要亞硝胺NDMA、NDEA、NDBA、NPYR有變化。NDMA、NDEA在空白膳食中檢測(cè)量均為0.2 ng/g，添加紫蘇的試驗(yàn)組均未檢出。NDBA空白對(duì)照為0.4 ng/g，添加10%紫蘇的試驗(yàn)組為0.2 ng/g，抑制率50%，NPYR空白對(duì)照為8.6 ng/g，添加10%紫蘇的試驗(yàn)組為4.9 ng/g，抑制率達(dá)到43%。

表3 膳食中紫蘇對(duì)內(nèi)源性亞硝胺的抑制率

Table 3 Inhibitory rate of perilla on endogenous nitrosamines in diet

3 結(jié)論

試驗(yàn)條件下，紫蘇對(duì)亞硝酸鹽具有清除效果，模擬胃液環(huán)境下清除率可達(dá)10.4%。液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)二乙基亞硝胺抑制率可達(dá)50%。添加紫蘇的膳食中NDMA、NDEA、NDBA、NPYR含量降低。

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收稿日期：2023-11-08

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（2023JJ60229）

第一作者簡(jiǎn)介：喻鳳香（1981—），女，教授，博士，主要從事食品加工及檢測(cè)工作

*通信作者簡(jiǎn)介：陳煦（1977—），男，助理研究員，碩士，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)研究工作